开郁清热方改善胰岛细胞凋亡的实验研究

开郁清热方改善胰岛β细胞凋亡的实验研究
宋军，仝小林，赵林华，姬航宇
（中国中医科学院广安门医院，北京100053）
摘要：目的：验证开郁清热方改善胰岛β细胞的作用。

方法：离体实验采用INS －1胰岛细胞系进行培养，通过高
糖的方法造成胰岛功能障碍的模型，分别给予正常鼠血清、小剂量开郁清热方、大剂量开郁清热方、罗格列酮进行干预，
别设立空白组和模型组进行对照，用流式细胞仪检测细胞凋亡，免疫组化法检测凋亡相关指标Bax 、
Bcl －2、p53。

结果：开郁清热方大剂量组能有效降低胰岛β细胞凋亡率，减少Bax 、p53含量，增加Bcl －2含量（P ＜0.05），作用效果与罗格
列酮组近似。

结论：开郁清热方能有效改善胰岛β细胞凋亡。

关键词：开郁清热方；细胞凋亡中图分类号：R587.1文献标志码：B 文章编号：1000－1719（2013）02－0360－03收稿日期：2012－08－13
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81001513）
作者简介：宋军（1980－），男，博士，研究方向：中医内分泌、心血管疾病
的研究。

通讯作者：仝小林（1958－），男，博士研究生导师，主任委员，博士，研究
方向：中医内分泌学研究。

糖尿病作为最常见的慢性非传染性疾病之一，严
重危害人类健康。

开郁清热方是中国中医科学院广安门医院仝小林教授集古人和其多年临床经验总结而成，组方为柴胡、白芍、黄芩、清半夏、枳实、大黄等。

本课题旨在研究开郁清热方改善细胞凋亡，改善胰岛β细胞功能的机制。

1研究方法1.1材料
1.1.1细胞、药物
细胞：INS －1细胞购自上海微科生化试剂有限公司。

药物：开郁清热方由天津天士力集团提供；罗格列酮购自太极集团重庆涪陵制药厂有限公司。

1.1.2主要试剂及仪器
兔抗大鼠多克隆抗体p53，
Bax ，Bcl －2（武汉博士德有限公司，稀释度1ʒ100），软脂酸、牛血清白蛋白BSA （Sigma ），RPMI 1640培养基（Gibco ），Image Pro.Plus 图像分析软件。

1.2方法
1.2.1含药血清的制备
开郁清热方水煎剂，按临床成人（60kg ）每天服用生药10倍给SD 大鼠灌胃，即每天给药剂量=人每天治疗剂量ˑ动物等效剂量系数ˑ10倍。

每只每次给
药2mL （每1mL 水煎液含1g 生药），
每日2次，连续3d ，生理盐水对照组给以同剂量的生理盐水。

末次灌胃前禁食12h 。

末次灌胃后1h ，腹主动脉采血，静置2h ，3000r /min 离心15min ，分离血清，经56ħ，30min 灭活处理后，用0.45μm 微孔滤膜过滤除菌，置－20ħ保存备用。

1.2.2模型的建立及分组
（1）正常组：取同代INS －1细胞置于含完全1640培养基培养5d ，后以完全1640培养基换液继续培养2d 。

（2）模型组：取同代INS －1细胞置于含高浓度软
脂酸0.5mmol /L +高浓度葡萄糖20mmol /L 的培养液内培养5d ，后以完全1640培养基换液继续培养2d 。

（3）小剂量组：取同代INS －1细胞置于含高浓度葡萄糖20mmol /L 内培养5d ，后以10%含药血清的完全1640培养基继续培养2d 。

（4）大剂量组：取同代INS －1细胞置于含高浓度葡萄糖20mmol /L 内培养5d ，后以15%含药血清的完全1640培养基继续培养2d 。

（6）血清对照组：取同代INS －1细胞置于含高浓度葡萄糖20mmol /L 的培养液内培养5d ，后以正常鼠血清的完全1640培养基继续培养2d 。

（7）罗格列酮组：取同代INS －1细胞置于含高浓度葡萄糖20mmol /L 内培养5d ，后以含10μmol /L 罗格列酮的完全1640培养基继续培养2d 。

每组复孔5个。

1.2.3指标检测
1.2.3.1流式细胞仪检测细胞凋亡细胞接种于6孔培养板。

以不含EDTA 的胰酶消化并收集各组细胞，预冷PBS 洗涤2次后，加入结合缓冲液300μL /管，振荡重悬细胞，每管分别加入5μLAnnexin V －FITC 及Propidium Iodide 染料，避光反应15min ，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.3.2细胞免疫化学法检测收获细胞，吸去上清
液，
PBS 洗5min ˑ3次，0.3%H 2O 2室温作用30min ，PBS 洗5min ˑ3次，正常山羊血清室温封闭30min ，
倾去血清，直接加兔抗大鼠多克隆抗体p53，
Bax ，Bcl －2（博士德，稀释度1ʒ100），4ħ湿盒过夜。

