【CN109799353A】利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910116614.9
(22)申请日 2019.02.15
(71)申请人 浠思（上海）生物技术有限公司
地址 200131 上海市浦东新区中国（上海）
自由贸易试验区张衡路1299号2幢401
室
(72)发明人 王维娜　
(51)Int.Cl.
G01N 33/68(2006.01)
G01N 21/64(2006.01)
(54)发明名称利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法(57)摘要本发明公开了一种利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，属于细胞因子的检测领域。

利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：步骤一，利用细胞培养板，设置细胞密度及培养体系对细胞进行培养；步骤二，用药物处理细胞，通过优化刺激时间得到最强的信号；步骤三，收集细胞上清，若细胞上清需要稀释，则配置标准曲线；步骤四，将16ul细胞上清加入检测板中，加入4ul标记好的检测抗体混合液，室温孵育；步骤五，用酶标仪读数，并分别用各自标准曲线计算出样品中各细胞因子浓度。

本发明的优点在于：提供了新的方法，实现
了仅靠试剂就可以完成的多因子检测。

权利要求书1页 说明书4页 附图2页CN 109799353 A 2019.05.24
C N 109799353
A
1.利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：步骤一，利用细胞培养板，设置细胞密度及培养体系对细胞进行培养；
步骤二，用药物处理细胞，通过优化刺激时间得到最强的信号；
步骤三，收集细胞上清，若细胞上清需要稀释，则配置标准曲线；
步骤四，将16ul细胞上清加入检测板中，加入4ul标记好的检测抗体混合液，室温孵育，所述检测抗体混合液标记了HTRF荧光能量供体和受体，其中两个标记了HTRF荧光能量供体和受体的抗体便会以夹心法的形式结合在待测样品上；
步骤五，用酶标仪读数，并分别用各自标准曲线计算出样品中各细胞因子浓度。

2.根据权利要求1所述的利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，其特征在于：在步骤一中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植2.5-10万细胞，培养体系为50-100ul，或所述细胞培养板为24孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植14-55万细胞，培养体系为500-1000ul，或
所述细胞培养板为16孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植29-115万细胞，培养体系为1000-2000ul，或
所述细胞培养板为6孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植70-280万细胞，培养体系为2500-5000ul。

3.根据权利要求1所述的利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，其特征在于：在步骤二中，所述药物为激动剂或抑制剂。

权　利　要　求　书1/1页CN 109799353 A
利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法
技术领域
[0001]本发明属于细胞因子的检测领域，具体涉及一利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法。

背景技术
[0002]PBMC，外周血单核细胞，已经成为肿瘤和肿瘤免疫研究中的重要模型，它所包含的T细胞，B细胞，NK细胞及其他单核细胞作为机体接受治疗后的免疫反应模型，被广泛应用于从科学研究到药物开发等领域，这些反应包括T细胞活化、细胞因子风暴等。

因此，多细胞因子检测就被用来监测治疗后免疫系统的响应，在药物研究中有重要意义。

[0003]目前最常用的检测多细胞因子的方法有：流式CBA，MSD，Luminex三种方法。

其中CBA即微量样本多指标流式蛋白定量技术，是基于流式细胞仪的方法，通过利用一系列带有荧光标记的微球，交联特定的捕获抗体，从而捕获溶液中的待测物。

最后通过对应各种不同检测物上的特异微球所带的荧光来进行定量。

[0004]MSD(MesoScaleDiscovery)基于电化学发光，检测原理类似于ELISA的夹心法，首先将捕获抗体包被在板子上，然后加入样品，样品中的待测物就跟抗体结合，加入检测抗体及尔康，二抗上的信号分子SULFO-TAG在电激发的情况下产生信号。

[0005]Luminex技术应用微球和流式细胞仪相结合。

首先用荧光编码的微球共价交联单克隆抗体，与被检测的目标分子结合后，加入荧光素标记的检测抗体，再通过激光扫描荧光编码来识别单个微球和测量荧光强度来确定被测分子的浓度。

[0006]综上所述，现有的检测方法都需要特殊的仪器，且价格不菲，有些甚至需要特别订制的耗材，比如MSD，且同样需要洗涤，导致检测成本大幅上升，很难普及。

发明内容
[0007]为了克服上述不足，本发明提供了一种利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，实现了仅靠试剂就可以完成的多因子检测。

