质粒抽提之应知应会

技术支持 - 抽提纯化基础质粒抽提之应知应会背景资料实验前方法/试剂的选择关于碱裂解法质粒抽提的 8 大窍门降低 RNA 残留的方法降低 gDNA 残留的方法降低蛋白质残留的方法降低质粒 Nick 的方法降低变性超螺旋的方法关于质粒多聚体提高得率的方法背景资料所有的质粒抽提方法首先都要考虑如下几点：如何去除 RNA，如何将质粒与细菌基因组 DNA 分开，如何去除蛋白质及其它杂质。

去除 RNA 相对比较简单，首先是使用 RNase 消化 (抽提中或者抽提后)。

经过 RNase 消化后，RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。

如果要彻底去除残留得 RNA，则需要更烦琐的操作。

将质粒与细菌基因组 DNA 分开，基本上是采用两种办法：一是利用酶/弱去污剂部分裂解细菌，在抽提时只让质粒从细菌中释放出来，而不让基因组 DNA 从细菌中出来，从而将质粒和基因组 DNA 分开；二是利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。

去除蛋白质及其它杂质，基本上是与去除细菌基因组同时实现的。

但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。

所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。

经过上面的处理，沉淀下来的质粒基本上可以用于酶切了。

如果要用于更高级的实验，如转染，则需要做进一步的纯化，如 CsCl 超离心。

(go top)实验前方法/试剂的选择首选方法是碱裂解法。

如果有问题，或者是大质粒 (>15 kb)，则用温和的方法 SDS 裂解法。

详细情况见“分子克隆”。

试剂盒几乎都使用碱裂解法，所以都有一个通病，抽提大质粒时效果不好。

(go top)关于碱裂解法质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。

关于碱裂解法的原理，复旦大学生化与分子生物学实验室的网站 () 有一篇专论，大家可以去看一下。

这是一篇美文，非常有趣。

文中提到了一个与几乎所有能查到的资料不同的观点，也是非常有启发的。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性；不适合大质粒的抽提。

碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了 (电泳时在超螺旋前面一点点，如果有一条带，就是此变性的质粒。

)。

所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。

(似乎可以做这么一个推理：在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。

理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是 100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能100% 配对复性。

) 碱裂解法不适合大质粒的抽提，原因也是因为该方法太剧烈，使超螺旋比例较低。

文献推荐的抽提大质粒的方法是温和得多的方法，缺点是得率要低一些。

现在得问题是，大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率再不高的话，抽提起来就很费力了。

如果注意到在碱裂解法中，超螺旋比例随着碱裂解时间的延长而降低，随着粘稠度的增加而减低这个现象，完全可以使用碱裂解法来抽提大质粒的：增加试剂的使用量，使加入 NaOH/SDS 液后，溶液在 1 分钟内就能变得很清澈；立即加入中和试剂。

这个实验我们没有做过，但 QIAGEN 抽提大质粒用的就是碱裂解法。

(go top)质粒抽提的 8 大窍门1：摇菌时间 - 过夜培养是一个普遍接受的概念，而且适合大部分情况。

如果出现了问题，调整培养时间会有帮助：Nick 多，则增加培养时间；酶切出现问题，则减少培养时间。

2：起始菌体量 - 大家习惯说“从多少 ml 菌液中抽提质粒”，但一定要养成每次都观察菌体量的习惯，因为质粒毕竟是在菌体中，而且，抽提质粒所用的试剂量，都只与菌体量有关。

3：菌体的彻底悬浮 - 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成一个外围几乎彻底裂解，往里不完全裂解，中间没有裂解的团块。

这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

4：使用相对过量的试剂 - 这是适合所有核酸抽提的建议。

试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。

如果认为这样不经济，就少用一点菌体。

5：裂解时间 - 加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。

体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。

如果体系不马上变清澈，下次少用一点菌液，或者多用一点溶液。

如今的质粒设计得越来越复杂了，奇怪的现象也越来越多，而所有的奇怪现象，多与裂解时间有关。

6：中和的操作 - 在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。

效果非常好。

7：中和后的离心去蛋白 - 一定要将蛋白质彻底离心下去。

如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。

(go top)降低 RNA 残留的方法RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。

在溶液 I 中加入高浓度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低 RNA 残留，但都不能彻底去除。

