枯草芽孢杆菌对烟叶主要致香物质的影响

枯草芽孢杆菌对烟叶主要致香物质的影响
瞿娇娇;邹晓;张晓敏;施鸣;胡大鸣;惠建权;吴有祥
【摘要】为改善烟叶品质，增加烟叶香气，用从豆豉中分离出的1株枯草芽孢杆
菌（Bacillus subtilis ）悬液喷雾接种于 A2 C2等级烟叶，在30℃、相对湿度65％条件下发酵15 d，经同步蒸馏萃取（SDE）发酵烟叶，色谱质谱法（GC-MS）分析萃取物中醇、酸、酯类及新植二烯致香物质的含量。

结果表明，经枯草芽孢杆菌发酵处理的烟叶其醇、酸、酯类总量均较未接种烟叶增加，新植二烯含量差异不大；当烟叶接种浓度为2．0×108个／mL 时，醇、酸、酯类总量较未接种烟叶分别增加28．145％、102．658％和22．289％，烟叶香气质提高，吃味改善，杂气减少，刺激性降低，烟气细腻、柔和，感官品质整体提高。

结论：枯草芽孢杆菌在烟叶增香、提质方面有较好效果。

%In order to improve the quality of tobacco and increase the tobacco aroma,a Bacillus subtilis strain which was isolated from traditional food of fermented-soybean Douchi was used to Guizhou Qiannan A2 C2 grade tobacco fermentation for 15 days at 30℃,65% humidity.Samples were treated by synchronous distillation extraction (SDE ), the main tobacco fermentation aroma (alcohols, acids, esters, neophytadiene)were analyzed with chromatography mass spectrometry (GC-MS).The results showed that the tobacco alcohols,acids,esters total increased by 28.145%,102.658% and 22.289% respectively after fermentation of B.subtilis with concentration of 2.0×108 cells/mL,and the neophytadiene changed little;Sensory evaluation showed that tobacco aroma quality and taste were improved,hybrid gas was reduced,irritation was decreased,smoke was more delicate,soft,sensory quality was improved
overally. Conclusion:B.subtilis have better effects on improving tobacco flavor and quality.
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2014(000)006
【总页数】4页(P150-153)
【关键词】枯草芽孢杆菌;致香物质;烟叶;发酵
【作者】瞿娇娇;邹晓;张晓敏;施鸣;胡大鸣;惠建权;吴有祥
【作者单位】贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025;贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025; 贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州贵阳 550025;贵州中烟工业有限责任公司，贵州贵阳 550002;贵州中烟工业有限责任公司，贵州贵阳550002;贵州中烟工业有限责任公司，贵州贵阳 550002;贵州中烟工业有限责任
公司，贵州贵阳 550002;贵州中烟工业有限责任公司，贵州贵阳 550002
【正文语种】中文
【中图分类】S572
烟叶香气成分复杂，按致香基团不同，一般把烟叶香气成分分为酸类、醇类、酮类、醛类、酯类［1］。

烤烟烟叶香气成分中烯类物质含量最多，主要是新植二烯（34.1%），其次是酸类物质，最后是醇类物质和烷烃类以及醛酮类［2］。

烟叶
香味是评定烟叶及其制品品质的重要指标，烟叶中许多香气成分可直接进入烟气，并对烟气的香气量、香气质和香型产生重要影响［3］。

最大限度地提升烟叶的香味是改善烟草品质的核心。

近年来，应用有益微生物或复合微生态制剂改善烟叶香气质及香气量是烟叶品质的研究热点［4－5］。

微生物在烟叶发酵过程中产生次级代谢产物及各种酶，能将烟叶中纤维素、蛋白质和糖等大分子物质分解，形成对香气物质有贡献的小分子物质或前体物质，从而改善烟叶的香味品质［6］。

研究表明，有益微生物的介入对烟叶化学成分和内在质量有不可忽视的影响，不但能加速烟叶醇化进程，在一定程度上改善烟叶内部品质，还能提高烟叶香气质量［7－11］。

目前，微生物对烟叶致香影响大多集中在主要化学成分变化及相应感官评吸的研究上，对发酵过程中重要香味物质定性定量分析、动态变化以及具体的致香机理研究较少。

为此，笔者等利用传统发酵食品豆豉中筛选出的1株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）悬液喷雾接种于A2C2等级烟叶，经发酵处理后，分析烟叶中主要致香物质（醇类、酸类、酯类和新植二烯）含量差异，旨在定量分析添加微生物作用后烟叶致香物质的变化，揭示有益微生物的介入对烟叶醇化过程中致香成分变化的影响，为人工添加微生物调控烟叶醇化过程提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试烟叶：取自贵州中烟公司贵阳醇化库，产地贵州省黔南州，等级 A2C2，年份2009年，水分13%。

供试菌株：菌株分离自市售豆豉，编号为GZAC－Bbs2011，保存于贵州大学真菌资源研究所。

培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1 000mL，pH 7.0～7.2，灭菌条件1×105Pa灭菌20min。