[0008]利用HTRF技术同时检测多个细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：
[0009]步骤一，利用细胞培养板，设置细胞密度及培养体系对细胞进行培养；
[0010]步骤二，用药物处理细胞，通过优化刺激时间得到最强的信号；
[0011]步骤三，收集细胞上清，若细胞上清需要稀释，则配置标准曲线；
[0012]步骤四，将16ul细胞上清加入检测板中，加入4ul标记好的检测抗体混合液，室温孵育，所述检测抗体混合液标记了HTRF荧光能量供体和受体，其中两个标记了HTRF荧光能量供体和受体的抗体便会以夹心法的形式结合在待测样品上；
[0013]步骤五，用酶标仪读数，并分别用各自标准曲线计算出样品中各细胞因子浓度。

[0014]进一步，在步骤一中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植2.5-10万细胞，培养体系为50-100ul，或
[0015]所述细胞培养板为24孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植14-55万细胞，培养
体系为500-1000ul，或
[0016]所述细胞培养板为16孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植29-115万细胞，培养体系为1000-2000ul，或
[0017]所述细胞培养板为6孔细胞培养板，所述细胞密度为每孔种植70-280万细胞，培养体系为2500-5000ul。

[0018]进一步，在步骤二中，所述药物为激动剂或抑制剂。

[0019]HTRF是均相时间分辨荧光技术的简称，技术是对TR-FRET技术的进一步改良。

HTRF 基于时间分辨荧光(TRF)其和荧光共振能量转移(FRET)两大技术。

TRF利用稀土元素半衰期长的特性(毫秒级，较普通荧光纳秒级，有6个数量级差异)。

所以可以通过延迟50-100微秒排除背景。

FRET利用两种荧光集团的能量转移，这两种荧光集团分别称为能量供体(Donor)和能量受体(Acceptor)。

Donor被外来光源激发，如果它与Acceptor接近，可将能量共振转移到Acceptor上，使其受到激发，发射出特定波长665nm的发射光。

较传统TR-FRET的能量供体包裹在螯合物中，HTRF的荧光能量的两种Donor铕(Eu3+cryptate)和铽(Lumi4Tb)，他们被永久地嵌合在穴状化合物中，更加灵敏和稳定。

铕和铽受激光激发后，其发射波谱在620nm处有一波峰。

Acceptor也有两种，一种是APC铰链复合体，商业名称为XL665，另一种是d2，为小分子化合物，分子量约1kD。

XL665和d2的激发光与Donor的发射光有一定重叠，其受激后会在665nm处形成一特异波峰。

[0020]用HTRF同时检测多个细胞因子技术特点有：
[0021] 1.操作简单：只需加样和检测试剂，孵育后即检测，无需洗涤，一步法检测。

[0022] 2.不需要特殊仪器，成本可控。

[0023] 3.通量高，易小型化：384或1536孔板操作，反应体系最小可达8uL，极大的降低了样本消耗；
[0024] 4.信号稳定：可连续多次检测，重复性好；
[0025] 5.假阳性、假阴性率低：均相检测，不破坏蛋白构象；可排除天然产物自发荧光的背景。

[0026]本发明的优点在于：
[0027] 1.提供新的方法：实现了仅靠试剂就可以完成的多因子检测。

[0028] 2.大大节省了实验工作量和实验时间：实验操作从原来的包被、封闭、多次洗板，到现在的只需加入样品和检测试剂，实验时间由原来的1天时间缩短到1-2个小时；[0029] 3.极大提高了实验的通量：由原来ELISA的96孔或FACS等单个样品过柱检测，提高到384孔甚至1536孔，从而实现在短时间内进行大批量样品筛选；
[0030] 4.信号更稳定：荧光持续时间久，可以过夜后再进行检测，不影响检测结果，而其他方法的检测结果受到时间限制，时间过长或者过短都会影响检测结果。

