丹参酮ⅡA改善脓毒症大鼠脑组织损伤和凋亡的实验研究

丹参酮ⅡA改善脓毒症大鼠脑组织损伤和凋亡的实验研究
刘芳;冯俊;周文秀;杨俊
【摘要】目的探讨丹参酮ⅡA改善脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的作用及可能的机制.方法采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型(CLP),给予丹参酮ⅡA腹
腔注射处理.分析治疗6～24 h后脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素(IL)-1β、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的水平、病理学变化、细胞凋亡率、促凋亡基因Bax、Fas、P53和Caspase-3和抑制凋亡基因Bcl-2的表达情况.结果 (1)脓毒症大鼠中TNF-α和IL-1β水平显著升高(P＜ 0.05),并随着炎症反应的持续呈逐
渐上升趋势(P＜0.05),而丹参酮ⅡA可以抑制脓毒症大鼠脑组织中TNF-α和IL-1β水平的升高(P＜0.05);(2)脓毒症大鼠中MDA水平明显升高(P＜0.05),SOD水平显著降低(P＜0.05),随着炎症反应的持续呈逐渐恶化趋势(P＜0.05);丹参酮ⅡA干预后,MDA和SOD的异常水平显著改善(P＜0.05);(3)脓毒症组大鼠造模后6h脑组
织已出现病理学的异常改变,并随着炎症反应的持续呈逐渐加重趋势,细胞凋亡指数
显著高于假手术组(P＜0.05);给予丹参酮ⅡA处理之后,病理学的异常改变得到明显的改善,凋亡指数显著降低(P＜0.05);(4)Bcl-2的蛋白和mRNA表达水平下降(P＜0.05),随着炎症反应的持续呈逐渐下降趋势(P＜0.05);p53、Bax、Fas和Caspases-3蛋白和mRNA表达水平升高(P＜0.05),并随着炎症反应的持续呈逐渐上升趋势(P＜0.05);丹参酮ⅡA干预可以使上述蛋白和mRNA的异常表达水平部
分恢复(P＜0.05).结论丹参酮ⅡA具有改善脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的作用,可能机制是通过其抗炎(TNF-α、IL-1β)、抗氧化(MDA、SOD)的作用,并调控凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、p53、Fas、Caspase-3)的表达来实现.
【期刊名称】《中国中医急症》
【年(卷),期】2015(024)002
【总页数】5页(P242-246)
【关键词】丹参酮ⅡA;脓毒症;脑损伤;凋亡
【作者】刘芳;冯俊;周文秀;杨俊
【作者单位】湖北省武汉市第十一医院,湖北武汉430030;华中科技大学同济医学
院附属同济医院,湖北武汉430030;湖北省武汉市第十一医院,湖北武汉430030;湖
北省武汉市第十一医院,湖北武汉430030
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
脓毒症是一种由炎性、氧化等多种因子参与的严重的全身性炎症反应，可导致脑组织神经元细胞的损伤、凋亡以及功能异常等；脑组织细胞凋亡是脑组织炎症反应的主要病理过程，与不可逆细胞坏死不同，神经细胞凋亡可能通过早期干预而加以挽救［1-2］。

因此，防止脑组织炎症反应诱导的神经细胞凋亡的发生，对于保护脑功能具有重要意义。

丹参酮ⅡA是传统中药丹参的主要成分，研究表明其具有抗炎、清除自由基以及增强抗氧化活性等功效，对多种心脑血管疾病具有保护作用［3-5］。

但目前对其是否可改善脓毒症脑组织的细胞凋亡及其具体机制研究较少；本实验采用盲肠结扎穿孔手术建立脓毒症大鼠模型，观察丹参酮ⅡA预处理对脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的影响，探讨丹参酮ⅡA对脓毒症脑损伤的保护机制。

1.1 动物、药物及试剂
SPF级雄性Sprague Dawley大鼠54只，体质量280～300 g（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供），丹参酮ⅡA磺酸钠注射液（诺新康，2 mL∶10
mg；上海第一生化药业有限公司，国药准字H31022558），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素（IL）-1β Elisa试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝塞生物技术有限公司。

