天女木兰多酚类物质的季节变化规律

天女木兰多酚类物质的季节变化规律
肖略;周雨;李莉;常凯;高红兵
【摘要】Through the determination of polyphenols content in different species and the leaves of Magnolia sieboldii,the seasonal variation of M. sieboldii polyphenols was speculated;The free phenol,phenol and phenol of M. sieboldii leaves with different heights in different months were determined qualitatively and quantitatively by using HPLC;Antioxidation of polyphenols was determined by UV spectrophotometry. The results show that the leaves of M. sieboldii contains chlorogenic acid and p-coumaric acid,contains caffeic acid,p-coumaric acid and two kinds of combined phenol;containing a phenol and p-coumaric acid esterification. Beginning in the early May,with the free phenol development of the Magnolia sieboldii leaf increased gradually,reached the highest in the early July, then decreased;from early May to late October until the deciduous leaf, showing an overall development with the content of esterified leaves gradually increased by law;from early May to late October deciduous leaf so far,the leaves of Magnolia sieboldii combined phenol presents the change regularity of the non leaf antioxidant;From May to
August,antioxidant activity was the weakest in May,and then gradually increased, was the highest on August, antioxidant activity decreased gradually from August to October. The antioxidant activity and polyphenol content of Magnolia sieboldii has correlation. The best collection period for Magnolia sieboldii is determined in the early October by observing the
law.%通过对不同月份天女木兰叶中多酚类物质含量的测定,推测天女木兰多酚类物质的季节变化规律;使用高效液相色谱仪定性、定量测定不同月份天女木兰不同高度叶片游离酚、结合酚和酯化酚;采用紫外分光光度法测定多酚的抗氧化性.结果表明:天女木兰叶片含有绿原酸和对香豆酸2种游离态酚;含有咖啡酸、对香豆酸2种结合酚;含有对香豆酸1种酯化酚.5月上旬开始,随着叶的发育天女木兰游离酚的含量逐渐增加,进入7月上旬,达到最高,随后含量逐渐下降;从5月上旬长叶开始至10月下旬落叶为止,总体呈现随着叶的发育酯化酚含量逐渐增加的规律,叶内结合酚呈现出非规律性的变化;5月叶片抗氧化性最弱,5月至8月抗氧化性逐渐上升,8月抗氧化性最高,8月至10月抗氧化性逐渐下降.天女木兰抗氧化性与多酚类物质含量具有相关性,确定天女木兰叶的最佳采集时期为10月上旬,即落叶前期.
【期刊名称】《北华大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(018)005
【总页数】7页(P587-593)
【关键词】天女木兰;多酚类物质;HPLC;季节变化
【作者】肖略;周雨;李莉;常凯;高红兵
【作者单位】北华大学林学院,吉林吉林 132013;北华大学林学院,吉林吉林132013;北华大学林学院,吉林吉林 132013;北华大学林学院,吉林吉林 132013;北华大学林学院,吉林吉林 132013
【正文语种】中文
【中图分类】S794.9
天女木兰(Magnolia sieboldii K.Koch)又名天女花，木兰属(Magnolia)落叶小乔木，集观赏、实用与科研于一身，极具开发利用价值.天女木兰呈间断性分布于朝鲜、日本和中国，因其花皎洁淡雅，果实鲜艳夺目，被誉为长白山“木本西施”.天女木兰花和叶可提取芳香油[1]和高级香料，木材可制作高级器具，油可做肥皂.天女木兰属国家三级保护植物，已被列入《中国植物红皮书》，是我国东北地区的珍稀濒危木本植物资源[2].目前，天女木兰的繁殖方式主要有播种苗培育、嫩条扦插、嫁接以及压条[3]等.天女木兰的生境遭到严重破坏，种子空瘪率高[4]，很少能发育成苗[5]，未能有效控制天女木兰整体数量的减少.
