维生素E联合川芎嗪对缺血再灌注幼鼠视网膜损伤后的保护作用研究

维生素E联合川芎嗪对缺血再灌注幼鼠视网膜损伤后的保护
作用研究
曹美玲;杨小玲;李云兰;吴红敏
【摘要】目的观察维生素E联合川芎嗪对幼鼠视网膜缺血再灌注及其外周血氧化相关物质的影响,探讨其对损伤后保护的作用机制.方法选取清洁级3周龄幼鼠100只,随机分为5组,每组20只.A组为假造模组、B组为模型组、C组为维生素E干预组、D组为川芎嗪干预组、E组为维生素E联合川芎嗪干预组,再灌注损伤后4h 处死幼鼠,检测外周血清谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superioxide dismutase,SOD)、活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA),用Tunel染色法检测视网膜细胞凋亡情况.结果幼鼠眼球视网膜细胞Tunel指数B组高于其他4组,E组低于C、D组,D组低于C组(P<0.05).Tunel染色阳性集中在细胞核部位,表现为细胞核固缩.GSH-PX、SOD活性B、C、D、E组均低于A组,C、D、E组高于B组,D、E 组高于C组,E组高于D组(P<0.05);B、C、D、E组ROS活性和MDA含量均高于A组,C、D、E组均低于B组,且D、E组低于C组,E组低于D组(P<0.05).结论维生素E联合川芎嗪能通过抑制凋亡与抗氧化对缺血再灌注视网膜起到很好的保护作用,两药联合应用效果更佳.%Objective To investigate the effect of vitamin E combined with Ligustrazine in prevention of neonatal rats with retinal ischemia reperfusion injury and related oxidizing materials in peripheral blood, and to study its action mechanisms. Methods A total of 100 neonatal rats (3-week old) were randomly divided into group A (sham group, n=20), group B (model group, n=20), group C (vitamin E intervention group, n=20), group D (Ligustrazine inter-vention group,
n=20) and group E (vitamin E combined with Ligustrazine intervention group, n=20). The neonatal rats were sacrificed 4 h after the reperfusion injury, and the activities of glutathione peroxidase ( GSH-PX) , superoxide dismutase ( SOD) , reactive oxygen species ( ROS) and the concentration of malondialdehyde ( MDA) in peripheral blood were detected, and then the apoptosis of retinal cells was detected using the Tunel staining method. Results The Tunel index value in group B was higher than those in the other 4 groups, and the value in group E was lower than those in group C and D, and the value in group D was lower than that in group C (P<0. 05). The positive Tunel pigmentation was mainly concentrated on nucleolus, which showed pycnosis. The activities of GSH-PX and SOD in group B, C, D and E were lower than those in group A, and the activities in group C, D and E were higher than that in group B, and the ac-tivities in group D and E were higher than that in group C, and the activity in group E was higher than that in group D (P<0. 05);and the values of ROS activity and MDA concentration in group B, C, D and E were higher than those in group A;the values in group C, D and E were lower than those in group B, and the values in group D and E were lower than those in group C, and the values in group E were lower than those in group D (P<0. 05). Conclusion Vitamin E and Ligustrazine can protect retina by inhibiting the apoptosis and oxidation of neonatal rats with retinal ischemia reperfu-sion injury, and combined medication can achieve better effect.
【期刊名称】《解放军医药杂志》
【年(卷),期】2016(028)004
【总页数】4页(P27-30)
【关键词】再灌注损伤;视网膜;维生素E;川芎嗪;氧化物;凋亡;幼鼠
【作者】曹美玲;杨小玲;李云兰;吴红敏
【作者单位】110001 沈阳,中国医科大学附属第一医院新生儿科;110001 沈阳,中国医科大学附属第一医院新生儿科;110001 沈阳,中国医科大学附属第一医院新生儿科;110001 沈阳,中国医科大学附属第一医院新生儿科
【正文语种】中文
【中图分类】R774.1;R-332
［DOI］10.3969/j.issn.2095-140X.2016.04.007
以往研究表明川芎嗪能通过降低炎性反应及其过氧化损伤来抑制视网膜缺血再灌注后的损伤［1］。

