紫外分光光度法测定当归补血汤中的总苷含量

紫外分光光度法测定当归补血汤中的总苷含量
严安定;高建;王培培;夏泉;许杜娟
【摘要】目的建立用紫外分光光度法测定当归补血汤中总苷含量的方法.方法采用紫外分光光度法,以黄芪甲苷为对照品,在波长540 nm处测定当归补血总苷含量.结果黄芪甲苷的线性范围为4.167-41.667 μg*ml-1(r2= 0.9986),平均回收率为99.3%,RSD=0.74% (n=5).结论本方法准确、简便、快速可行,适用于当归补血汤中总苷的含量测定.%Objective To establish a method for the determination of the total glucosides of Danggui Buxue tang by UV spectrophorntometry. Methods Based on the reference substance of astragloside IV, the determination was performed by UV spectrophotometry at the rnwavelength of 540 nm. Results The calibration culve of the absorbence was linear with the concentration of astragloside IV in the range of 4.rn167 -41.667μg · ml-1 (γ2 =0.9986). The average recovery rate of astragloside IV was 99.3％ with the RSD of 0.74％ (n=5). Conclurnsion The method is accurate, simple, fast, feasible and can be applied to the determination of total glucosides of Danggui Buxue tang.
【期刊名称】《安徽医学》
【年(卷),期】2011(032)005
【总页数】3页(P636-638)
【关键词】紫外分光光度法;当归补血总苷;黄芪甲苷;含量测定
【作者】严安定;高建;王培培;夏泉;许杜娟
【作者单位】230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院药剂科,国家中医药管理局中药化学三级实验室(TCM-2009202);230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院药剂科,国家中医药管理局中药化学三级实验室(TCM-2009202);230032,合肥,安徽医科大学药学院;230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院药剂科,国家中医药管理局中药化学三级实验室(TCM-2009202);230032,合肥,安徽医科大学药学院;230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院药剂科,国家中医药管理局中药化学三级实验室(TCM-2009202);230032,合肥,安徽医科大学药学院;230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院药剂科,国家中医药管理局中药化学三级实验室(TCM-2009202);230032,合肥,安徽医科大学药学院
【正文语种】中文
当归补血汤出自《内外伤辩惑论》,为金元四大家之一李东垣所创制,由黄芪、当归以5∶1的配伍组成,功能补气生血,主治劳倦内伤、气弱血虚、阳浮外越[1,2],黄芪是该复方的君药。

现代研究表明[3,4],黄芪总皂苷是黄芪中的主要有效成分,而黄芪甲苷作为黄芪中的指标成分,在中国药典中作为黄芪质量控制的定量指标。

苷类成分是当归补血汤发挥药理作用的物质基础,也是质量控制常用的指标物,结合本方组成的特点,笔者通过研究建立了测定当归补血汤中总苷含量的 UV法,发现用黄芪甲苷标定总苷成分含量,二者最大吸收基本一致,为有效地控制其质量提供了依据,从而为该方的进一步开发应用奠定基础。

1 材料与方法
1.1 仪器 CTG-10提取器(湖南省衡阳市药物机械厂);TU-1800SPC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Ts14-2型光学读数天平,湘仪天平仪器厂产品。

电子天平 BP211D,德国 Sartarius。

旋转蒸发仪 RE-52-98,上海亚荣生化仪器
厂。

大孔吸附树脂柱(Φ1.5 cm×30 cm,Φ5.0 cm×80 cm),中国科学技术大学玻璃仪器厂。

1.2 试药黄芪、当归均购于安徽医科大学第一附属医院中药房,经安徽中医学院彭华胜副教授鉴定分别为豆科植物膜荚黄芪 Astragalus
membranaceus(Fisch.)Bge.的根和伞形科植物当归 Angelicasinensis(Oliv.)Diels 的根。

两味药材经切片后60℃减压干燥 12 h后,打成粗粉置干燥器内备用。

黄芪甲苷标准品(中国药品生物制品检定所,批号(0781-200210);双蒸水自制,其余试剂均为分析纯。

1.3 实验方法
1.3.1 当归补血总苷的制备[5-7] 取黄芪、当归药材粗粉,精确称量黄芪、当归(5∶1)1 200 g,10倍量 70%乙醇回流提取 2次(每次 2 h),合并醇提液趁热抽滤并浓缩,减压回收乙醇,浓缩物加适量蒸馏水使溶解,用水饱和的正丁醇(1∶1)萃取 4次;合并正丁醇萃取液,回收正丁醇后60℃减压干燥得粗总苷 72 g(得率为 6.0%)。

