TNFAIP8在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌细胞增殖的影响

TNFAIP8在卵巢癌中的表达及其对卵巢癌细胞增殖的影响
杨大磊;毕芳芳;于大海
【摘要】目的探讨TNFAIP8在卵巢癌组织中的表达情况,以及TNFAIP8对卵巢
癌细胞增殖能力的影响.方法采用免疫组织化学方法检测189例卵巢癌组织中TNFAIP8蛋白的表达情况.通过双向调控TNFAIP8基因的表达,观察TNFAIP8对
细胞增殖能力的影响.结果在189例卵巢癌组织中,TNFAIP8阳性表达率为84.66％(160/189),其阳性表达与卵巢癌的分级显著相关.在卵巢癌细胞中上调TNFAIP8表达后,卵巢癌细胞的增殖能力显著增加,而干扰其表达后,卵巢癌细胞的增殖能力显著下降.结论 TNFAIP8在卵巢癌组织中高表达,并且其高表达与卵巢癌的分级显著相关.TNFAIP8过表达促进卵巢癌细胞的增殖,可能成为卵巢癌诊断治疗的新靶点.
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】2016(045)006
【总页数】5页(P526-530)
【关键词】卵巢癌;TNFAIP8;增殖
【作者】杨大磊;毕芳芳;于大海
【作者单位】中国医科大学附属盛京医院妇产科,沈阳110004;中国医科大学附属
盛京医院妇产科,沈阳110004;中国医科大学附属盛京医院妇产科,沈阳110004【正文语种】中文
【中图分类】R321-33
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卵巢癌是导致女性死亡的主要恶性肿瘤之一［1］。

尽管近年来卵巢癌的手术方式和药物治疗有了很大的进步，但由于卵巢癌发生的部位以及缺乏特异性症状和筛选方法，导致患者的整体生存率仍然很低［2-3］。

因此，探索卵巢癌发生和进展的分子机制，对于深入理解该肿瘤的生物学行为并开发相应的靶向治疗手段具有十分重要的意义。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8（tumor necrosis factor α-induced protein 8，TNFAIP8）又叫SCC-S2、GG2-1和MDC-3.13，分子量为21 000，含有一个DED结构域。

其作为一个肿瘤致癌基因，最初在人头颈部鳞状细胞癌细胞系中发现［4］，其过表达能够被肿瘤坏死因子α和活化的核因子κB诱导，后
来研究［5-9］发现TNFAIP8在前列腺癌、食道癌、肺癌、子宫内膜癌、结直肠
癌等许多人类肿瘤中均发挥作用。

过表达TNFAIP8能够抑制caspase-8和caspase-3的活性，从而抑制细胞凋亡，促进乳腺癌细胞MDA-MB-435的体外
增殖能力与侵袭能力［10］。

TNFAIP8还能够调节血管内皮细胞生长因子受体2、基质金属蛋白酶1、基质金属蛋白酶9的表达［11］。

然而，有关TNFAIP8在卵巢癌组织中的表达模式及其与临床病理因素的相关性目前尚无报道，其在卵巢癌细胞中的生物学功能也未见报道。

本文中，我们研究了TNFAIP8蛋白在卵巢癌组织中的表达情况，并进行了临床病理因素相关分析。

此外，我们还在卵巢癌细胞中通过双向调控TNFAIP8蛋白的表达，发现了TNFAIP8在卵巢癌细胞系中的促肿瘤作用，并为TNFAIP8促进卵巢
癌细胞系增殖提供了证据。

1.1 组织样本
本研究通过中国医科大学附属盛京医院伦理委员会批准。

189例卵巢癌标本来自
中国医科大学附属盛京医院病理科2007年至2010年的存档蜡块。

根据WHO组
织学分类标准，由2位病理医师独立做出组织学诊断。

临床病理信息从患者的病
案记录中获得。

所有患者在术前均未接受过化疗或放射治疗。

1.2 免疫组织化学检测
所有组织均经中性甲醛固定、石蜡包埋后，制成4 μm厚度的切片。

切片在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水化以及柠檬酸修复液中进行高温高压抗原修复2 min。