蛋白抗体购于Cell Signaling Technolgy公司。

PCR引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成；其余试剂为国产分析纯（武汉康盛医药科技有限公司）。

1.2 实验分组
根据实验设计随机分为3组：假手术组（Sham组）、脓毒症组（CLP组）、脓毒症+丹参酮ⅡA治疗组（CLP+TanⅡA组），每组18只；CLP+TanⅡA组术后于腹腔注射40 mg/d的丹参酮ⅡA磺酸钠注射液，其余两组均给予0.9%氯化钠注射液对照；3组大鼠均于同一环境下饲养。

模型制成后，每组分别于6、12、24 h断头处死，取脑组织进行实验指标检测。

1.3 方法
1.3.1 模型制作采用盲肠结扎穿孔手术（CLP）制作脓毒症模型；3组大鼠均在术前禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/kg），充分麻醉后置于仰位，消毒腹部皮肤，于中下腹部做3 cm纵切，打开腹腔，通过钝性分离及游离操作，充分暴露盲肠，仅CLP组和CLP+ TanⅡA组于距盲肠末端1 cm处采用3号缝合线环形结扎，保证肠道通畅，并据结扎处5 mm位置采用9号针头贯穿盲肠2次，并轻挤压确保粪便溢出，并进行后续的关闭腹腔手术。

Sham组仅做盲肠探查术。

1.3.2 大鼠脑组织中 TNF-α、IL-1β、MDA含量及SOD活性的测定取脑组织制备组织匀浆，取上清液备用。

酶联免疫吸附法测定TNF-α、IL-1β的含量，羟胺法测定SOD活性，硫代巴比妥酸法测定MDA含量，操作步骤按相关试剂盒说明书进行。

1.3.3 HE染色光镜检查常规石蜡切片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱苯，Harris苏木
精染核，0.1 mol/L盐酸乙醇返蓝，至水洗，入0.1 mol/L伊红水溶液染色，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后封片镜检。

1.3.4 透视电镜检查将每个大脑冠状切片再进一步分成大小为1 mm×1 mm×2 mm的4～5块，经
2.5%戊二醛及1%锇酸双重固定后，丙酮逐级脱水，树脂包埋，做超薄切片，厚度为50 nm，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，JEM 1200-EX
型透视电镜观察并拍照。

1.3.5 细胞凋亡检测细胞凋亡检测采用原位缺口末端标记法（TUNEL法），具体
操作严格按照细胞凋亡检测试剂盒说明书进行。

凋亡的细胞核被染成棕黄色，未凋亡的细胞核为深蓝色。

高倍镜下每张切片随机选取10个视野，计数凋亡阳性细胞，以凋亡指数（AI）反映各组心肌凋亡的情况，AI=（视野内凋亡细胞个数/视野内
所有心肌细胞个数）×100%。

1.3.6 促凋亡基因Bax、p53、Fas和Caspase-3、抑制凋亡基因 Bcl-2的蛋白水
平检测采用 Western blot法。

具体步骤见Zhu等［10］的报道，简述如下：待提取好的将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸后，进行10% SDS-PAGE电泳，采用半干转进行蛋白转膜，根据要求分别加入Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2的一抗孵育过夜，待完成二抗孵育后进行ECL显示处理，将数据进行Gel-Pro analyzer分析光密度，最终结果以Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2和β-actin的光密度比值表示。

1.3.7 促凋亡基因Bax、p53、Fas和Caspase-3、抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA 水平检测采用RT-PCR检测。

具体方法参见Alaaeddine等［11］的报道，采用
ΔΔCt法分析Bax、p53、Fas、Caspase-3、Bcl-2的扩增效果，并与β-actin做
标准化处理，结果均以2-ΔΔCt来表示。

Bax：引物1（forward）5′-CCAAGAAGCTGAGCGA GTGTCTC-3′；引物2（reverse）5′-AGTTGCCATCAGCA AACATGTCA-3′。