维生素E作为一种天然存在的抗氧化剂，在日常保健与医学治疗方面得到广泛使用［2-3］。

维生素E存在于人体的细胞膜内［4］。

通过色满环来捕捉自由基而形成生育酚半醌自由基来实现抗氧化活性［5-7］。

但有关维生素E联合川芎嗪对缺血再灌注后视网膜的保护作用还未有报道，本研究建立视网膜缺血再灌注模型，探讨维生素E联合川芎嗪对幼鼠视网膜缺血再灌注损伤的抑制作用及其机制。

1.1 材料
1.1.1 实验动物:100只SD幼鼠(由军事医学科学院实验动物中心提供，合格证号:京SB20140322)，3周龄，体重100～150 g。

1.1.2 主要试剂:维生素E(美国 Sigma公司提供);川芎嗪注射液(北京第四制药厂生
产);谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)活性检测、超氧化
物歧化酶(superioxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量检测、活性氧类物质(reactive oxygen species，ROS)活性检测试剂盒均为南
京建成生物科技公司产品;Tunel检测免疫组化试剂盒为中杉金桥公司产品。

1.2 动物分组及处理将100只幼鼠随机分为A、B、C、D、E 5组，每组20只，雌、雄鼠分开饲养，人工控温20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，普通颗粒饲料
喂养，自由饮水取食。

视网膜缺血再灌注模型的建立方法:50 g/L氯胺酮(0.1 g/kg)腹腔注射麻醉，采用眼内灌注法，将连接生理盐水的4号头皮针从颞侧角膜缘刺
入左眼前房并固定在前房中央，斜面向视盘方向，将输液瓶高度与左眼垂直距离保持在164 cm，以球结膜苍白、瞳孔红光反射消失判定为缺血模型制作成功，维持缺血状态30 min，将输液瓶降低至与左眼垂直距离0 cm处，拔出针头，放出房水，眼压降低，出现球结膜充血，瞳孔出现红光反射，视网膜血供恢复判定为再灌注成功标志［8］。

均选择左眼进行研究，将造模成功幼鼠进一步处理:A组(假造
模组)仅用开睑器暴露角膜与结膜囊，其余处理不做;B组(模型组)制作视网膜缺血
再灌注模型;C组(维生素E干预组)分别于缺血再灌注前30 min与再灌注后2 h腹腔注射维生素E 50 mg/ kg，D组(川芎嗪干预组)分别于缺血再灌注前30 min与
再灌注后2 h腹腔注射川芎嗪10 mg/kg;E 组(维生素E+川芎嗪联合干预组)分别
于缺血再灌注前30 min与再灌注后2 h腹腔注射维生素E+川芎嗪，用量分别同C、D组。

维生素E用橄榄油配成混悬液(20 mg/ml)，现用现配，各组幼鼠均于
造模后4 h抽取尾缘静脉血检测GSH-PX、SOD、ROS酶活性与MDA浓度后立
即处死幼鼠，取眼球在冰台上显微镜下快速仔细分离视网膜组织行 Tunel染色。

1.3 检测指标
1.3.1 Tunel染色法检测视网膜细胞凋亡情况:将取出的新鲜视网膜组织用生理盐水溶液冲洗干净后浸泡于10%的多聚甲醛中，石蜡包埋后制成石蜡切片，按免疫组
化试剂盒说明进行操作，封片后在400倍显微镜下进行观察。

使用Image Pro Plus 6.0图文分析系统对图像进行半定量分析，并观察其表达部位。

1.3.2 GSH-PX、SOD、ROS活性与MDA浓度测定:按照试剂盒说明检测GSH-PX、SOD活性、MDA含量、ROS活性。

将血清在离心机10 000～15 000 r/ min离心，匀浆时间10 s/次，间隙30 s，连续3或4次，温度4℃，按试剂盒说明测定GSH-PX、SOD与ROS活性，并检测MDA含量。

所取标本均在1周内测定。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，计数资料以率(%)表示，采用Χ2检验。

α=0.05为检验水准。

2.1 造模结果B组成功造模16只(80.00%)，C组成功造模17只(8
3.33%)，D、E组成功造模18只(90.00%)。

2.2 视网膜细胞凋亡情况幼鼠眼球视网膜细胞Tunel指数A、B、C、D、E组分别为(0.75±0.13)%、(4.46±0.72)%、(
3.54±0.43)%、(3.20±0.45)%、
(2.64±0.36)%。

