血液RNA提取

血液RNA提取
完全可以,我曾经全血标本6个小时后分离白细胞提RNA,结果很好.因为你提的是白细胞内的RNA,因而在细胞没破损前,一般情况下不会出现RNA的降解,当你开始加TIIZOL时,你的所有器材的处理尤其重要,因而放心的做吧,
本人长期从事白血病融合基因的检测，曾经使用4度保存3天的血液进行RNA提取，效果同样非常满意，目前使用的一次性耗材基本上不用DEPC水处理，只要注意规范操作，按TIIZOL说明书操作，提取的RNA 质量同样非常的高。

附上本试验室的简易操作程序：1．外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞
（1）外周血送检需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定，一般需要5x106单个核细胞以上)。

（2）加入等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；
（3）加入5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。

（4）吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面（注意勿与淋巴细胞分离液混合）。

离心1500rpm 20min。

（5）用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC入另一离心管中。

无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清直接或加入TRIzol混匀后-70℃冻存，或直接提取RNA（可以先进行细胞计数以保证细胞数）。

2．利用Trizol的方法提取细胞总RNA（参照Invitrogen公司Trizol说明书）
以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1% DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。

尽量快地进行操作，减少RNA降解。

（1）先加1ml Trizol于1×107细胞中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置
5-10min。

（可-70℃，1月）
（2）加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），剧烈震荡（vigorously）15s，室温静置2-3min。

（3）在4℃下1,2000g离心15min。

（4）小心吸出上清水相约500μl移入另一离心管（注意不要抽到蛋白层），加入500μl异丙醇（专用），颠倒混匀（不要太剧烈），室温静置10min（RNA沉到底部）。

（5）4℃1,2000g离心10min，倒去上清液，底部可见针尖大小白色物质（RNA）。

（6）加入1ml 70%乙醇旋转洗涤，清洗异丙醇。

（7）4℃7500 g离心5min，去除乙醇（尽量用枪头吸干净）后晾5-10min，不要太干,否则难以溶解。

RNA可以在70%乙醇中-80℃保存1年。

最新血液RNA提取
1、血液收集：最好用肝素抗凝，因为EDTA可能会对后续的pcr 有影响，因为EDTA会螯合pcr 反应中的Mg2+，也可以根据实验的具体要求看选择怎么样的抗凝。

2、白细胞的分离：一般选择1.5ML新鲜的血液，或选取冷冻的5ML的血液（冷冻血液的保存：先液氮速冻，再置于-80°保存），或隔天的5ML的血液，就可以分离到比较多的白细胞了。

可以选择溶红素（BD公司的）或红细胞裂解液按一定的比例（1：3或1：5）分离白细胞，一般在3500转离心6分钟即可，效果不好的话，可以重新裂解一次。

分离得到的白细胞，立刻用质量好的TRIZOL裂解白细胞，如果不能马上提取的话，可以置于-20或-80°保存，过后抽提。

3、RNA抽提：选择一般的组织或细胞的RNA抽提试剂盒即可。

本方法简单，省钱，经过大量的实验表明是可行的，并且本人用进口的血液RNA抽提试剂盒都不能跟上述方法比
在用血液标本进行基因表达研究时，需要及时把新鲜血液中有核细胞的RNA提取出来。

全血还不能直接放到-80℃保存，即使在-80℃保存，全血中的RNA也容易发生降解。

传统的提取新鲜全血RNA方
法是把先把有核细胞从全血中分离出来，需要加白细胞分离液、离心等步骤，比较繁琐，在临床医院往往难以实施。

作为RNA提取的领先公司，北京艾德莱的研发人员在05年国内首家研发成功液体样本RNA 提取试剂RN01 TRIpure LS(LS 意思是Liquid Sample。