实验证明，天女木兰中含有多酚类物质.多酚类物质包括黄酮类、单宁类、酚酸类以及花色苷类等[6]，不仅可呈现颜色亦具有抗氧化、促进肠胃消化、预防心脑血管等慢性病，增加机体抵抗力以及抗癌、防辐射、防突变等功能.植物多酚可延缓果蔬的褐变，也被应用于肉制品的保藏[7-8].植物抗病性[9]与多酚类物质的含量具有相关性，故其含量受到广泛关注.本次研究通过精确比较不同季节多酚类物质种类、含量以及抗氧化性的变化，确定天女木兰叶的最佳采摘时期.研究结果将有助于进一步加强对天女木兰的保护，为合理开发、利用天女木兰提供参考和借鉴. 1.1 材料
1.1.1 试验材料
天女木兰叶，采自吉林省吉林市丰满区吉林医药学院附属医院天女木兰成年植株，液氮冷冻，放入-80 ℃超低温冰箱冷藏备用；乙醇，北京化工厂；氢氧化钠、正己烷，天津市永大化学试剂有限公司；甲醇，天津市大茂化学试剂厂；丙酮、乙酸乙酯、无水乙醚，国药集团化学试剂有限公司；色谱纯甲醇，天津基准化学试剂有限公司；色谱纯甲酸，天津市光复精细化工研究所；超纯水；儿茶素、绿原酸、咖啡酸、表儿茶素、对香豆酸标准品均购于中国药品生物制药检定所.
1.1.2 主要设备
JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；Cary300紫外可见分光光度计，美国Thermo公司；DW-HL398S超低温冷冻储存箱，中科美
菱公司；LC-20A高效液相色谱仪，日本津岛公司.
1.2 色谱分析条件
色谱柱：C18反相色谱柱SHIM-PACK-ODS(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；
监测器1：PDA-M20A二极管阵列监测器；
监测器2：RF-20A荧光监测器；
流动相：流动相A 为0.47%(体积分数)甲酸水溶液，B为0.55%甲酸甲醇溶液；
总流速0.8 mL/min，检测波长为275 nm；B泵洗脱梯度：起始浓度为10%，15 min时增加至18%，35 min 时增加到25%，45 min时增加到35%，再次浓度
平衡15 min，60 min 时增加到50%，65 min时增加到65%，75 min 时增加到95%，随后流速回落到初始浓度，在该浓度平衡分离柱10 min 后进样.
2.1 天女木兰叶粉的制作
采集5—10月新鲜天女木兰叶片，分不同高度(上、中、下)采摘.液氮冷冻，放入-80 ℃超低温冷冻储存箱冷藏备用[20].统一真空冷冻干燥处理，去叶脉，用研钵研磨.
2.2 样品提取液的制备
1)游离态酚的制备.准确称取4.000 0 g天女木兰叶粉，用100 mL正己烷去酯2
次(摇床振荡15 min)后，加入提取剂(V(甲醇)∶V(丙酮)∶V(水)=7∶7∶6)100 mL，超声波辅助提取(提取条件超声1 s，间歇1 s，功率450 W，总时间20 min)3次，抽滤并合并滤液.在45 ℃条件下将滤液真空浓缩至30 mL，利用6 mol/L 氯化氢
溶液调整溶液pH至2，在5 000 r/min条件下离心15 min，用100 mL正己烷
对上清液进行两次去酯，加入体积比为1∶1的无水乙醚和乙酸乙酯混合液100 mL萃取5次并合并萃取液[20].在30 ℃下真空浓缩至干，用甲醇定容至5.0 mL，
得到游离态酚.
2)酯化态酚的制备.萃取得到的水相溶液与离心后的沉淀物混合，加入160 mL的4 mol/L氢氧化钠溶液，在室温下避光水解4 h后，与游离态酚的萃取方法一样，得到酯化酚[20].
3)结合态酚的制备.将上述提取过滤后的滤渣加入4 mol/L 氢氧化钠溶液40 mL，在室温下避光水解4 h，与游离态酚的萃取方法一样得到结合酚.将过0.45 μm微孔滤膜得到的酯化酚、结合酚、游离酚进行HPLC测定[20-23].
