加速溶剂萃取分离-液相色谱法测定五灵脂药材中3种成分的含量

加速溶剂萃取分离-液相色谱法测定五灵脂药材中3种成分的
含量
巩志国;苏敏;王静静;员丽娟;李世雨;季新成;朱建民
【摘要】Three components (i.e.rutin,kaempferol and amentoflavone)in faeces trogopterori sample (10 g)was extracted with mixture of C2 H5 OH-H2 O (75 +25)thrice for 10 min each in an accelerated solvent extractor under temperature of 100 ℃ and pressure of 15 MPa.The extracts were combined and evaporated to ca. 3 mL;after cooling,its volume was made up to 5.0 mL with the C2 H5 OH-H2 O (75+25)mixture,and the solution was separated on the chromatographic column of Diamosil ODS C18 and eluted gradiently with mixtures of (A) methanol and (B)0.5% (φ)acetic acid solution with various mixing ratios.UV detection at 360 nm was used in the determination.Linear relationships between values of peak area and mass concentrations of the 3 components were found in definite ranges,with detection limits (3S/N)ranged from 0.3 to 0.6 mg·kg-1 .Recovery was tested by standard addition at 3 concentration levels,giving results of recovery in the range of 80.0% to 95.0%,with values of RSD′s (n=5)ranged from 3.2% to 9.6%.%取五灵脂药材（1．0 g）与海沙3．0 g 混匀，置于加速溶剂萃取（ASE）仪中，加入萃取溶剂[乙醇-水（75＋25）]静态萃取循环3次，每次10 min，萃取温度为100℃，压力为15 MPa。

萃取液蒸缩至3 mL，加 C2 H5 OH-H2 O（75＋25）至5．0 mL，过滤后供液相色谱分析。

在色谱分离中，以Diamosil ODS C18色谱柱为固定相，用（A）甲醇和（B）乙酸（0．5＋99．5）溶液以不同比例的混合液作为流动相进行梯度淋洗。

在波长360 nm 处进
行检测。

药材中的芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮的质量浓度与相应的峰面积之间呈线性关系，3种组分的检出限（3S/N）在0．3～0．6 mg·kg-1之间。

在3个浓
度水平条件下用标准加入法进行回收试验，测得回收率在80．0％～95．0％之间，测定值的相对标准偏差（n＝5）在3．2％～9．6％之间。

【期刊名称】《理化检验-化学分册》
【年(卷),期】2014(000)011
【总页数】4页(P1373-1376)
【关键词】液相色谱法;加速溶剂萃取;芦丁;山奈酚;穗花杉双黄酮;五灵脂
【作者】巩志国;苏敏;王静静;员丽娟;李世雨;季新成;朱建民
【作者单位】新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063;新疆出入境检
验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063;新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063;新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063;新疆出入境检验
检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063;新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐830063;新疆出入境检验检疫局技术中心，乌鲁木齐 830063
【正文语种】中文
【中图分类】O652.63
五灵脂是哺乳纲鼯鼠科动物复齿鼯鼠的干燥粪便，分为灵脂米和灵脂块两种。

五灵脂中主要含有含氮化合物，三萜类化合物，酚酸类及简单单萜、二萜酸，维生素样物质、树脂和无机盐等［1］。

五灵脂为活血化瘀的中药材，《本草纲目》曰：“五灵脂，足厥阴肝经药也。

气味俱厚，阴中之阴，故入血分”，“主治心腹冷气，
小儿五疳，辟疫，治肠风，通利气脉，女子血脉”［2］。

芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮属于黄酮类化合物，有抗过敏、抗菌、抗炎和治疗心脑血管疾病等功能［3－5］。

目前关于五灵脂中活性物质的测定方法主要是液相色谱法［6－8］和薄层色谱法［9－10］，其前处理方法主要使用超声提取和水浴加热提取两种方式，具有耗时长、试剂用量大、溶剂挥发多的缺点。

加速溶剂萃取技术是近年发展起来的一种在高温（低于200 ℃）、高压（低于20 MPa）条件下快速提取固体或半固体样品
的前处理方法，与常用的水浴加热提取、超声提取和微波萃取技术等方法相比，可大大缩短萃取时间，提高萃取效率，减少萃取溶剂用量，显著降低了单个样品的提取费用。

本工作采用加速溶剂萃取－高效液相色谱法测定了五灵脂药材中芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮的含量。

1 试验部分
1.1 仪器与试剂
Waters 2695 型液相色谱仪，配紫外检测器；MS 3型涡旋仪；SK 8200LH 型超
声仪；Milli－QⅡ型高纯水发生器；T－124型离心机；RE－52AA 型旋转蒸发仪；ASE 200 型加速溶剂萃取仪；JULABO F34型恒温水浴。

标准储备溶液：100mg·L－1，称取适量的芦丁（纯度为90%）、山奈酚（纯度为97%）和穗花杉双黄酮（纯度为99%）标准品，用甲醇为溶剂配制成，储存于－18 ℃冰箱，保存期为18个月。

使用时用甲醇稀释至所需质量浓度。

样品提取溶液：乙醇－水（75＋25）混合溶液。

甲醇、乙腈为色谱纯；五灵脂的样品为某地区市售和某进口样品；其余试剂均为优级纯；试验用水为二次净化水。

1.2 仪器工作条件
1）色谱条件Diamosil ODS C18色谱柱（4.6mm×250mm，5.0μm）；流动相：
A 为甲醇，B为乙酸（0.5＋99.5）溶液。

