甲基泼尼松龙对油酸制备大鼠急性肺损伤模型干预治疗作用的研究

甲基泼尼松龙对油酸制备大鼠急性肺损伤模型干预治疗作用的
研究
田巍;赵斌
【摘要】目的探讨及验证甲基泼尼松龙对油酸诱导大鼠急性肺损伤模型的治疗作用.方法雄性SD大鼠30只随机分为3组:空白对照组(n=6)、油酸造模组(n=12)、甲基泼尼松龙组(n=12).对油酸制备大鼠急性肺损伤模型的基础上,对急性肺损伤大鼠进行糖皮质激素干预实验,以大体标本病理改变、光镜下半定量肺损伤评分(IQA)、肺湿/干重比(W/D)、动脉血氧分压(PaO2)、血浆及肺组织SOD和MDA为观察
检测指标,同时检测其他相关生化指标(血浆及肺组织MMP-9和TIMP-1),以期对糖皮质激素治疗的过程进行客观评估,进而探讨其作用途径和机制,为探讨ALI的药物
干预研究提供实验依据.结果大体标本病理改变:油酸造模组较甲基泼尼松龙组双肺体积明显增大,肺外周可见片状出血及充血水肿.光镜下,油酸造模组大鼠的肺部组织较甲基泼尼松龙组存在明显病理学改变,可见肺间质和肺泡水肿,肺泡腔内渗出浆液
性物质及大量的炎性细胞和红细胞,部分肺间隔增厚,呈现均匀红染的透明膜样改变.动脉血氧分压(PaO2):与空白对照组比,2、6h时,油酸造模组PaO2明显下降(P＜0.01),6h时甲基泼尼松龙组PaO2有升高(P＜0.05).肺湿干重比(W/D):与空白对照组比,2、6h时,油酸造模组W/D明显升高(P =0.000),与油酸造模组比,2、6h时,甲基泼尼松龙组有明显下降(P＜0.05).光镜下半定量肺损伤评分IQA:与空白对照组比,2h、6h时,油酸造模组IQA明显升高(P＜0.01).甲基泼尼松龙组与造模组对
比,IQA降低(P＜0.05).甲基泼尼松龙组与造模组对比血浆及肺组织SOD含量明显
升高(P＜0.01).甲基泼尼松龙组与造模组对比血浆及肺组织MDA明显降低(P＜
0.05).甲基泼尼松龙组与造模组对比血浆及肺组织MMP-9含量降低(P＜0.05).与
油酸造模组比较,甲基泼尼松龙组血浆及肺组织TIMP-1含量升高(P＜0.05).结论
甲基泼尼松龙干预治疗对急性肺损伤模型大鼠有明显的疗效,其可能部分通过对急
性肺损伤大鼠血浆和肺组织SOD、MDA、MMP-9和TIMP-1的调节,来改善动脉血PaO2、W/D、IQA,而发挥抗炎、抗渗出作用,从而为临床防治急性肺损伤提供
可能的途径和思路.
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2016(045)012
【总页数】5页(P27-31)
【关键词】甲基泼尼松龙;急性肺损伤大鼠;超氧化物歧化酶(SOD);丙二醛(MDA);基质金属蛋白酶明胶酶B(MMP-9);金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)
【作者】田巍;赵斌
【作者单位】100035 北京积水潭医院干部科;100035 北京积水潭医院干部科
【正文语种】中文
【中图分类】R3
急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征是ICU最常见的以失控炎性反应为根本发病原因的危重症疾病。

虽然近年来机械通气等支持技术的不断进展，ALI仍有较高的病死率[1,2]。

ALI药物治疗前景不容乐观，其中糖皮质激素的应用时机、适应证面临巨大争议。

本研究旨在对油酸制备大鼠急性肺损伤模型的基础上，对急性肺损伤大鼠进行糖皮质激素干预实验，以大体标本病理改变、光镜下半定量肺损伤评分(IQA)、肺湿/干重比(W/D)、动脉血氧分压(PaO2)、血浆及肺组织SOD和MDA
为观察检测指标，同时检测其他相关生化指标(血浆及肺组织MMP-9和TIMP-1)，以期对糖皮质激素治疗的过程进行客观评估，进而探讨其作用途径和机制，为探讨
ALI的药物干预研究提供实验依据。

1.材料:甲基泼尼松龙(批准号：NF0636，辉瑞制药有限公司)；油酸，分析纯(批准号：20140614，北京益利精细化学品有限公司)。

2.实验过程：雄性SD大鼠30只，体重200～250g。

大鼠随机分为空白对照组(n=6)、油酸造模组(n=12)和甲基泼尼松龙组(n=12)，空白对照组和油酸造模组
分别静脉注射0.1ml/kg的生理盐水和0.1ml/kg的油酸，甲基泼尼松龙组静脉注
射0.1ml/kg的油酸30min之后静推甲基泼尼松龙5mg/kg；空白对照组以6h为观察点，其他两组被均分为2h和6h两个观察点，在每个观察点注射麻醉处死大
鼠(1.25%戊巴比妥钠,50mg/kg腹腔注射)，留取血液和相关组织标本，冷冻保存
用于测试。

