生物电化学法转化甘油生产1

生物电化学法转化甘油生产1，3一二羟基丙酮
张雨薇1’2，杨雪鹏2，(1．河南农业大学食品科学技术学院，河南郑州450002；2
魏东芝2，艾志录¨
郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002)
摘要：氧化葡萄糖酸杆菌中依赖辅基吡略喹啉醌(Pyr r ol oqui nol i ne Q ui none，P Q Q)的膜结合甘油脱氢酶(G l yc er ol de hydr ogenase，G D H)是酶法转化甘油生成1，3-二羟基丙酮(1，3一D i—hydr oxyac et one，D H A)的关键酶。

以铁氰化钾为电子媒介体，采用生物电化学法，再生甘油脱氢酶的辅基P Q Q，从而实现酶法循环转化甘油生产D H A。

设计电耦联反应装置，在(28±2)℃，370m V电压下反应18h，D H A质量浓度达到27．z1g／L，甘油转化率为52．93％。

关键词：1-3二羟丙酮；甘油脱氢酶；生物电化学法；氧化葡萄糖酸杆茵
中图分类号：Q815文献标志码：A文章编号：1673～1689(2012)03--0266—05
B i o-E l ect r ochem i cal Synt hesi s of1，3一D i hydr oxya ce t one f r om G l ycer ol
Z H A N G Y u—w e i l“，Y A N G X ue-peng
2，
W E I D ong—zhi2。

A J Z hi—l u“(1．C ol le ge of F oo d Sci e nce andT echno l ogy．H e'nanA gr i cul t ur al U ni ver s i t y．Z hengzhou450002．C hi na：2．C ol l ege of F oo d and Biologic al E ngi neer i ng，Z hengzhou U nive r s it y o f Li g ht I ndust r y．Z hengzhou450002，C hi na)
A bs t r act：T he m e m br a ne-bound gl yc e rol de h ydr o ge nas e(G D H)w a s t he key enzym e of bi ocon-
ve rs i on of gl yce rol t O1，3-di hydroxyacet o ne by G l ucono bact er oxyda ns．T he m em br a n e f r ac t i on of G l ucono bact er oxydans w as col l ec t e d by ul t ra—cent ri fuga t i on。

and G D H w a s i s ol a t e d f r om t he m em br a ne f r ac t i on and pur i fi e d by C M—cel l ul os e col um n and Sephacr yl H R400col um n ch r om a t ogr aphy．T h e e l e c t r oche m i c al r e g e ner a t i o n of t he m e m br a ne-bound gl yc e rol dehydr o-gen as e w as
s t udi ed by cyc l i c voha m m e t r y．U s i ng t h i s s yst em．t he bi o—el e c t roc he m i ca l pr epar a—t i on of1，3-di h ydr o xyace t one(D H A)f r om gl ycer ol w i t h out co enzym e w as i nves t i gat ed．W hen t he t em per at ur e w as28-{-2℃，d ur i ng18h，t he D H A pr o duct i on r eached at27．219／L and t he convers i on r a t e of gl yc e rol w as52．93％．
K ey w ords：1，3-di h ydr o xyacet one，gl ycerol deh ydr o genase，b i o-el ect r o chem i s t r y，G l ucono bact—
e r oxydans
二羟基丙酮或1，3一二羟基丙酮，英文名为1，3一di hydr oxyacet one或di hydr oxyact one，简写为D H A[“，是一种重要的医药中间体和功能添加剂，在国外已得到广泛应用。

作为生产D H A的原料——甘油随着近年来生物柴油的迅速发展而大量产生。

因此，生物法转化甘油生产D H A的研究对于延伸石化产品生产链，创造更好的经济和社会效益，提升行业竞争力具有积极作用。

生物法生产D H A可以分为微生物法和酶法两种。

其中酶法生产过程中需要大量辅酶，而辅酶价
收稿日期：2011—03—04
基金项目：国家自然科学基金项目(20976053)；郏州轻工业学院博十科研摹全项目。

*i信作者：艾志录(1965—1．男．河南辉县人，工学博士．教授．焉士研究生导师，主要从事农产品精深加工面的研究．
E—m ai l|zhi l a@163．conl
●—■■■■●●J our s al of Fee d Sei ea e e-_d B i ot e chl o l og y V01．31N o．32012—___圈__圈_■_■■曩圈曩礴_■■—圈—_——■囊隧i 彝
格昂贵，因此在酶法生产中有必要对辅酶进行循环再生。