采用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，并采用正常山羊A血清孵育以减少非特异性
结合位点。

一抗使用单克隆鼠源性TNFAIP8抗体（1∶400，美国Abcam公司）4℃孵育过夜。

以非免疫IgG代替一抗作为阴性对照。

生物素标记的二抗（中国迈新生物科技有限公司）37℃孵育30 min，DAB显色。

苏木素复染，脱水，封片。

每张切片随机选择5个视野，每个视野计数100个细胞。

根据计数细胞着色的百
分比及着色的强度，对TNFAIP8的表达进行半定量评分。

胞质着色视为阳性。

根据细胞着色百分比分为4个等级：1，1%～25%；2，26%～50%；3，51%～75%；4，76%～100%。

根据细胞着色强度分为3个等级：0，无染色；1，弱阳性染色；2，强阳性染色。

TNFAIP8的表达又被划分成3个等级：0分，无着色；1分，浅黄色颗粒；2分，深黄色或者黄褐色颗粒。

每一张组织切片都对应一个百分比分数和着色分数，将二者相乘，所得的乘积（0～8分）即为该切片的最终得分。

将得分≤4分定义为低表达，＞4分定义为高表达。

1.3 细胞培养和转染
人卵巢癌细胞系SKOV3从ATCC（美国Manassas）细胞库获得。

细胞系用含有10%小牛血清（美国Invitrogen公司）的RPMI 1640（美国Gibco公司）培养
基（美国Invitrogen公司）培养，并将其置于5% 的CO2细胞培养箱中培养。

细胞在6孔板中培养24 h后，进行转染。

pCMV6-TNFAIP8质粒以及对照的空
白质粒pCMV6购自美国Origene公司。

TNFAIP8 siRNA和对照siRNA均购自
美国Dharmacon公司。

根据说明书，使用Attractene转染试剂（德国Qiagen
公司）对细胞进行转染。

转染后48 h，采用PCR和Western b1ot检测干扰效率。

1.4 实时定量PCR
对于培养细胞或卵巢癌组织采用TRIZOL（美国Invitrogen公司）提取总RNA。

采用ABI high capacity cDNA RT kit（美国App1ied Biosystems公司）进行反转录。

使用ABI7900实时定量PCR仪，并使用TNFAIP8特异性探针
（Hs00405413_m1）检测其在组织与细胞中的含量，内参采用β- actin
（Hs99999903_m1）。

1.5 Western b1ot
采用Pierce细胞裂解液（美国Thermo公司）对细胞进行充分裂解，然后分别提取其总蛋白，取40 μg的总蛋白通过12%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳，然
后转印到PVDF膜（美国Mi11ipore公司）上。

1%脱脂奶粉封闭2 h，兔源性一抗TNFAIP8（1∶800，美国Sigma公司）4℃过夜。

山羊抗兔鼠二抗（1∶2 000，美国Santa Cruz公司）37℃孵育2 h。

ECL显色，自动电泳凝胶成像分析仪采集
结果。

1.6 CCK8实验
转染24 h后，将肿瘤细胞以1 000/孔的密度接种在含10%小牛血清培养基的96孔板中，每孔加入20 μL CCK8溶液，37℃孵育4 h后，采用分光光度计检测
490 nm波长的吸收峰值进行定量。

1.7 统计学分析
所有的数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。

采用χ2检验分析TNFAIP8表
达与临床病理因素之间的相关性。

细胞增殖和TNFAIP8 mRNA数据的比较采用t 检验。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 TNFAIP8在卵巢癌组织中高表达且与肿瘤分级显著相关
为了研究TNFAIP8蛋白在卵巢癌组织中的表达情况，对189例卵巢癌组织及相应
癌旁正常组织进行免疫组化染色，发现TNFAIP8蛋白主要定位于细胞质中（图1）。