3.观察和检测指标:(1)肺湿/干重比计算(W/D):取右肺上叶组织，滤纸吸干水分后称量湿重；之后放置于80℃恒温烤箱中，48h烤至恒定后称量干重；计算肺湿/干重比值(W/D)。

(2)肺组织形态学观察(IQA)[1]:右肺中叶以甲醛(10%)固定，分别采用石蜡包埋和HE染色体切片，在100倍光学显微镜下观察，每组选取相同数量的
玻片(6张)和相同数量的视野(10个)，使用如下标准评定病变程度，每一组的不同玻片、不同视野取均值作为肺损伤的组织学半定量评价指标(index of quantitative assessment, IQA)。

肺组织无充血水肿改变、无RBC和PMN浸润、无透明膜形成评分为0分；肺组织轻度充血水肿改变、偶见RBC和PMN浸润、
偶见局限透明膜形成评分为1分；肺组织中度充血水肿改变、RBC和PMN部分
充盈肺泡、透明膜见>20%肺泡评分为2分；肺组织显著充血水肿改变，RBC和PMN几乎充满肺泡腔，透明膜见> 50%肺泡评分为3分。

(3)动脉血氧分压(PaO2)测定:血气针穿刺腹主动脉，取出血液1ml，使用PHOX血气分析仪测定动脉血氧分压。

(4)血浆及肺组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)测定:动脉血经抗凝(肝素)后离心5min(3000r/min)，取上清液冷冻保存(-70℃)；称重0.1g肺组织，
加入PBS 1ml后用匀浆器(20000r/min)处理10s，每匀一个标本用去离子水冲洗
钻头，4℃低温离心(3000r/min)后取出上清液冷冻保存(-70℃)备测。

按照试剂盒说明书的方法检测血浆和肺组织匀浆的SOD活性和MDA含量。

(5)血浆及肺组织MMP-9、TIMP-1测定:动脉血抗凝(肝素)后离心5min(3000r/min)，取出上清液
冷冻保存(-70℃)；称重0.1g肺组织加入PBS 1ml，用匀浆器(20000r/min)处理
10s，每匀一个标本用去离子水冲洗钻头，4℃低温离心(3000r/min)后取出上清
液冷冻保存(-70℃)备测。

按照试剂盒说明书的方法检测血浆和肺组织匀浆的
MMP-9、TIMP-1含量。

4.统计学方法：统计分析软件使用SPSS 11.5，实验数据以均数±标准差(±s)的方
式进行表示，多组样本比较采用单因素方差的方式进行分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.病理改变:大体标本观察空白对照组的大鼠双肺呈现粉红色，表面光滑，弹性良
好(图1)，肺泡灌洗液清亮。

油酸造模组则双肺体积明显增大，肺外周可见片状出
血及充血水肿(图2)。

肺泡灌洗液呈现粉红色，气管内溢出粉红色分泌物，有的标
本可见血性胸腔积液。

与油酸造模组相比，甲基泼尼松龙组大鼠的肺表面充血程度明显减轻，气管内溢出的粉红色分泌物减少。

光镜下病理改变空白对照组大鼠无肺组织学异常，肺泡壁结构完整，无肺泡腔液体渗出，未见炎性细胞浸润及红细胞渗出(图3A)。

油酸造模组大鼠的肺部组织存在
明显病理学改变，可见肺间质和肺泡水肿，肺泡腔内渗出浆液性物质及大量的炎性细胞和红细胞，部分肺间隔增厚，呈现均匀红染的透明膜样改变(图3B)。

与油酸
造模组比较，甲基泼尼松龙组大鼠肺泡腔内炎性细胞渗出明显减轻(图3C)。

2.动脉血氧分压(PaO2)、肺湿/干重比(W/D)、肺损伤评分(IQA)变化：(1)动脉血
氧分压(PaO2): 与空白对照组比，2、6h时，油酸造模组PaO2明显下降(P<0.01)。

与油酸造模组比，2h甲基泼尼松龙组PaO2有升高的趋势(P>0.05), 6h时甲基泼
尼松龙组PaO2有升高(P<0.05)。

(2)肺湿/干重比(W/D)：与空白对照组比，2、6h时，油酸造模组W/D明显升高(P=0.000)，甲基泼尼松龙组与油酸造模组对比W/D明显降低(P<0.01)。

(3)肺损伤评分(IQA)：与空白对照组比，2、6h时，油酸造模组IQA明显升高(P<0.01)，与油酸造模组比较，甲基泼尼松龙组IQA明显降低(P<0.01，表1)。