目前，报道的辅酶再生的方法主要集中在双酶耦联反应凹_3]。

作者针对氧化葡糖酸杆菌膜结合甘油脱氢酶(G D H)(E C I．1．99．22)¨]，设计生物电化学法再生甘油脱氢酶辅基P Q Q，从而实现甘油到二羟基丙酮的持续转化。

进而提高产品得率。

1．I材料
1．1．1菌种氧化葡萄糖酸杆菌(G比c o加蚰c比r oxydans)：作者所在实验室保存。

1．1．2培养基斜面培养基：8g／dL山梨醇，2 g／dL酵母粉，1g／d L氯化钠，2g／dL琼脂，自然pH。

种子培养、基础发酵培养基：8g／dL山梨醇，2 g／d L酵母粉，1g／dL氯化钠，自然pH。

1．1．3主要试剂二羟丙酮显色液：二苯胺4．8 g．浓硫酸48m L，冰醋酸432m L，混匀，避光保藏；吩嗪硫酸甲酯(P M S)、2，6一二氯酚吲哚酚纳(D C I P)：美国Si gm a公司；酵母粉：0xoi d公司；D-山梨醇：北京Sol ar bi o公司；甘油、铁氰化钾等试剂均为分析纯。

1．1．4主要仪器U V2300紫外可见分光光度仪：上海光谱仪器有限公司I H Z Q—F160全温振荡培养箱：上海福玛实验设备有限公司；C s350电化学工作站：武汉科思特仪器有限公司；D S65A高速冷冻离心机：美国B eckm an公司；Z F一3恒电位仪：上海正方电子电器有限公司；甘油含量测定试剂盒：北京五洲原业科贸公司。

1．2方法
1．2．1氧化葡萄搪酸杆茵的培养将保藏斜面菌种转接斜面培养温度28℃，培养周期2～3d。

挑取一环斜面菌种，接种于装有50m L种子培养基的150m L摇瓶中．28℃、200r／m i n摇床培养24h。

按体积分数10％接种量将种子培养液接入1L 发酵培养基中，200r／m i n、28℃培养至对数后期(约36h)。

1．2．2细胞膜组分的制备离心收集菌体，收集的菌体用蒸馏水洗涤两次后重悬予50m m ol／L醋酸钠(pH5．o)缓冲液中，通过匀浆机破碎细胞，利用超速离心机100000g离心60m i n，上清液为细胞质组分，沉淀为细胞膜组分，用相同的缓冲液悬浮‘5一“。

1．2．3膜结合甘油脱氢酶的制备将膜组分重新重悬于含体积分数1％T r i t on X一100的40 m m ol／L、pH5．0的醋酸钠缓冲液中，于4℃缓慢搅伴60r ai n。

1000r／r ai n离心30r ai n去沉淀，上清液作为待纯化的样品。

经过C M—Cel l ul ose(1×10)柱和Sephacr yl H R 400(1X120)凝胶层析柱得到分离纯化的氧化葡萄糖酸杆菌膜结合甘油脱氢酶[7-s]。

1．2．4甘油脱氢酶活性测定以PM S为电子受体，在催化反应过程中检测600nm吸收值的变化。

酶活力测定的反应体系组成为：0．325m m ol／L PM S0．45m L、0．25m m ol／L D C I P0．45m L、100 m m ol／L pH6．0磷酸缓冲液3m L和水4．5m L，即配即用。

首先向比色皿里加入基本反应液0．4m L、200m m ol／L甘油0．1m L置于1cm的比色皿中，30℃预热5m i n，600nm下吸收值平衡，然后加入酶液10“L立即进行时间扫描。