PBS 洗5min ˑ3次，滴加二抗工作液，37ħ20min ，PBS 洗5min ˑ3次，PBS 洗5min ˑ3次，DAB 显色，光镜下确定染色时间，蒸馏水中止染色，照相。

细胞核染色成棕褐色和棕黄色为阳性，采用Image Pro.Plus 图像分析软件，在高倍视野下（ˑ200），选择5个视野分别测定
细胞的平均光密度值［95］。

1.2.4统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行统计学处理，所有数据均用（珋x ʃs ）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。

2结果
2.1流式细胞仪测定胰岛β细胞凋亡率
结果见表1，图1 6。

2.2开郁清热方对Bax 、Bcl －2、p53的影响
图1
空白组图2
模型组
图3
血清对照组图4
小剂量开郁清热方组
图5
大剂量开郁清热方组
图6罗格列酮组
3
讨
论
3.1Bcl －2家族蛋白与细胞凋亡
Bcl －2家族蛋白主要定位于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，
分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两类。

其中抗凋亡蛋白包括Bcl －2、
Bcl －xl 、Bcl －w 、Mcl －l 等，促凋亡蛋白包括Bax 、
Bak 、Bad 、Bid 、Bim 等。

其中Bcl －2及Bax 发挥了重要的作用。

Bcl －2基因与Bax 基因位于线粒体、核膜和内质网膜，两基因有40%的同源性。

Bcl －2是一个抗凋亡基因，可抵抗多种形式的细胞凋亡，当细胞中Bc1－2蛋白以同源二聚体的形式存在时，细胞趋向于存活；Bax 作用与Bc1－2相反，起着加速细胞凋亡的作用。

Bc1－2能通过与Bax 结
合来抑制Bax 所致的凋亡，Bax 的高表达可抑制Bc1－2的作用［1］。

表1开郁清热方对细胞调亡率的影响（%，
珋x ʃs ）组别n 细胞凋亡率正常组6 1.46ʃ0.37*
#＆Δ模型组631.1ʃ4.76*Δ
血清对照组631.2ʃ4.57*Δ
小剂量组627.74ʃ2.7*Δ大剂量组620.99ʃ3.42*#＆罗格列酮组
6
20.98ʃ2.95*
#＆
注：和正常组对比，*P ＜0.05，和模型组比，#P ＜0.05，和血清对照组比，＆P ＜0.05，和罗格列酮组比，ΔP ＜0.05。

结果显示开郁清热方大剂量组及罗格列酮组均能有效降低胰岛β细胞凋亡率，且两组的作用效果近似。

说明经大剂量开郁清热方处理后可以有效保护胰岛β细胞，减低胰岛β细胞凋亡。

表2
Bax 、Bcl －2、p53的比较（珋x ʃs ）组别空白组模型组血清对照组小剂量组大剂量组罗格列酮组Bax 0.09ʃ0.016#＆0.135ʃ0.014*Δ0.146ʃ0.003*Δ0.127ʃ0.023*
＆Δ
0.107ʃ0.009#＆0.099ʃ0.008#＆Bcl －20.135ʃ0.033#＆0.094ʃ0.002*Δ0.098ʃ0.012*Δ0.119ʃ0.014Δ0.123ʃ0.009#＆Δ0.149ʃ0.021#＆p53
0.083ʃ0.019#＆Δ
0.129ʃ0.022*
＆
0.148ʃ0.018*
Δ
0.109ʃ0.021*
#＆
0.119ʃ0.01*
＆
0.123ʃ0.009*
＆
注：和正常组对比，*P ＜0.05，和模型组比，#P ＜0.05，和血清对照组比，＆P ＜0.05，和罗格列酮组比，ΔP ＜0.05。

结果显示大剂量开郁清热方可以有效升高Bcl －2，降低Bax 和P53的含量，其作用效果与罗格列酮相似。

大量研究证明，高FFA 和高血糖可使胰岛β细胞
中Bcl 家族蛋白中的促凋亡和抗凋亡蛋白表达失衡。

Bcl －2家族蛋白位于线粒体的上游，对线粒体PTP 开放诱导的细胞凋亡具有重要的调节作用。

促凋亡蛋白Bax 位于胞质，一旦接受凋亡信号，就转移并连接于线粒体膜上的PTP ，
通过与PTP 复合体的ANT 蛋白结合，导致PTP 开放，并进而使线粒体发生肿胀，线粒体
外膜破裂，
使膜间隙CytC 和AIF 释放入胞质。