菌株鉴定试验条：API 50CH试验条及API 50 CHB／E培养基，购于生物梅里埃集团。

1.2 试验方法
1.2.1 菌株分离及菌剂制备菌株分离采用梯度稀释平板法［12］（略有改动），
挑取有酿香的一个单菌落保存备用。

该菌经API 50CH试验条生理生化鉴定，比
对结果为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），鉴定百分率为99.1%，典型性为
0.99，可认定此菌株为枯草芽孢杆菌。

菌剂的制备：用500mL三角瓶制备液体培养基，接种枯草芽孢杆菌，30℃，200r／min，48h。

1.2.2 试验设计在前期工作基础上试验设3个处理，处理1：菌剂浓度2.0×108
个／mL；处理2：菌剂浓度4.8×108个／mL；处理3：对照（CK），用同量无
菌水处理。

接种量为50mL／kg。

1.2.3 样品制备每处理5kg片烟，按设计浓度分别喷洒菌悬液，混合均匀，纸箱
封存，在温度30℃、相对湿度为65%的醇化库中发酵15d。

发酵后的烟叶分为2份，1份用于主要致香物质的含量测定，一份用于感官评吸鉴定。

1.3 致香物质提取与测定
采用同步蒸馏萃取法（SDE），将烟叶样品于（40±1）℃下干燥4h，粉碎，过
40目筛，所得烟末在温湿平衡箱中于（22±1）℃和RH（60±2）%下平衡24h。

准确称取烟末样品25.0g，以二氯甲烷作溶剂同时蒸馏萃取2h，所得提取物经无
水硫酸钠干燥后，于旋转蒸发仪中浓缩至1.0mL，加入50μL（0.1mol／L）乙酸
苯甲酯的无水乙醇溶液，摇匀，取样进行GC／MS分析［13］。

采用NIST05和Wiley275谱库检索定性，内标法定量［14］。

GC／MS分析条件为：色谱柱：HP25MS（30m×0.25mm×0.25μm）毛细管柱；进样口温度：240℃；载气：He，1mL／min；程序升温：50℃（1min），以8℃／min 升至160℃ （2min），再以8℃／min升至260℃（15min）；进样量：2μL，分流比：25∶1；传输线温度：280℃；电离方式：EI；电离能量：70eV；
离子源温度：230℃；四级杆温度：160℃；质量：35～455aum。

1.4 感官品质评价
感官品质参照国标GB5606.4－2005和烟草行业标准YC／T138－1998的鉴定。

感官品质评价通过香气质、香气量、吃味、杂气、刺激性、细腻度和柔和度7个
评吸指标体现。

感官评吸方法采用对照评吸法。

2 结果与分析
2.1 不同处理烟叶主要致香物质的含量差异
不同处理烟叶样品致香成分检测结果见表1。

1）醇类。

从总量看，处理1和处理2的醇类致香物质含量分别比对照增加
28.145%和8.752%。

其中，处理1所有醇类致香物的增幅均为正值；处理2，总量有所增加，但苯甲醇、芳樟醇和苯乙醇的增幅为负值。

有研究表明，并非所有的香味成分都与感官质量正相关，也有少量香味成分与感官质量呈负相关或是不相关，如苯甲醇、B－苯乙醇、芳樟醇等［15］。

因此，该枯草芽孢杆菌总体上能增加烟叶的醇类香气物质。

2）酸类。

与对照相比，酸类总量增幅最大，处理1和处理2的增幅分别达到102.658%和101.087%，其中对2个处理增幅贡献较大的有肉豆蔻酸和棕榈酸，它们是非挥发性酸的代表，可增加烟气浓度，使吸味醇和，平衡烟气。

处理1和
处理2的己酸含量均低于对照；而戊酸含量处理1低于对照，处理2高于对照。

这可能与烟叶样品均匀度不一致有关，但经过处理后烟叶的各种酸类致香物质总体呈明显上升趋势。

说明，枯草芽孢杆菌能增加烟叶中酸类致香物质的含量。

3）酯类。

不管从总量上还是从各个种类含量上看，处理1和处理2的酯类致香物质的增幅都为正值，其中能消除烟草刺激性的重要致香物质二氢猕猴桃内酯含量比对照增幅较大，平均达21.38%。

处理1和处理2之间各个酯类含量的增幅有所不同。

这些酯类成分的增加可进一步增加烟气浓度，使烟叶的香气醇和，味甜，对烟叶品质有提高作用。

4）新植二烯。

新植二烯是烟叶中含量较高的中性挥发性成分。

Sakari等［16］
和 Wu 以及Weeks［17］研究了烟叶顶空挥发物和烟气质量的关系，表明烟叶挥发物含量与烟气香味呈正相关，其中新植二烯是重要指标之一，可作为特定的挥发物成分来评判烟气质量。