梯度洗脱程序：0～10min时，A 由85%降至60%；10～15min时，A 由60%降至35%；15～22 min 时，A 由35%降
至15%；22～28 min 时，A 由15%升至85%，保持7min。

进样量10μL；流量1.0mL·min－1；柱温为35 ℃；检测波长为360nm。

2）加速溶剂萃取条件溶剂为乙醇－水（75＋25）溶液；温度100 ℃；压力15 MPa；预热时间5.0min，静态萃取时间10.0min，循环次数为3次。

1.3 试验方法
称取试样1.000 0g，加海沙3.0g混匀后，置于11mL 加速溶剂萃取池中（下部
先添加少量海沙），上部添加海沙至平，拧紧萃取池帽，放入加速溶剂萃取池盘中，按AES 条件进行萃取，萃取后，接收池溶液旋转蒸发至3 mL，用提取溶液定容至5mL，过0.2μm 的再生纤维素膜，按色谱条件进行测定。

2 结果与讨论
2.1 色谱行为
按色谱条件对1.0mg·L－1的芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮混合标准溶液进行测定，其色谱图见图1。

图1 混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution 2.2 流动相的选择
参考待测物的性质和文献［6］，待测物属于中等极性，可选择反相C18色谱柱分离待测物。

试验通过比较不同流动相甲醇和酸性（乙酸和磷酸）水溶液与乙腈和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，依据基线噪声的高低和目标物与杂质的分离度选择流动相。

结果表明：甲醇和乙酸（0.5＋99.5）溶液作为流动相时，芦丁、山奈酚和穗
花杉双黄酮都具有较低的噪声和较好的分离度。

2.3 提取条件的选择
按试验方法考察了超声提取、恒温水浴加热提取和加速溶剂萃取等3种方式对测
定的影响。

结果表明：加速溶剂萃取萃取时间短，溶剂用量少，提取效率高，为最优选择。

加速溶剂萃取的条件主要有温度、压力、静态提取时间和循环次数等。

萃取条件以提取率为依据进行选择。

试验首先用水浴加热经长时间反复提取某五灵脂样品（含有3种待测物），当测定的3种物质的含量水平基本无变化时，确定提取完全，
获得该样品中3种物质的实际含量值。

提取率为一定条件下提取后测定值占其实
际含量值的百分数。

如ASE的其它条件不变，循环1～5 次的提取率依次为52%，80%，96%，98%，98%，可以看出：循环3次已基本提取完全。

用同样方法选
择ASE 的其它萃取条件。

试验选择温度为100 ℃，压力为15 MPa，预热时间为5.0min，静态提取时间为10.0min。

2.4 标准曲线和检出限
按色谱条件对芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮标准溶液系列进行测定，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮的线性参数见表1。

以3倍信噪比计算方法的检出限（3S/N），以10倍信噪比计算方法的测定下限（10S/N），结果见表1。

表1 线性参数、检出限和测定下限Tab.1 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination
2.5 精密度和回收试验
按试验方法对五灵脂样品进行测定，同时添加3个浓度水平进行回收试验，每个
水平重复5次，回收率和精密度的试验结果见表2。

表2 精密度及回收试验结果（n＝5）Tab.2 Results of tests for precision and recovery
2.6 样品分析
按试验方法对20个五灵脂样品进行测定，根据化合物的色谱保留时间和光谱图来
鉴别样品。

结果表明：所测定样品中芦丁、山奈酚、穗花杉双黄酮的质量分数依次在0.02%～0.3%，0.03%～0.1%，0.01%～0.09%之间。

五灵脂样品的色谱图见
图2。

本工作采用乙醇水溶液作为溶剂，通过对比不同萃取方式，选择加速溶剂萃取法提取五灵脂样品中的芦丁、山奈酚和穗花杉双黄酮用液相色谱法进行测定。

方法不仅可用于分析五灵脂中活性成分的含量，还可以测定其它成分的含量。

本工作为中药材的质量分析提供了一个简单快速的处理方法。

图2 五灵脂样品的色谱图Fig.2 Chromatogram of sample of faeces trogopterori
参考文献：
［1］朱翔宇.五灵脂化学成分与质量控制标准研究［D］.成都：西南交通大学，2008.
［2］唐绪刚，黄文权.五灵脂药理及临床应用概述［J］.中国中医急症，2008，17（1）：101－102.
［3］李猛，艾惜，孙建厅，等.高效液相色谱法测定凤仙花植株不同部位槲皮素、山奈酚含量［J］.理化检验－化学分册，2010，46（10）：1160－1162.
［4］陈华国，靳凤云，周欣，等.高效液相色谱法同时测定槐枝中芦丁和槲皮素［J］.理化检验－化学分册，2010，46（7）：754－759.
［5］尚永辉，李华，孙家娟，等.双波长叠加分光光度法测定样品中芦丁的含量［J］.理化检验－化学分册，2009，45（12）：1396－1398.
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［9］焦玉，李丹艺，刘晓秋，等.五灵脂中两个黄酮成分的提取分离与薄层色谱鉴别［J］.中药材，2009，32（7）：1039－1041.
［10］崔晓娟，贺娟娜，赵玉华，等.五灵脂药材中山柰酚的薄层色谱鉴别［J］.传统医药，2011，20（18）：68－68.。