可以直接裂解全血提取RNA，避免了先裂解白细胞可能导致的RNA降解，也大大简化了操作步骤。

操作时间比普通方法节约至少三分之一。

在临床上采血时，可以先把TRI pure LS Reagent分装750ul到1.5ml的离心管中。

血液样本可以先抗凝处理（EDTA抗凝或者其他抗凝方式都可），然后取250ul全血样品加入到750ul的TRI pure LS Reagent中，用移液枪反复抽打并振荡混匀，在室温裂解5min-10min，直至血细胞充分发生裂解。

然后可把此裂解液保存在-20℃下可达2个月，-80℃可达半年。

在此期间，可以把该裂解液运输到北京艾德莱生物公司进行RNA的抽提，运输过程可以4℃1天，-20℃一周。

在全血RNA提取试剂直接裂解全血的基础上面，北京艾德莱又进一步简化了操作，增加了离心柱操作，推出了RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA 提取试剂盒。

点此详见。

经过离心柱子吸附漂洗，除了进一步简化了操作步骤外，更适合临床高通量操作外，还极大的提高了RNA的纯度。

除了一般常见的RT PCR 或者荧光定量PCR外，RNA纯度可以满足最严格的实验要求比如基因表达谱芯片要求，1ml的全血可以得到10μg左右的total RNA，足够满足芯片分析的需要
需要准备的试剂氯仿、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free 的水
1.匀浆处理（Homogenization）
直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000 rpm离心1分钟。

彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。

每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1ml TRIzol。

2．分层（Phase Separation）
a. 样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

注：
如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。

可选步骤：4℃ 12,000 rpm 离心10分钟，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

b. 每1ml TRIzol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5 min使其自然分相。

3．RNA沉淀（RNA Precipitation）
a. 4℃ 12,000rpm离心10-15min。

样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（通常可吸取550μl）转移到新管中。

注：小心吸取水相，千万不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA 污染。

b. 在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。

4℃ 12,000 rpm 离心10min，弃上清，RNA沉淀于管底。

4．RNA漂洗（RNA Wash）
a. RNA沉淀中加入1ml 75%乙醇（用RNase-free水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。

每1ml TRIzol加入1ml 75％乙醇。

b. 4℃ 5,000-8,000 rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。

室温放置1-2分钟晾干沉淀。

注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。

5.溶解RNA（Redissolving the RNA）
沉淀中加入50-100μl RNase-free水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存。

注意事项
1. 经常更换手套。

因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2. RNA在TRIzol试剂中不会被RNase污染，但在氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂，所以分相后的所有操作要特别小心，保证使用的离心管和枪头都是RNase-free的。

3. RNase-free水的配制方法：将水加入干净的玻璃瓶中，加入
DEPC至终浓度0.1%(v/v)，放置过夜，高压灭菌；RNase-free的塑料和玻璃器皿处理方法：玻璃器皿可在150℃烘烤4小时；塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，然后用DEPC水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

6. 不同组织或细胞中提取RNA预期得率血液(3－5 μg/ml人全血).
RNA纯度及浓度检测
完整性RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：1.2%胶；
0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟）检测完整性。

由于细胞中70-80%的RNA为rRNA，电泳后UV 下应能看到非常明显的rRNA条带。

动物rRNA大小分别约为5kb和2kb，分别相当于28S和18S rRNA；植物叶片中由于含有大量的叶绿体RNA，可见4条或更多rRNA；细菌rRNA大小分别约为4kb和2kb，分别相当于细菌23S和16S rRNA。

RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍，否则表示RNA样品的降解。

出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。

纯度 OD
260/OD
280
比值是衡量RNA样品中蛋白质污染程度的指标。

高质量的RNA
样品，OD
260/OD
280
值（10mM Tris, pH7.5）在2.0左右。

OD
260
/OD
280
读数受测定所
用溶液的pH值影响。

同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的
OD
260/OD
280
读数在1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但
这并不表示RNA不纯。

浓度取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD
260
测定，按照以下公式进行RNA浓度的计
算：终浓度（ng/μl）=OD
260
×n (稀释倍数)×40。