附图说明
[0031]图1为本发明提供的检测细胞因子的原理示意图。

[0032]图2为本发明提供的利用HTRF检测细胞因子的流程示意图。

[0033]图3为本发明提供的在同一个板子上检测同一个样品中的不同细胞因子的示意图。

[0034]图4为本发明提供的用HTRF检测非特异性刺激下细胞因子的释放或抑制的检测结果示意图。

[0035]图5为本发明提供的用HTRF检测B细胞诱导下细胞因子的释放和抑制的检测结果示意图。

[0036]图6为本发明提供的用HTRF检测T细胞诱导下细胞因子的释放和抑制的检测结果示意图。

具体实施方式
[0037]下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

[0038]如图1所示，从左到右依次表示的是荧光能量供体Eu3+标记抗体，待检测细胞因子抗原，荧光能量受体XL665标记抗体。

本实施例中，荧光能量供体Eu3+cryptate和荧光能量受体XL665分别标记在特异检测细胞因子的两个抗体上，当抗体结合到细胞因子上，荧光能量供体被激发，能量转移到受体上，从而发射出荧光信号，根据标准曲线便可实验细胞因子的定量。

[0039]如图2所示，从左到右依次表示培养细胞，细胞处理，收集上清/稀释，加入HTRF试剂，读板。

[0040]步骤一，利用细胞培养板，设置细胞密度及培养体系对细胞进行培养；
[0041]步骤二，用药物处理细胞，通过优化刺激时间得到最强的信号；
[0042]步骤三，收集细胞上清，若细胞上清需要稀释，则配置标准曲线；
[0043]步骤四，将16ul细胞上清加入检测板中，加入4ul标记好的检测抗体混合液，室温孵育，所述检测抗体混合液标记了HTRF荧光能量供体和受体，其中两个标记了HTRF荧光能量供体和受体的抗体便会以夹心法的形式结合在待测样品上；
[0044]步骤五，用酶标仪读数，并分别用各自标准曲线计算出样品中各细胞因子浓度。

[0045]如图3所示，从图中可以看出，由于只有检测试剂不同且操作一致，因此可在同一个板上检测同一个样品中的不同细胞因子。

在图3中，从左到右分别检测的是人白介素2，人白介素1-beta，人肿瘤坏血因子，人肿瘤坏血因子，人白介素6，人干扰素gamma。

[0046]实施例一
[0047]如图4所示，图4表示的为地塞米松在丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和离子霉素共同作用下细胞因子的释放。

[0048]图4是用HTRF在同一个用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和离子霉素刺激的PBMC样品中检测到的白介素2(IL2)，白介素6(IL6)，肿瘤坏血因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)，从图4左边的图中可见，这种刺激很显著的增加了所有细胞因子的释放，与预期相符。

[0049]在本实施例中，丙二醇甲醚醋酸酯是一个小分子有机化合物，不需要细胞上受体的活化便可以直接穿透细胞膜，激活PKC酶。

离子霉素是一种钙离子载体，可以激活钙离子释放，从而激活下游的信号通路。

[0050]这两种化合物共同作用可以完全激活PBMC中所有细胞释放细胞因子，没有细胞类型的区分。

[0051]本实施例中，用HTRF在同一个用丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和离子霉素刺激的PBMC 样品中检测到的白介素2(IL2)，白介素6(IL6)，肿瘤坏血因子α(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)，从图4中左边的图可见，这种刺激很显著的增加了所有细胞因子的释放，与预期相符。

[0052]地塞米松是一种已知的细胞因子释放抑制剂，能显著的降低丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和离子霉素的作用。

如图，用地塞米松共处理细胞后，同样用HTRF检测多因子，从图4中右边的图中可以看出，地塞米松明显的抑制了50％-80％的激活所用。

[0053]实施例二
[0054]如图5所示，在地塞米松作用下，B细胞中细胞因子得到释放。

[0055]在本实施例中，LPS是一种PBMC中针对B细胞特异的刺激因子，用HTRF得到的实验结果正如预期，它刺激B细胞后，IL1beta，IL6和TNFalpha细胞因子的分泌显著增加。

用地塞米松共刺激后，可以有效逆转60％以上LPS的的刺激效果。

[0056]实施例三
[0057]如图6所示，在地塞米松作用下，T细胞中细胞因子得到释放。

[0058]在本实施例中，CD3和CD28抗体被广泛用来刺激PBMC中的T细胞，它刺激T细胞后，IL2和IFNgamma的分泌显著增加。

用HTRF得到的实验结果正如预期。

用地塞米松共刺激后，可以有效逆转90％以上CD3/CD28的刺激效果。

[0059]以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

图1
图2
图3
图4
图5
图6。