2.3 抗氧化性测定
取2 mL样品提取液加入2 mL DPPH摇匀后暗置30 min，使用紫外分光光度计于517 nm处得测吸光度A1；取2 mL样品溶液加入2 mL 80%乙醇摇匀后暗置30 min，于517 nm处测得吸光度A2；取2 mL DPPH加入2 mL 80%乙醇摇匀后暗置30 min，于517 nm处测得吸光度A0.自由基清除率按下式计算：
3.1 标准样品测定结果
5种标准酚的保留时间与峰面积见表1.由表1可知：儿茶素出峰最早，保留时间为25.304 min，随后依次为绿原酸、咖啡酸、表儿茶素，三者保留时间相差约3 s.最后出峰的是对香豆酸，保留时间为47.710 min.
多酚标准品分离效果色谱图见图1.从分离效果看，5种标准酚分离效果良好，经数据分析可确保定性和定量测定的准确性.
3.2 样品HPLC测定结果
3.2.1 定性分析结果
利用样品的保留时间与标准品比较可知：5月至10月样品中游离酚、结合酚和酯化酚的种类基本相同，见图2～图5.叶片含有绿原酸和对香豆酸2种游离态酚，含有咖啡酸、对香豆酸2种结合酚，含有对香豆酸1种酯化酚.此外，10月上部出现游离态咖啡酸(见图6).
3.2.2 定量分析结果
利用外标法，得到叶片中多酚类物质含量测定结果，见表2.由表2可知：游离态
对香豆酸的含量远高于游离态绿原酸的含量，相差约6倍；游离态绿原酸和对香
豆酸下部含量高于上部，中部含量最低.不同高度的天女木兰叶片中整体酯化态对
香豆酸含量较低，上部叶片含量低于其他高度结合酚中咖啡酸的含量，中部和下部叶片含量相近.结合态对香豆酸含量稍高于结合态咖啡酸.上部叶片结合态咖啡酸含
量高出其他高度叶片的含量约1倍；中部和下部叶片的结合态对香豆酸含量接近，约比上部含量多1倍.3种形式的酚中，对香豆酸含量均为最高.
3.2.3 季节变化规律
天女木兰叶中游离酚含量的季节变化见图6.由图6可知，5月上旬芽初生至10月下旬落叶期间，天女木兰叶片中的游离酚呈现出规律性变化：游离酚含量平均为2.7%，随着叶生长期的延长，游离酚含量逐渐上升.在5月上旬开始展叶时含量为2.9%，进入7月上旬游离酚的含量达到最高，平均为3.8%，随后含量逐渐下降.
在10月上旬，叶中平均游离酚含量仅为2.1%，为最低.6月上旬到7月中旬为天
女木兰的花期，叶中游离酚含量可达到3.5%.7月到10月期间，叶中游离酚的含
量逐渐降低.8月中旬，幼果期叶中游离酚含量为2.3%.不同高度叶片中游离酚的含量相差不大.
天女木兰叶中的酯化酚含量的季节变化结果见图7.由图7可知，从5月上旬长叶
至10月下旬落叶为止，酯化酚呈现出规律性变化：酯化酚含量平均为1.96%，总体呈现随着叶的发育，酯化酚的含量逐渐增加.5月上旬，叶中平均酯化酚含量最低，为1.43%；10月上旬，叶中平均酯化酚含量最高，为3.17%.不同部位叶片中的酯化酚含量具有普遍规律，基本为下部叶片<中部叶片<上部叶片；8月时，中
部叶片酯化酚含量降低，并低于同月份上部和下部叶片中酯化酚的含量.
天女木兰叶中结合酚含量的季节变化结果见图8.由图8可知，从5月上旬长叶开
始至10月下旬落叶为止，天女木兰叶内结合酚呈现规律变化：上部叶片结合酚含量呈现正态分布规律，6月至7月处于上升期，9月至10月为下降期，8月最高，为2.72%，10月最低，为1.78%；中部叶片结合酚含量，5月到6月为上升期，
7月最高，为2.31%，8月至10月为下降期，10月最低，为1.95%；下部叶片
结合酚含量总体呈现下降趋势，6月最高为2.01%，10月最低，为1.26%.