B组高于其他4组，E组低于C、D组，D组低于C组(F=2.943，P＜0.001)。

Tunel染色结果呈现阳性的部分主要集中在细胞核部位，表现为细胞
核固缩，细胞质淡染，边界清楚，同时出现了较典型的凋亡小体。

见图1。

2.3 氧化相关物质检测GSH-PX、SOD活性B、C、D、E组均低于A组，C、D、E组均高于B组，D、E组高于C组，E组高于D组(P＜0.05);B、C、D、E组ROS活性和MDA含量均高于A组，但C、D、E组均低于B组，D、E组低于C 组，E组低于D组(P＜0.05)。

见表1。

挽救视网膜缺血的措施主要是恢复血流再灌注，但往往在血流灌注恢复后组织细胞不但损伤没有减轻反而加重。

线粒体是细胞内能量物质生成与储存的重要场所［9］，对缺血缺氧非常敏感，正常情况下，细胞内部有着完整的抗氧化体系，如SOD、GSH-PX等，还有抗氧化剂如维生素E、C等及其机体自身的调控技能如脂
肪酶、蛋白酶、DNA修复酶等，生理状态下过氧化自由基在体内水平很低且能被抗氧化物质清除，视网膜与其他组织一样在缺血条件下自由基的产生明显增加［10］。

视网膜组织在缺血和重新灌流的过程中，氧自由基及自由基类产物同样
会增加［11］。

同时，中性粒细胞的活动对细胞壁也造成一定程度损伤，损伤后
的细胞又释放激活的毒性产物，进一步损伤视网膜，引起水肿［1］。

川芎嗪具有减轻缺血损伤，扩张毛细血管，调节凋亡相关蛋白的表达，减少凋亡等作用，较传统抗氧化剂有抗原性低、选择性高、半衰期长等优点［12-15］。

维生素E是人体所需的重要营养物质，分子式为C31H52O3，天然存在的维生素E为淡黄色油状液体，熔点25℃，暴露于空气中易被空气中的O2氧化，在有机物中
易溶解，其抗氧化活性已得到广泛证实［16］。

补充维生素E能减少DNA氧化
损伤，保持细胞膜稳定性，而且体内实验发现维生素E(100～3200 IU/d)没有明显的致癌或致突变性［17-19］。

此外，尹方和王勇［20］研究显示，维生素E能
很好地抑制再灌注损伤大鼠外周血清氧化相关物质的浓度，并能提升抗氧化酶活性。

此外，王仁忠等［21］研究表明，维生素E能抑制糖尿病大鼠β细胞凋亡相关基
因表达而抑制细胞凋亡。

Tunel染色法即原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法，是常用的凋亡检测法，是利用末端脱氧核苷酸转移酶将标记的dUTP接到80～120 bp的末端，该染色法从形
态上更直观地显示了细胞的凋亡情况，该方法能够在组织切片上对凋亡细胞进行精确定位，且敏感性极高，已经广泛运用到细胞凋亡的研究中，但其也存在一定局限性，就是不能很好地区别坏死与凋亡细胞，特异性较差，标记过程中应需要固定细胞，易导致细胞碎片过多或DNA片段丢失［22-24］。

视网膜组织Tunel染色结果显示，幼鼠眼球视网膜细胞Tunel指数B组高于其他4组，E组低于C、D组，D组低于C组。

说明无论维生素E还是川芎嗪均能抑制缺血再灌注后视网膜细胞
凋亡，而川芎嗪抑制凋亡基因表达效果优于维生素E。

既往曾有研究证实，川芎嗪
均能抑制缺血再灌注视网膜细胞凋亡［1］，但两药联合应用抑制视网膜细胞缺血再灌注的研究较少，本研究结果显示两药联合应用效果优于单药应用。

本研究结果显示，GSH-PX、SOD活性B、C、D、E组均低于A组，C、D、E组均高于B组，D、E组高于C组，E组高于D组;ROS活性和MDA含量均高于A 组，但C、D、E组均低于B组，D、E组低于C组，E组低于D组。

提示两药均能抑制过氧化反应，而川芎嗪抑制效果强于维生素E，而两药联合效果更佳，与以往实验结果相同［1］。

综上所述，维生素E联合川芎嗪能很好地抑制缺血再灌注幼鼠视网膜细胞发生凋亡，为今后的临床及预防工作提供了一定的理论基础。

但本实验仅仅研究了作用4 h后的效果，今后需要增加作用时间点，进一步了解视网膜细胞的凋亡变化情况。

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