大孔吸附树脂吸附后,分别以蒸馏水,40%乙醇和 70%乙醇洗脱,收集 70%乙醇洗脱液并浓缩,浓缩物回收乙醇并60℃减压干燥得到棕黄色粉末,即得。

1.3.2 样品溶液的制备精密称取当归补血粗总苷约 10mg,置 25 ml容量瓶中,加无水乙醇溶解并稀释至刻度,作为供试品溶液。

1.3.3 对照品溶液的制备精密称取黄芪甲苷标准品 5.0mg,置于 10m l的容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得。

2 结果
2.1 吸收曲线[8-10] 吸取供试品溶液及对照品溶液各 0.2m l,加无水乙醇补足体积至 0.5 ml,再分别加入8%的香草醛无水乙醇试液 0.5m l和 72%的硫酸 5.0 m l摇匀,立即放入62℃恒温水浴中,保温 20m in后,置冷水浴中冷却至室温,以试剂作空白对照,用紫外分光光度计在 400～700 nm范围扫描。

黄芪甲苷与供试品在 540
nm波长均有最大吸收(图 1和 2),故选择540 nm为测定波长。

图 1 当归补血总苷紫外吸收图谱
图 2 黄芪甲苷对照品紫外吸收图谱
2.2 标准曲线精密吸取对照品溶液 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 ml,置具塞试管中,加无水乙醇补足体积至 0.5 ml,再分别加入 8%的香草醛无水乙醇试液 0.5m l 和 72%的硫酸 5.0 ml摇匀,立即放入62℃恒温水浴中,保温 20 min后,置冷水浴中冷却至室温,于 540 nm波长处测吸光度。

同时以随行试剂作空白。

以吸光度(Y)为纵坐标,黄芪甲苷的浓度μg◦m l-1(X)为横坐标,绘制标准曲线(图 3),计算回归方程为:Y=0.0035 X-0.0032,r2=0.9986。

其中黄芪甲苷对照品的浓度范围为 4.167-41.667μg◦ml-1,说明黄芪甲苷在此浓度范围内呈良好的线性关系。

图 3 黄芪甲苷标准曲线
2.3 试验回收率精密量取 0.1 ml供试品溶液,再精密加入0.1m l黄芪甲苷对照品溶液(25μg/ml),按供试品溶液项下方法制备得供试品溶液,依法在 540 nm处测定吸光度,由回归方程计算回收率,结果见表 1。

回收率 =[测得量(mg)-样品中含量(mg)]/加入对照品的量(mg)×100%。

表 1 回收率试验结果(n=5)编号样品量(μg)含黄芪甲苷量(μg)加入黄芪甲苷量(μg)测得总量(μg)回收率(%)1 40.8 2.7 2.5 5.18 99.6 2 40.8 2.7 2.5 5.12 98.5 3 40.8 2.7 2.5 5.14 98.8 4 40.8 2.7 2.5 5.17 99.4 5 40.8 2.7 2.5 5.22 100.4统计学处理χ2=99.3% RSD=0.74%
2.7 样品测定 3批当归补血粗总苷中当归补血苷的含量以黄芪甲苷计算,含量分别为 85.4%、87、3%和 86.2%,平均含量为 86.3%,RSD为 1.1%。

3 讨论
当归补血汤由黄芪和当归两味中药组成,成分较复杂,用 HPLC法测定复方中单一成分含量不能很好地控制其质量。

方中黄芪是该复方的君药,黄芪总皂苷是黄芪中的
主要有效部位,而黄芪甲苷作为黄芪中的指标成分,在中国药典中作为黄芪质量控制的定量指标。

故本研究采用紫外法测定其中总皂苷的含量测定方法,直接测定的结果即为复方中总苷类成分的含量,以总苷来考察当归补血汤质量的稳定和可控性,比单一成分指标全面,更符合中医药理论。

该方法简便、快速、准确、可行,是测定黄芪及其复方制剂中总皂苷含量较理想的方法。

当归补血汤为益气活血的经典名方,黄芪、当归的主要活性成分基本明确,且也有较成熟的定量方法。

本研究的目的主要是考察实验中所提取的当归补血总苷质量是否稳定、可控。

结果表明,3个不同批次的当归补血总苷的平均含量为 86.3%,RSD为1.1%,说明总苷质量基本稳定,该法能有效体现出当归补血总苷的特征性和专属性。

该方法可控,重现性良好,能准确地评价当归补血总苷的质量,为有效控制当归补血总苷的质量提供了初步的试验依据。

参考文献
(2011-01-30收稿 2011-02-27修回)
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