在pH6．0下D C I P的消光系数为10．8L／m m01．一个酶活力单位(U)定义为1分钟还原1vm ol的D C I P的酶量。

1．2．5蛋白质质量浓度的测定采用Low r y法[9]测定蛋白质质量浓度，以牛血清白蛋白作为标准品。

称取牛血清白蛋白10m g，用0．15m ol／L N a C I溶液溶解，并定容至10m L，最终质量浓度为1m g／m L。

1．2．6线性循环伏安曲线线性循环伏安曲线的测定在Cs350电化学分析系统上进行。

铂盘电极为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极(SC E)为参比电极。

所有实验均在(28士2)℃、含0．5 m m ol／L K3[Fe(C N)B]。

0．1m ol／L K N03，60g／L 甘油的电解液中进行。

扫描速率为16m V／s．扫描范围为一200～+500m V。

1．2．7生物电化学耦联反应生物电化学反应的装置见图l。

铂盘电极为工作电极．铂电极为对电极，饱和甘汞电极(SC E)为参比电极，向反应容器中加入55m L反应液．加入5m L(约5U)纯化后的甘油脱氢酶酶液通电后反应开始，电压为370m V，反应18h。

所有反应均在在(28士2)℃进行。

每隔2
——■——■—■———●———●■—■■—■——●——●——■●—■———_食品与生桕技术攀报2012年第3I卷第3期●●●—■一
Z H A N G Y O-w目e t al B i o-E I ec l r oc he m I c c I Sy nl h e s i s0f-D l hy dr oxyace l one r o m G l y c e r ol
h取1m I J反应液，测定反应液中甘油和二羟丙酮的含量。

05m I，十倍稀释液与4．5m L显色液在试管中混匀，置于沸水浴中反应15r ai n，流动水冷却15r ai n
几T作电扭．H钠电扳；C饱Ⅻ甘秉电极；L t100m m ol／1．pH70磷醴缓冲液．10m m ol／I铁氰化钾，60g／l，甘油．E忸电位仅；F：搅拌器图l生物电化学反应装置示意图
Fi g．1E x per i m ent al s et up of bi o-el ect r ochem i cal pr ep ar at i on of1。

3-D i hyd r oxy ace t one us i ng G D H
1．2．8D H A定量分析方法将反应液离心(5000 r／m i n，10m i n)，取0．5m L上清液稀释至5m L，取
这一方
量浓度
测定试
中甘油
2．1膜结合甘油脱氢酶的制备
氧化葡萄糖醢杆菌膜结合甘油脱氢酶的制备主要经过3个步骤：1)细胞膜组分的分离；2)表面活性剂溶解膜蛋白；3)cM一纤维素柱和Se phacr—yl H R400(1X120)凝胶柱层析。

氧化葡萄糖酸杆菌中膜结合甘油脱氢酶的蛋白质分离纯化过程见表1。

表1膜结台噩白的纯化总表
Tab．1Pur if i cati on of m em br anehound glycer o l de hydr oge nase f r om G．oz州nh5
膜蛋白
表面恬性剂溶解膜蛋白
C M-纤维囊层折
S e phac r yl H R400层析2016
1360
1172
589
1588
108
3l
94
氧化葡萄糖酸杆菌中存在着两种形式的甘油脱氢酶．其中膜结合脱氢酶(E CI199．22)代谢途径是不需要A TP和辅酶凼子N A D一，甘油可被细胞膜上的甘油脱氢酶一步直接氧化成D H A．这一过程的电子传递链由泛醌、细胞色素。

和细胞色素()还原性酶组成t”。

因此通过分离纯化的膜结合甘油脱氢酶无法连续利用甘油催化生成D H A。

2．2循环伏安曲线
分别向含有0．5m m ol／L K扛Fe(C N)，]．0．1 m ol／L K N O，，60g／I，甘油的电解液中添加2、4、6、8u的甘油脱氢酶，得到的循环伏安曲线见图2。