Bax 与ANT 相互作用形成PTP 通道，而Bcl －2可与ANT 结
合，抑制Bax 与ANT 蛋白结合所引起的PTP 通道开
放。

Bax 、
Bak 、Bcl －xl 等蛋白可直接与线粒体外膜上的膜间隙的肌酸激酶和外膜上的电压依赖性阴离子通
道（Voltage－Dependent Anion Channel，VDAC）结合，在不依赖ANT的情况下介导或抑制线粒体膜间隙内CytC的释放［2］。

Bcl－2和Bcl－xl可与促凋亡蛋白Bax和Bak连接形成异源二聚物抑制Bax和Bak引起的线粒体结构改变。

因此，糖脂毒性引起胰岛β细胞Bcl－2家族蛋白表达失衡，进而促进线粒体膜上的PTP开放，可能是胰岛β细胞线粒体外膜通透性改变的另一机制。

近年研究提示，Bcl－2和Bax调节细胞凋亡不仅取决于自身表达的高低，而且还与Bcl－2/Bax比值有关。

Bcl－2/Bax比值是影响细胞凋亡的关键，其比值增加则抑制细胞凋亡，反之则促进细胞凋亡［3］。

3.2p53与细胞凋亡
steinberg等［117］的研究发现，高浓度FFA在引起胰岛β细胞凋亡的同时常伴有神经酰胺浓度的增加，而神经酰胺合成抑制剂几乎可以完全阻断FFA诱导的β细胞凋亡，提示神经酰胺在FFA诱导的胰岛β细胞凋亡过程中起介导作用。

p53在体内广泛表达，Bcl－2、Bax 等可能是p53作用的靶基因位点，神经酰胺可以激活
收稿日期：2012－08－24
基金项目：国家自然基金资助项目（81072719）；成都市科技局基金资助（10GGYB626SF－023）
作者简介：王红艳（1986－），女，四川乐山人，硕士研究生，研究方向：高等护理教育及管理。

通讯作者：张先庚（1969－），女，四川成都人，教授，硕士研究生导师，博士，研究方向：高等护理教育研究和心理学。

p53［4］，而p53是Bax的正调节因子，Bcl－2的负调节因子。

P53表达下调可部分保护FFA诱导的胰岛β细胞凋亡［5］。

神经酰胺可兴奋c－Jun氨基末端激酶（JNK），使c－Jun活化为磷酸化的c－Jun而诱导细胞凋亡［6］。

磷酸化的c－Jun引起Bcl－2失活，使Bcl－2分子失去其抗凋亡功能，从而促进细胞凋亡的发生。

本研究结果显示大剂量开郁清热方可以有效升高Bcl－2，降低Bax和p53的含量，从而胰岛抑制β细胞的细胞凋亡过程，增加细胞数量，促进胰岛素的分泌，其作用效果与罗格列酮相似。

参考文献
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金匮肾气丸对“恐伤肾”
模型仔鼠皮质酮水平的调节作用
王红艳，张先庚
（成都中医药大学，四川成都610075）
摘要：目的：观察金匮肾气丸对恐伤孕鼠孕仔数及仔鼠体质、血清皮质酮（CORT）水平的影响。

方法：采用模拟地震的生物学实验，造成“恐惧”心理应激，建立“恐伤肾”模型，观察孕鼠每胎孕仔数、仔鼠体重、翻身能力及CORT水平。

结果：中药金匮肾气丸能显著提高“恐伤肾”孕鼠的孕仔数（P＜0.01），增加仔鼠平均体重，提高仔鼠翻身能力（P＜0.01），改善应激条件下仔鼠CORT水平的变化（P＜0.01）。

结论：中药金匮肾气丸可预防恐伤孕鼠肾精不足，同时通过对仔鼠CORT的调节，有效地改善仔鼠恐惧应激反应，具有良好的抗恐惧应激损伤作用。

关键词：金匮肾气丸；恐伤肾；心理应激；皮质酮
中图分类号：R－332文献标志码：B文章编号：1000－1719（2013）02－0362－03
Regulation of Jinkui Shenqi Pill for Corticosterone of Terror
Leading to Disorder of Kidney Mice Model
WANG Hongyan，ZHANG Xiangeng
（Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu610075，Sichuan，China）
Abstract：Objective：To observe the influnce of Jinkui Shenqi Pill on the number of the terror leading to disorder of kidney pregnant rats and the serum level of corticosterone in the offsprings．Methods：Use the simulation of the earthquake biological ex-periment to cause terror psychological sress，the terror leading to disorder of kidney pregnant SD rats model was established，to ob-。