貉源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定与药敏试验

貉源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定与药敏试验
张召兴;耿田田;李蕴玉;贾青辉;张艳英;张香斋;李佩国;史秋梅
【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2016(052)007
【总页数】3页(P40-42)
【作者】张召兴;耿田田;李蕴玉;贾青辉;张艳英;张香斋;李佩国;史秋梅
【作者单位】河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604;河北科技师范学院河北省预防兽医学重点实验室,河北昌黎066604
【正文语种】中文
【中图分类】S855.1+2
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella Multocida）又称多杀巴斯德菌，多杀巴斯德菌含3个亚种，属于巴斯德菌属，可以引起人及多种动物发病[1]。

在动物的感染表现并有相应的专用疾病名称，如猪肺疫、毛皮动物巴氏杆菌病等[2]。

于爱红等[3]报道了该菌导致人手术切口感染。

可以导致人的不同器官感染[4]。

该病原菌发生无明显季节性、环境条件、饲养条件改变等不良因素致使机体的抵抗力下降，促进病
原菌大量增殖并引起发病[5]，造成严重的经济损失。

近几年，毛皮动物狐、貉、貂的细菌病种类多、血清型复杂，尤其是呼吸道性疾病往往与其他细菌混合感染[6]。

貉的巴氏杆菌病未见报道。

本试验从病貉肺脏、肝脏、心血等组织进行分离培养的多杀性巴氏杆菌进行药敏试验，测定其耐药谱，科学指导用药。

为下一步为预防和控制该病流行提供参考依据。

1.1 病料来源送检的病貉，无菌采集病貉肺脏、肝脏、心血等组织进行分离培养。

1.2 主要试剂DL-2 000 Marker、2×Taq Marker Mix、树脂型TM基因组DNA提取试剂盒，均购自北京康为世纪生物科技有限公司；ID32E肠道菌鉴定试条法国梅里埃（bioMerieuxsa）公司产品；常规的试剂有本实验室提供。

1.3 实验动物体重20 g左右健康昆明系小鼠8只，购自北京维通利华实验动物有限公司。

1.4 细菌分离纯化无菌采取无菌采集病貉肺脏、肝脏、心血等组织，划线接种于鲜血琼脂培养基，37℃恒温培养12～24 h。

1.5 细菌形态特征与培养特性无菌挑取上述纯化培养菌，再分别“Z”字形划线接种于鲜血琼脂培养基和普通琼脂培养基中，37℃培养18～24 h后，观察其生长情况。

选取优势生长菌落移接于营养肉汤进行纯培养供鉴定用。

1.6 细菌生化特性鉴定用ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化试验，用自动ATB 生化仪测定。

1.7 多杀性巴氏杆菌KMT基因的PCR扩增与测序按照树脂型TM基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取基因组DNA，参照文献[7]多杀性巴氏杆菌的KMT基因序列设计1对引物，P1：5′-TA⁃AAC-GAACTCGCCACT-3′，P2：5′－TGGGCTTGTC⁃GG-TAGTCTT-3′，预扩增片段为348 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以基因组DNA为模板进行PCR反应。

PCR扩增反
应体系（50 μL）：2×Taq Marker Mix 25 μL，ddH2O 19 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板4.0 μL。

反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，46℃退火50 s，72℃延伸50 s，72℃中延伸10 min，共30个循环。

取出5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶中，120 V电泳25 min，观察PCR扩增产物的条带。

将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测序结果与GenB⁃nak数据库中登录基因序列进行同源性比较分析。

1.8 致病性试验将实验小鼠分为2组，每组4只，每只小鼠0.2 mL
（1×109CFU/mL）腹腔注射；同时设生理盐水阴性对照。

观察发病及死亡情况，分离细菌并鉴定。

1.9 药敏试验按照美国临床检验标准委员会推荐的标准K-B纸片法进行试验和结果判断[8]。

2.1 细菌形态特征与培养特性鲜血琼脂平板培养，生长良好，可见均匀一致的灰白色、圆形、湿润，不溶血的露珠样小菌落，在普通琼脂上生长贫瘠。

涂片染色镜检，可见革兰氏阴性短杆菌，散在或成双，美蓝染色呈典型的两极浓染球杆菌，呈卵圆形，中央不易着色。

2.2 细菌生化特性鉴定采用自动ATB细菌鉴定仪，利用ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化鉴定，分离菌发酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、蔗糖、鼠李糖，精氨酸双水解酶阴性，鸟氨酸脱羧酶、接触酶、氧化酶为阳性，吲哚试验为阳性。