随着甘油脱氢酶浓度的增加，还原电流响应降低。

随着甘油脱氢酶的加入．一部分[Fe(CN)。

]卜与PQ Q H，反应．见图3。

电极表面的[Fe(C N)。

]3。

浓度降低．还原电流相应降低。

反应程式为：
127
126
37．8
62．65
100
67
58
28．9
1
9．92
29．76
4934。

舳Ⅲ州。

“’J’乙歹S C3H603+2[F e(C N)6]4"。

警”。

喘”’
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、，000002
—000004—000006矿
【J1)：)1【』{I¨10二0、01i l、r)“
EⅣ
1～5舟制表Ⅲ甘油脱氢盛((，D H l含量0U．2U{U．6u．8U 围2不同G D H津度下铁氰化钾循环伏安曲线
Fig．2C ycl i c V ol bi r am ogr am of
K“h(C N l．]i n t h e p惜一㈣of G D H
●J oar nal of Fo o d S ci e nce an d B i ol ec hno l ogy V ol31N o32012Ⅱ
通过循环伏安曲线．”f 以确定q ．物电化学法I 叮以催化14油脱氢酶辅接P Q Q 的冉生．使膜结合H }I I |脱氧酶町以在只有电于媒介体存在而不添^l I 任何辅酶的情况下连续催化H 油乍成二羟基丙酮。

甘
羟基丙
X X ≥
合成
再生
圈3生物电化学法值化甘油生成二羟基丙酮原理
№3
B i o{l e
C l r ochem i cal pr epar at i on of I
D H A f rom #yc er ol
us i ng
G D H
2
3生物电化学反应
在生物电化学反应装置中加入含有10
ret ool ／I ．K 。

[Fe(C N )*]．60g ／I ．甘油的电化学反应
液55
m J ．．加A 5m J ，f
约5u)纯化后的什油脱氧
酶．在(28±2)℃，370m V 电压下反应18h 。

时油脱氢酶催化圩油生成D H A 反应曲线屺罔d 。

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bl o-el ect r m hem i cal convers i on of D H A
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D H 参考文献(Ref er ence s
『订罔4可见，在电化学的作J |I 下．膜结合什油脱钮酶可以持续催化什浦't -成I )H A ，反应18h 后．I )H A 质量浓度达272l
g ／l ，．什油转化率达到
52．93％．电耦联反应速牢1．51g ／(L h)。

通过实验证明．生物电化学法可以持续和Jj H 氧化葡萄糖酸杆菌膜结合甘油脱氢酶制备1，3+二羟
基丙酮．而不需要添加其他辅酶。

18h 内D H A 的质量浓度达到2721g ／l ，．甘油转化率为52
93％。

与传统的微生物发酵法和酶法相比．电耦联法生产过程巾产生的剐产物较少．有利丁D H A 分离
和纯化；且操作简单不需要添加大量辅酶．有利于节约成本。

作者只针对生物电化学法催化甘油生成D H A
可行性进行了韧步研究．生物电化学法应JU 于生产中仍需要对膜结台甘油脱氧酶的分离纯化以及反
应条件进一步研究和优化。

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会议消息
会议名称{中文)：2012年中国农业工程与食品工程国际学术会议
会议名称(英文)：2012I nter nati onal C on f er en ce of A gr i cul t ur al E ngi neer i n g and Food E ngi nee r i ng，H ar bi n，C hi—n a I C A E2012
所属学科：农林基础．作物学及林木育种、生物学，动物食品科学
开始日期：2012--06一l s结束日期：2012—06一17
主办单位：黑龙江省欧美同学会哈尔滨高开区分会
全文截稿日期：2012--05一10论文录用通知日期：2012一05一15
参会报名截止日期：2012—05—20
[会务组联系方式]联系人：徐老师联系电话：86--451—87114528
E—M A I L：i ca e2012@163．com；i cae2011@163．eom
会议网站：h t t p：／／i eee2011．B eau．edu．cnt
会议背景介绍：2012年中国哈尔滨农业工程与食品工程国际学术会议(t he2012I nter nati onal C on f er en ce of A g-
f i cul t ural E n
g i nee r i ng a nd F ood E ng i nee r i ng．H ar bi n，C hi na I C A E2012)将于2012年6月15日一17日在中国哈尔滨
召开。

会议致力于推动现代农业T程技术、农业生物技术及食品工程的应用与发展．并构建与哈尔滨高开区公司企业的技术合作与交流平台，促进科技成果的转化。

IC A E2012会议将嚣请周内外知名专家及企业精英，对国内外农业工程、农业生物技术、食品工程等方面的最新研究进展进行特邀报告。

会议收集孵论文将全部以美国电气和电子工程师毋会(I E EE)论文集的形式全都刊发，并将全部被EI或SC I检索。

●J our nal of Food Sci enc e and B i el eehunl ngy V o I．31N o．32012。