Caspase-3：引物1
（forward）5′-TACC CTGAAATGGGCTTGTGT-3′；引物2（reverse）5′-GTTAACACGAGTGAGGATGTG-3′。

Bcl-2：引物1（forward）5′-TTCAGAGACAGCCAGGAGAAATC-3′；引物2（reverse）5′-CAGGATGCGTCCACCAAGAAGCTG-3′。

P53：引物1（forward）5′-GTGGCCTCTGTCATCTT CCG -3′；引物2（reverse）5′-CCGTCACCATCAGAGCA ACG -3′。

扩增产物长度291 bp。

Fas：引物1（forward）5′-CCAAATGCAGAAGATGATTGTGTG-3′；引物2（reverse）：5′-TGCCACTGTTCAGGATTTAAAGGTTG-3′。

扩增产物长度258 bps。

β-actin：引物1（forward）5′-TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG-3′；引物2（reverse）5′-TAGAGCCACCAATCCACACA-3′。

1.4 统计学处理
应用SPSS16.0统计软件。

各指标均以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用为SNK法。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 大鼠心肌组织中炎性、氧化因子水平
见表1。

与Sham组6、12、24 h 3个时间点比较，脓毒症组大鼠心肌组织中6、12、24 h对应时间点测得的TNF-α、IL-1β和MDA含量升高，SOD活性降低（P＜0.05），且呈时间依赖性，丹参酮ⅡA可改善脓毒症导致的心肌组织TNF-α、IL-1β、MDA含量和SOD活性的异常改变（P＜0.05）。

2.2 脑组织HE染色
Sham组脑组织结构完整，胞核、胞浆染色均匀，无明显异常改变（图A～C）。

脓毒症组于术后6 h处死时，HE染色可见神经元及细胞间隙发生水肿，组织结构疏松，少量的炎症细胞浸润（图D）。

术后12 h可见神经元胞体明显肿胀，少量胶质细胞增生，炎症细胞浸润明显，病灶周围组织疏松水肿，细胞间隙增宽（图E）。

术后24 h可见脑组织高度水肿，液化坏死，大量炎症细胞浸润，神经元明
显变性坏死，核结构模糊，胶质细胞增生（图F）。

与CLP组比较，丹参酮ⅡA 干预后神经细胞也可见水肿，但细胞层次较清楚，排列较紧密，细胞结构较完整，神经细胞肿胀、变性明显减轻（图G～I）。

2.3 脑组织电镜
Sham组脑组织神经细胞核大而圆，染色质均匀分布，核仁明显，核膜完整清晰，胞质内见高尔基器分布于核周，粗面内质网、线粒体散在分布，表面附着核糖体，线粒体呈圆形、椭圆形，内嵴清晰可见，基质均匀（图A～C）。

CLP组术后6 h 细胞皱缩变小，核固缩呈不规则形状，核内染色质分布欠均匀，形成染色质块，分布于核膜周边部，电子密度高于正常，核仁消失，核膜完整（图D）；术后12 h 核膜尚完整，染色质更加致密、均质无结构，电子密度更高（图E）；术后24 h 细胞染色质凝聚、移动，分布于核周，进而裂解成几个碎片，出现各种形态，如花瓣状、马蹄形等（图F）。

与CLP组比较，丹参酮ⅡA干预后，细胞核结构尚完整，核膜结构尚清晰，染色质轻度浓缩边集化；内膜系统部分扩张或成空泡状，部分线粒体水肿，嵴排列紊乱，有的空泡化（图G-I）。

2.4 脑组织细胞凋亡
光镜下Sham组6～24 h模型中少见凋亡细胞（图A～C）。

CLP组可见较大量凋亡细胞（细胞核内可见棕黄色颗粒，图G～I），较Sham组明显增多，细胞凋亡指数显著高于Sham组（P＜0.05，图J）；给予丹参酮ⅡA处理之后，凋亡细胞较CLP组明显减少（图D～F），凋亡指数显著降低（P＜0.05，图J），但仍高于Sham组大鼠（P＜0.05，图J）。