TNFAIP8在正常卵巢组织中呈弱表达或不表达（图1A），而在卵巢癌组织
中呈中度表达或强表达，阳性率为84.66%（160/189）（图1B～1H）。

临床病
理因素的分析结果显示，TNFAIP8的阳性表达与卵巢癌的分级（P= 0.031 0）显
著相关，而与患者年龄（P= 0.407 3）、组织学分型（P= 0.121 0）、FIGO分期（P= 0.290 9）不相关（表1）。

2.2 TNFAIP8促进卵巢癌细胞的增殖
为了探究TNFAIP8在卵巢癌细胞中的潜在功能，在SKOV3细胞中分别转染TNFAIP8质粒和特异性siRNA，上调和下调TNFAIP8的表达量，并通过Western b1ot和实时定量PCR验证其转染效率。

结果发现，转染TNFAIP8质粒后，SKOV3细胞中TN-FAIP8蛋白表达显著上升，而干扰掉TNFAIP8后，其表
达显著下降（图2A）。

CCK-8增殖实验结果显示，转染TNFAIP8质粒后，细胞
的增殖能力显著高于对照组，而干扰掉TNFAIP8后，细胞的增殖能力显著下降（图3）。

TNFAIP8家族参与许多的生命过程，包括免疫平衡、细胞程序性死亡、信号转导、肿瘤细胞的发生以及肿瘤的发展进程。

它是新近发现的一种与肿瘤高度相关的蛋白，在人体内由TNFAIP8基因编码而成。

在肿瘤发展进程中它的主要功能为细胞凋亡的负性调节因子，主要通过抑制细胞凋亡酶功能从而抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡，并能够导致半胱氨酸蛋白酶失活。

已有研究报道TNFAIP8在许多肿瘤中高表达，包括胃癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等，并且该蛋白高表达与肿瘤的发生发展显著相关。

有报道称，胰腺癌细胞中TNFAIP8通过表皮生长因子受体信号通路参与癌细胞的局部浸润转移，影响胰腺
癌的预后情况。

然而，有关TNFAIP8在卵巢癌中的表达情况及其与临床病理因素的相关性尚无文献报道。

本文中，我们发现TNFAIP8在卵巢癌组织中的表达显著
高于正常组织，并且其高表达与肿瘤的分级显著相关。

此外，我们在卵巢癌细胞系中双向调控TNFAIP8的表达，发现上调TNFAIP8蛋白水平的表达能显著增加细
胞的增殖能力，而干扰掉TNFAIP8的蛋白表达后，细胞的增殖能力显著下降。

TNFAIP8是近年来发现的一个抗凋亡分子，其过表达能够被活化的核因子κB诱
导［7］，有文献［10］报道TNFAIP8在乳腺癌细胞中作为一个抗凋亡分子，促
进乳腺癌细胞的增殖以及肿瘤的形成。

还有文献［9］报道TNFAIP8在大肠癌中
高表达，并且能通过上调Cyc1in D1促进细胞周期，进而促进大肠癌细胞的增殖，以上结果说明TNFAIP8可能通过抑制凋亡和促进细胞周期的进程来促进肿瘤细胞的增殖。

因此我们推测，在卵巢癌细胞中TNFAIP8可能也是通过抑制细胞凋亡和/或促进细胞周期的进程进而促进卵巢癌细胞增殖的，推测的准确性需要进行进一
步实验去验证。

综上所述，我们的研究发现TNFAIP8在卵巢癌组织中高表达，其高表达与肿瘤的分级显著相关。

此外，通过细胞学实验，我们还发现TNFAIP8能促进卵巢癌细胞的增殖。

TNFAIP8可能成为卵巢癌诊断和治疗的一个新靶点。

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