经枯草芽孢杆菌处理后，新植二烯含量变化不大，处理1和处理2的平均增幅为2.503%，变化幅度较小，与对照相当。

说明，枯草芽孢杆菌的处理对新植二烯含量无明显影响。

表1 不同处理烟叶的致香物质含量Table 1 Contents of aroma substance in tobacco leaves of different treatment化合物名称Compound name CK／（μg／g）处理1Treatment 1含量／（μg／g）比CK±%处理Alcohol 3－甲基－1－丁醇 3－methyl－1－butanol 0.132 0.146 10.606 0.156 18.182糠醇Furfuryl alcohol 0.617 0.647 4.862 0.743 20.421苯甲醇 Benzyl alcohol 2.743 3.237 18.009 2.506 －8.640芳樟醇 Linalool 0.317 0.328 3.470 0.296 －6.625苯乙醇 Phenethyl alcohol 1.373 1.726 25.710 1.288 －6.191 3－氧代－α－紫罗兰醇3－oxo－α－ionol 0.121 0.149 23.140 0.155 28.099寸拜醇Thunbergol 1.659 2.516 51.658 2.228 34.298植醇 Phytol 0.395 0.523 32.405 0.486 23.038西柏三烯二醇 Cembratriene－diol 0.378 0.640 69.312 0.554 46.561醇类总量 Total alcohol content 7.735 9.912 28.145 8.412 8.752酸类致香物质CK±%醇类致香物质2Treatment 2含量／（μg／g）比Acids 2－甲基丁酸2－methylbutyric acid 0.453 0.455 0.442 0.567 25.166戊酸 Valeric acid 0.026 0.019 －26.923 0.029 11.538糠酸 Furoic acid 0.331 0.346 4.532 0.444 34.139己酸 Caproic acid 0.035 0.026 －25.714 0.030 －14.286肉豆蔻酸 Myristic acid 0.400 0.592 48.000 0.576 44.000十五酸 Pentadecylic acid 0.093 0.091 －2.151 0.109 17.204棕榈酸＋未知物 11.538 24.546 112.741 24.137 109.196 Palmitic acid＋unknown substance酸类总量 Total acids content 12.876 26.093 102.658 25.892 101.087酯类致香物质Esters丁内酯
Butyrolactone 0.088 0.098 11.364 0.122 38.636二氢猕猴桃内酯Dihydroactinidiolide 0.643 0.811 26.128 0.750 16.641肉豆蔻酸甲酯 Methyl myristate 0.388 0.459 18.299 0.404 4.124邻苯二甲酸二丁酯 Dibutyl phthalate 0.623 0.673 8.026 0.855 37.239棕榈酸甲酯 Methyl palmitate
7.631 8.387 9.907 7.716 1.114棕榈酸乙酯 Ethyl palmitate 0.780 1.007
29.103 1.14 45.641亚麻酸甲酯 Methyl linolenate 5.545 7.762 39.982 5.820 4.959酯类总量 Total esters content 15.698 19.197 22.289 16.403 4.491新植二烯Neophytadiene新植二烯Neophytadiene 356.789 347.807 －2.517 383.629 7.523
表2 不同处理烟叶的感官品质Table 2 Sensory quality variation of tobacco leaves of different treatment注：＋表示在对照基础上的改善程度。

Note：＋indicated the improvement degree on the basis of the control.处理Treatment香气质Aroma quality香气量Aroma quantity吃味Taste杂气Offensive gas刺激性Irrigation细腻度Tenderness柔和度Softness CK－－－－－－－1＋－＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋2＋＋
2.2 不同处理烟叶的感官品质变化
从表2可以看出，烟叶接种枯草芽孢杆菌后，代表感官品质的7个指标比对照均有不同程度的改善，表现为烟叶香气质、香气量、吃味均有所增加，杂气减少，刺激性降低，烟叶更加细腻、柔和。

说明，该枯草芽孢杆菌对烟叶的感官品质有整体提高。

2个处理浓度中，以接种浓度为2.0×108个／mL的处理对烟叶评吸效果更好。

3 结论与讨论
1）复烤烟叶经枯草芽孢杆菌发酵处理后，其主要致香物质含量均有所增加，感官评吸体现的内在品质有所提升。

其中，以接种浓度为2.0×108个／mL的处理对
烟叶提质效果更好，醇、酸、酯类总量比未接种烟叶分别增加28.145%、
102.658%、22.289%，新植二烯与对照相当；香气质与香气量在对照的基础上有明显增加，杂气减少，刺激性降低，烟气更为细腻、柔和，感官品质整体提高。

说明，该枯草芽孢杆菌能提升烟叶的整体品质。

2）烟叶香气质量的提升主要由重要致香成分的增加来实现，另外还与致香物质的组合与比例及其他不良成分的消减有关。

枯草芽孢杆菌的介入对烟叶发酵产生有益影响，不仅能增加烟叶中致香物质的总量，可能还与枯草芽孢杆菌综合平衡香气物质和对烟叶中不良成分的消减有关，进而整体提高感官品质。

3）本研究设置的枯草芽孢杆菌浓度为2.0×108个／mL和4.8×108个／mL，2
个处理组对烟叶各类致香物质的影响总体趋势一致，偶尔有同一致香成分在2个
处理组之间出现变幅异常，如戊酸、苯甲醇和苯乙醇等，这种异常可能与烟叶差异、菌种接种均匀度有关。

为了让该菌能在烟叶品质的提高上有更佳的效果，可进一步探索该菌的最适接种浓度和接种量。

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