2.5 3组凋亡相关基因蛋白水平比较
与Sham组相比，CLP处理可导致脑组织神经细胞的 Bax、fas、p53以及Caspase-3的蛋白水平上升（P＜0.05），Bcl-2的蛋白水平下降（P＜0.05），丹参酮ⅡA处理后可使上述凋亡相关基因的蛋白水平部分恢复（P＜0.05）。

见图
4。

2.6 3组凋亡相关基因mRNA水平比较
与Sham组比较，CLP处理可导致脑组织神经细胞的Bax、fas、p53以及Caspase-3的mRNA水平上升（P＜0.05），Bcl-2的mRNA水平下降（P＜
0.05）；丹参酮ⅡA处理后可使上述凋亡相关基因的mRNA水平部分恢复（P＜0.05）。

见图5。

脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征，伴有大量的炎症介质释放、众多促炎细胞因子的产生以及白细胞的粘附和浸润等［6］，这些因素可引起脑组织的急性炎症反应，加重脑组织的缺血缺氧程度，其神经细胞在经过几小时或几日后发生凋亡，引起脑功能的损害［7-8］。

因此，通过早期干预减少脓毒症脑神经细胞凋亡具有重要的临床意义。

丹参的有效成分丹参酮ⅡA具有抗炎、抗氧化以及清除自由基等作用，对多种脑血管疾病具有保护作用［3］。

本研究发现，CLP组大鼠造模后6 h脑组织已出现病理学改变，并随着炎症反应的持续呈逐渐加重趋势（HE染色光镜下显示细胞水肿、组织结构疏松、炎症细胞浸润，电镜下显示细胞核细胞高度水肿、胞体不规则突起，可见核固缩、核裂解、核溶解），光镜下CLP组可见较大量凋亡细胞（细胞核内
可见棕黄色颗粒，图3：G-I），较Sham组明显增多，细胞凋亡指数显著高于Sham组（P＜0.05，图3：J）；给予丹参酮ⅡA处理之后，上述病理学改变得到明显的改善，凋亡细胞较CLP组明显减少（图3：D-F），凋亡指数显著降低（P
＜0.05，图3：J）。

提示通过早期给予丹参酮ⅡA干预能减少脓毒症脑组织的损
伤和细胞的凋亡。

炎性、氧化反应是导致细胞损伤和凋亡的重要因素［9］；TNF-α是参与脓毒症全身炎性反应的重要细胞因子［10］，可激活核因子κB介导其他细胞因子（如IL-1、IL-6、IL-8）的合成与释放，启动炎症级联反应，从而导致炎症反应失控［11-
12］。

本实验观察到，脓毒症大鼠中TNF-α和IL-1β水平显著升高，并随着炎症反应的持续呈逐渐上升趋势，而丹参酮ⅡA可以抑制脓毒症大鼠脑组织中TNF-α
和IL-1β水平的升高，提示其可以通过抑制脓毒症大鼠脑组织中炎症因子TNF-α
和IL-1β的浸润发挥抗炎作用。

此外，氧化应激是炎症反应中的重要环节，在炎症反应过程中可产生大量氧自由基，诱导细胞凋亡［13-15］。

笔者发现脓毒症大鼠脑组织中，作为膜脂过氧化最重要产物之一的MDA水平明显升高，而生物体内重要的抗氧化酶SOD水平显著降低，随着炎症反应的持续也呈逐渐恶化趋势；丹参酮ⅡA干预后，MDA和SOD水平显著改善；提示丹参酮ⅡA具有抗氧化作用，
通过抗膜脂过氧化抑制炎症引起的脑组织损伤和细胞的凋亡。

综上所述，丹参酮ⅡA具有改善脓毒症大鼠脑组织损伤和细胞凋亡的作用，其可能机制是通过其抗炎（TNF-α、IL-1β）、抗氧化（MDA、SOD）的作用，并调控
凋亡相关基因（Bcl-2、Bax、p53、Fas、Caspase-3）的表达来实现。

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