幸运的是，RNA 的残留并不影响酶切等最常用的用途。

如果想彻底去除 RNA 残留，可以用试剂盒，或者使用对 4 个碱基都作用的 RNase。

(go top)降低 gDNA 残留的方法gDNA 的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。

gDNA 越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断 gDNA。

裂解体系越粘稠，gDNA 越容易被扯断；操作手法越重，gDNA 也越容易被打断。

温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低 gDNA 残留的最好方法。

(go top)降低蛋白质残留的方法蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。

虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。

只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。

当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

(go top)降低质粒 Nick 的方法细菌收获时间，菌株的选择，抽提操作的剧烈程度是影响 Nick 的三个主要因素。

细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick 的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。

如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的 Nick。

加入溶液 II 及加入溶液 III 的混匀操作，也可以导致一些 Nick，但影响不会比前两者大。

(go top)降低变性超螺旋的方法理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。

之所以大家没有非常在意，一是因为它的存在似乎对酶反应没有任何影响，二是因为它的含量并不一定高到被用电泳观察到。

抽提使用相对过剩的溶液，在加入溶液 II 后，体系能在 1 分钟内变澄清，再快速加入溶液 III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。

(变性超螺旋电泳时比正常超螺旋跑得快一点点。

) (go top)关于质粒多聚体QIAGEN 提供了一个没有进一步解释的观察：从有些宿主菌中抽提质粒 (pTZ19)，电泳能发现很多条带；但使用单酶切后，仍然变成一条带，大小正好是线性单质粒的大小。

根据这一观察，可以推理如下：那些大的条带(质粒多聚体)是由完整的单质粒“粘”在一起形成的，而不是我的一条链与你的一条链复性在一起；第二，这种“粘”只是部分的，否则酶切会有问题；第三，这种“粘”是脆弱的，线性后的刚性足以打破它。

如果是这样，质粒多聚体的出现与质粒的结构及序列有关，可以不管它(也管不了)，因为它不影响酶切，或者说，即使质粒多聚体切不动，也不会影响太大。

总之，碰到这种情况，不要简单地认为有问题，而是应该一步一步往下做，但一定要做完一步，检测一次，看一看结果与预期的吻合程度。

(go top)提高得率的方法利用氯霉素抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在低拷贝质粒的培养过程中添加氯霉素可以大大提高得率。

(go top)为什么酶切后质粒总是降解？酶切后质粒降解的原因很多，但如果用实验方法排除了质粒的质量及酶的质量因素后 (用 A 酶能成功，用 B 酶失败，但 B 酶能成功用于其它质粒。

)，仍然不能解决此问题，就只能从质粒的构造上去找原因了。

为什么质粒抽提得率低？伴随有 RNA 污染：菌体过量、RNase A 失效。

起始菌体过量是导致抽提失败的最主要因素。

菌体过量将导致的问题有：得率低 (RNA 与质粒 DNA 竞争吸附)，RNA 污染 (RNase A 相对量不足，不能在规定时间内降解所有的 RNA)，超螺旋比例低 (菌体过量使溶液非常粘稠，为混匀溶液所需要的外力很容易破坏超螺旋)。

确保成功的关键是：如果从 1.5 ml 菌液中抽提出来的质粒足够实验所需，绝对不要使用 3.0 ml 起始菌液。

在实验操作过程中，下列现象提示菌体过量：加入 P2 混匀，静置 2 分钟后，如果溶液没有变成透明，或者溶液看起来虽然已经变成透明，但转动离心管时发现溶液太粘稠或者不均匀。

加入 P3 后，不能完全混匀，有大块物形成。

离心时很难使之离至管底。

没有 RNA 污染：将上清移入吸附柱时，吸入了絮状蛋白质。

如果在步骤 4“将上清移入吸附柱”操作中，吸入了絮状蛋白质，那么，离心时絮状蛋白质将覆盖在吸附膜的表面，离心时难将液体离下。

在加入 T1 洗脱时，将发现 T1 不能很快渗入吸附膜中，而是一直处在吸附膜表面。

此时用一个干净的吸嘴轻轻在吸附膜的表面来回划几次可以使 T1 进入吸附膜中，这时可能出现两种情况：最终获得 DNA，但伴随蛋白质的污染；仍然没有多少 DNA。

蛋白质污染的可能后果是酶切时 DNA 出现非特异降解。

质量低基因组 DNA 污染：可能的原因有三：加入 P2 后室温放置时间超过 4 分钟、加入 P2 和 P3 后混匀动作不温和，菌体过量。

RNA 污染：菌体过量、RNase A 失效。

超螺旋比例太低：加入 P2 后室温放置时间超过 5 分钟、加入 P2 和 P3 后混匀动作不温和，宿主菌含内源核酶，菌体过量。

酶切产物弥散：抽提所得的质粒被蛋白质污染，内切酶被污染。

样品上柱后离心不下去样品中有大量蛋白质污染。