3.血浆和肺组织SOD、MDA变化:(1)血浆和肺组织SOD含量变化：油酸造模组与空白对照组比，2h及6h两个观察点的血浆及肺组织SOD含量明显降低
(P<0.05)；甲基泼尼松龙组与油酸造模组比，2h及6h两个观察点的血浆SOD含量明显升高(P<0.01,表2)。

(2)血浆和肺组织MDA含量变化：油酸造模组与空白对照组比，2h及6h观察点的血浆及肺组织MDA含量明显升高(P<0.01)；甲基泼尼松龙组与油酸造模组比， 2h及6h观察点的肺组织MDA明显降低(P<0.05或P<0.01,表3)。

4.血浆和肺组织MMP-9、TIMP-1变化:(1)血浆和肺组织MMP-9含量变化：油酸造模组与空白对照组比，2h及6h两个观察点的血浆及肺组织MMP-9含量明显升高(P=0.000)；甲基泼尼松龙组与油酸造模组比，2h及6h两个观察点的肺匀浆MMP-9含量明显降低(P<0.05,表4)。

(2)血浆和肺组织TIMP-1含量变化：油酸造模组与空白对照组比，2h及6h观察点的血浆及肺组织TIMP-1含量明显降低(P=0.000)；甲基泼尼松龙组与油酸造模组比较，无明显变化(P>0.05,表5)。

ALI的本质是各种致病因素所引起的全身炎性反应综合征在肺部的表现[1，2] 。

炎性细胞被激活后，释放出大量的花生四烯酸代谢产物及氧自由基等，导致了机体炎症/抗炎间的失衡，损伤了肺部毛细血管的内皮细胞。

炎性细胞还能激活补体、凝血和纤溶系统，诱发其他炎性介质的释放，产生级联和瀑布效应，形成恶性循环，最终发展为ARDS，这也可能是ARDS难以治疗的重要原因[3]。

油酸诱导的ALI 是一个经典的ALI动物模型，低氧时可见肺泡腔的水肿，以及点、片状的渗出和
出血，肺小动脉管壁和平滑肌层出现明显增厚，管腔出现狭窄[4～6] 。

本研究表明，ALI大鼠在2h和6h观察点均可见肺部组织严重充血水肿、出血，在光学显
微镜下可见大量PMN、RBC的渗出，并伴有肺泡间隔增厚，形成均匀红染的透明膜样结构。

肺部组织的W/D、IQA均显著增加，提示肺含水量增加,血气分析
PaO2 显著下降。

符合ALI的临床特征，表明ALI模型制备成功。

糖皮质激素在前期临床研究中被寄予厚望，但在随后的研究中面临困境。

在临床上，可以通过使用糖皮质激素改善急性肺损伤患者的炎症、水肿，但是大量使用糖皮质激素经常会造成感染加重，水钠潴留。

即便如此，在很多的动物实验和临床观察
中仍作为一些新型干预药物如他汀类药物及七叶皂苷钠等中药制剂的对照用药[7] 。

在临床救治过程中也是被频繁采纳的治疗手段。

ALI本身发病机制的复杂性才是问题的关键，失控的炎性反应、氧化应激失衡等多种机制参与了ALI的发生、发展。

而糖皮质激素针对这一病理生理过程进行干预，其丰富的药理学活性有可能成为其起效的原因。

因此笔者对其进行了相关作用机制探讨。

SOD和MDA作为一对指标，常被用来共同反映人体自由基代谢变化。

炎性反应
越强烈，自由基生成的越多，组织损伤也就越加严重。

此时，体内SOD很难清除掉过度产生的自由基，这就导致了SOD的急剧消耗，MDA的生成也相应增多，
这可能是在发病的早期，患者血液中的SOD 含量下降和MDA 含量升高的主要原因，由此可以认为氧化应激损伤在ALI的发生、发展中占重要地位[8，9] 。

同时
相关研究表明，MMP-9表达的增加是由多种原因引起肺部组织损伤的共同病理生理表现，这提示了在各种肺部损伤的形成过程中，MMP-9均可能起着重要作用。

在ALI的过程中，存在着TIMP-1和MMP-9的失衡，应用TIMP-1可以减轻肺
损伤的程度[10～12] 。

因此，本试验试图从SOD、MDA和MMP-9、TIMP-1切入，探讨甲基泼尼松龙对油酸诱导急性肺损伤的作用机制。

结果显示，与油酸造模组比，2h及6h时，甲基泼尼松龙组血浆及肺组织SOD明显升高(P<0.05，
P=0.01，P=0.000)。

上述结果提示，甲基泼尼松龙可通过调节血浆和肺组织SOD、MDA及MMP-9、TIMP-1活性或含量，而改善急性肺损伤大鼠肺部病理损伤、PaO2、W/D及IQA，考虑甲基泼尼松龙可通过影响急性肺损伤大鼠体内氧化应激反应及肺部炎症、损伤过程中细胞外基质的分解和重塑而产生抗炎、抗渗出作用。

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