3.2.4 多酚类物质抗氧化性季节变化
将不同月份天女木兰叶片的多酚提取物分别稀释成系列梯度浓度，利用DPPH自
由基的反应体系进行清除自由基试验，得出不同月份下的天女木兰提取液与其清除DPPH自由基的关系，见图9.由图9可见：在多酚提取物浓度为6～18μg/mL时，不同生长季的DPPH清除率与浓度之间呈正相关关系.
不同月份不同高度天女木兰叶的抗氧化性活性见表3.由表3可知：各月份不同部
位叶片的抗氧化性具有相同规律：5月份落叶期的抗氧化性最弱，5月至8月抗氧化活性逐渐上升，8月的天女木兰叶片的抗氧化性最强，8月到落叶后期抗氧化活性逐渐下降.统计分析结果显示，8月天女木兰叶片的抗氧化性显著高于其他月份.
总体上看，7，9，10月3个高度的叶片抗氧化性相近，5月和10月中部叶片抗
氧化活性明显低于其他高度叶片的抗氧化活性.
1)天女木兰叶片中含有游离态绿原酸和游离态对香豆酸、结合态咖啡酸和结合态对香豆酸及对香豆酸1种酯化酚.无论生长期如何变化，游离态对香豆酸含量一直远
高于游离态绿原酸，结合态对香豆酸比结合态咖啡酸含量略高.天女木兰的总酚含
量为4.39%，对香豆酸以各种酚的形式存在.
2)天女木兰叶片中的游离酚和酯化酚都呈现出季节变化：随着时间的延长，游离酚总体呈现出逐渐上升的趋势，7月游离酚含量最高，随后下降，最低为10月上旬；酯化酚的含量从5月至10月持续上升，10月时酯化酚含量达到最大；结合酚呈
现出非规律性变化.
3)天女木兰叶片的抗氧化性与生长时期有关，且季节变化影响多酚类物质的含量，故天女木兰多酚类物质含量与抗氧化性具有相关性.
4)根据试验数据统计可知：8月多酚类物质含量和抗氧化性效果最佳，7，9和 10月次之，但远高于5月至7月.10月为天女木兰的落叶期，此时的叶片方便采摘，天女木兰损失较少，可作为判断最佳采摘期的考虑因素.根据数理学统计结果和现实情况，推断出天女木兰叶的最佳采摘期为10月上旬.
对现有的关于酚类物质测定的文献进行统计发现，木本植物测定酚类物质多以含有经济价值的果实和叶片为主.由于天女木兰是国家三级濒危树种，故在研究时只采集了叶片，因为叶片多且可再生，可有效保护天女木兰这一珍稀植物资源.同时，采集不同高度的叶片进行试验分析可提高试验的准确性.
本文在高红兵等[20]的HPLC 测定酚类物质方法基础上建立了5种酚类标准品的定量测定方法，利用C18反相柱进行梯度洗脱，测定了不同月份下不同高度天女木兰叶片中多酚类物质的种类和含量.本次试验采用提取剂(V(甲醇)∶V(丙
酮)∶V(水)=7∶7∶6)100 mL进行提取，甲醇对游离酚有良好的溶解能力，同时可防止游离酚在提取过程中被氧化.加入丙酮可在提取游离态酚时兼顾提取酯化态酚和结合态酚，从而简化了试验过程，提高了试验效率.在提取过程中采取在室温条件下避光水解，是由于游离态酚中存在相对不稳定、容易氧化分解的咖啡酸、绿原酸、儿茶素和表儿茶素.
天女木兰与杨树同属落叶乔木，李春明等[26]探究过杨树中酚类物质含量的动态变化，结果显示，总酚含量在落叶前随着生长期的延长而不断上升.天女木兰多酚类物质含量的季节变化规律与其基本相似，但存在差异[30-32].天女木兰叶片的抗氧化性能力在5月至8月，随着月份的延长逐渐增强，随后逐渐下降，但整体差异不大，这与蒋雯雯等[13]探究刺山柑新叶和老叶的多酚类物质抗氧化性试验结果具有一致性.与山竹果皮、火龙果花等经济植物的组织部位的多酚类物质抗氧化性相
比，天女木兰中多酚类物质的DPPH清除率明显高于其他物质，由此表明开发天
女木兰多酚类物质具有可行性.
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