鉴定结果为多杀性巴斯德菌，评定结果合格率为99.5%。

2.3 多杀性巴氏杆菌KMT基因的PCR扩增与测序用多杀性巴氏杆菌种特异性KMT基因对该菌进行的PCR鉴定，扩增出大约为348 bp的目的条带，结果见图1。

PCR扩增产物经测序，与Gen⁃Bank DNA序列数据库中已发表的多杀性巴氏杆菌Kmt1基因（NO.AF016259）序列同源性为100%，确定该从病貉分离的菌株为多杀性巴氏杆菌。

2.4 致病性试验试验组小鼠24 h左右全部发病死亡。

分离培养鉴定、PCR检测，结果显示所分离菌与注射的病原细菌一致。

对照组4只小鼠健康存活，表明
该菌有一定致病性。

2.5 药敏试验药敏试验结果显示，分离菌对头孢噻呋、氟苯尼考、阿米卡星、
氧氟沙星、阿莫西林敏感；对复方新诺明、庆大霉素、卡那霉素、强力霉素等耐药，结果见表1。

根据《伯杰细菌鉴定手册》，多杀性巴氏杆菌，染色镜检，呈革兰阴性短杆菌，散在或成双，美蓝染色呈典型的两极浓染球杆菌，呈卵圆形，中央不易着色。

培养特性表明，了鲜血琼脂平板培养，长势良好，在普通琼脂上生长贫瘠。

生化试验鉴定：分离菌发酵葡萄糖、果糖、d-甘露醇产酸不产气，不发酵麦芽糖、蔗糖、鼠李糖；接触酶和氧化酶、鸟氨酸脱羧酶为阳性，吲哚试验为阳性。

通过培养特性、形态观察、生化鉴定，PCR方法检测特异性KMT基因，测序结果运用BLAST软件比对，与多杀性巴氏杆菌同源性为100%，确定多杀性巴氏杆菌。

通过人工感染小鼠致病性试验，试验组小鼠24 h左右全部发病死亡，分离培养鉴定、PCR检测，结果显示所分离菌与注射的病原菌一致。

对照组小鼠健康存活，证明该菌株具有致病性，是引起该貉肺炎主要病原菌，为临床治疗貉肺炎提供理论依据。

近年来，貉的犬瘟热、腺病毒等病毒性疾病的不断发生，细菌病也常常继发或并发感染[9]，其中多杀性巴氏杆菌病是毛皮动物主要的细菌性疾病之一。

为了提高养
貉效益，既要做好病毒性疾病的预防，又要对细菌性疾病进行防治。

改善卫生环境条件，提高机体抵抗力来抗御病原菌的攻击。

控制该病有效方法是免疫接种和药物治疗，多数养殖场只重视犬瘟热等病毒病疫苗的预防接种，忽略了该病的免疫，因而造成本病的多发。

多杀性巴氏杆菌易产生抗药性，导致药物治疗效果不明显。

药敏试验显示，14种抗生素中仅对头孢噻呋、阿米卡星、氟苯尼考等5种药物敏感；庆大霉素、强力霉素等耐药。

因此当养殖场发生疾病时，根据药敏试验结果进行科
学用药，才能获得良好的治疗效果。

【相关文献】
[1]房海，史秋梅，陈翠珍，等.人兽共患细菌病[M].北京：中国农业科学技术出版社，2012：422-446.
[2]杨正时，房海.人及动物病原细菌学[M].石家庄：河北科学技术出版社，2003：497-544.
[3]于爱红，王燕，张开玲，等.多杀巴斯杆菌致手术切口感染1 例[J].中华医院感染学杂志，2008，18（18）：1143.
[4]史莉，李萍，孙光成，等.多杀巴斯杆菌引起肺部感染1例[J].中华医院感染学杂志，2007，18（5）：548.
[5]Dugal F，Belanger M，Jacques M.Detection of Respiratory Pathogens in Porcine Lung Tissue and Lavage Fluid[J].Canadian Jouranl of Veterinary Research，1992，56：260-264.
[6]刘晓民，张海丰，王春明，等.貂链球菌和巴氏杆菌混合感染的分离与鉴定[J].黑龙江八一农垦大学学报，2006，18（3）：68-70.
[7]黄仆，代洪波，刘孟良.猪肺疫多杀性巴氏杆菌的分离鉴定[J].兽医导刊，2012，5（87）：56-63.
[8]National Committee for Clinical Laboartory Standards，Perfom⁃rance standards for antimicrobial disk and dilution susceptibility test for bacteria isolated from anima1s：approved standard[J].sec⁃onded，NCCLS document M31-A2.Wayne，USA，2000，49（21）：105-126.
[9]钱爱东，李影.毛皮动物疾病（兽医全攻略）[M].北京：中国农业出版社，2009：183-193，235-252.。