荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控的建立与应用评价

荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控的建立与应用评价
发表时间：2013-04-08T08:41:03.187Z 来源：《医药前沿》2013年第4期供稿作者：刘兆军[导读] 自制质控血清无需灭活及其他特殊处理，完全能够满足PCR实验室室内质量控制的需要。

刘兆军（山东省东营市人民医院检验科 257091）【摘要】目的自制临床基因扩增实验室HBV DNA检测的室内质控品并对其应用进行评价。

方法将试剂盒自带的弱阳性对照品、自制未灭活质控血清、自制灭活质控血清作为室内质控品的选择对象，每天与样本一起检测，连续30天，通过不精密度、L-J质控图，t检验，单因素方差分析来评价三者哪一个更适合基层医院PCR实验室作为室内质控品。

结果弱阳性对照品检测结果日间不精密度为7.72%,未灭活自制质控血清检测结果日间不精密度为2.92%,灭活自制质控血清检测结果日间不精密度为3.70%；灭活与未灭活自制质控血清配对t检验,t=-0.860，P=0.397，P＞0.05，两组检测结果无显著性差异；对灭活前后两组数据进行单因素方差分析，F=0.901，P=0.346，P＞0.05，两组检测结果均值无显著性差异；SPSS17.0统计学软件绘制弱阳性对照品、未灭活自制血清质控品L-J质控图11月份30天的变化情况。

结论自制质控血清无需灭活及其他特殊处理，完全能够满足PCR实验室室内质量控制的需要。

【关键词】 HBV DNA 自制质控血清 L-J质控图【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）04-0032-02 临床实验室的分析中质量控制是全过程质量控制的一个重要环节，临床实验室的误差有很大一部分是发生在样本的分析阶段[1]，因此加强室内质控的分析是实验室质量控制的一个重要环节。

目前荧光定量PCR检测HBV DNA室内质控品的缺失是各基层检验科PCR实验室普遍存在的问题，因为市场上无商品化的质控品可以购买，大部分供应商只提供阴、阳性对照及标准品，因此通过实验室自制质控品是解决目前困境的主要途径。

本研究通过对商品化的弱阳性对照品、自制质控血清的不精密度（CV%）的分析；灭活自制质控血清与未灭活自制质控血清的比对以及室内质控图的制作来探讨室内质控方法的建立及应用评价。

一、材料与方法
1.材料：收集乙肝六项全阴的健康体检者血清作为基质血清共9.9ml，收集拷贝数为106的乙肝病人血清0.1ml；取30个核酸定量检测试剂盒中的弱阳性对照品共30份。

2.试剂与仪器：试剂为深圳凯杰生物工程有限公司的核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)，采用杭州博日Line-Gene基因扩增荧光定量分析仪进行检测。

3.方法：
3.1 自制质控血清的配制
数量级为106的乙肝病人血清0.1ml与基质血清9.9ml按照1:100的比例混匀作为自制质控血清，各吸取110ul分装到0.5ml离心管中，-20℃保存备用, 作为待测质控血清与样本一起上机检测。

3.2 弱阳性对照品的使用方法
从每个试剂盒吸取弱阳性对照品110ul分装到0.5ml离心管中,共30份，-20℃保存备用，作为待测质控血清与样本一起上机检测。

3.3 自制质控血清的灭活方法
自制质控血清取30份，56℃30分钟灭活，主要目的是去除血清中微生物的污染对HBV DNA检测的影响,然后与未灭活自制血清质控品一起-20℃冻存，备用。

3.4实验方法
每天取弱阳性对照品、灭活自制质控血清、未灭活自制质控血清各1份与病号样本一起检测，连续30天。

将弱阳性对照品、未灭活自制质控血清绘制L-J质控图。

比较试剂盒自带的弱阳性对照品和自制质控血清的不精密度（CV%）来判断两者作为质控品的优劣。

利用配对t检验，单因素方差分析来比较自制质控血清灭活前后检测结果有无差异。

4.统计学分析
检测结果取对数后进行分析，绘制L-J质控图；对数据进行描述性统计；自制质控血清灭活前后检测结果进行配对t检验，评价检测结果有无显著性差异；用单因素方差分析来评价自制质控血清灭活前后检测结果的均值有无显著性差异。

利用SPSS17.0统计学软件对数据进行处理，并制作L-J质控图，P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果
1.弱阳性对照品检测结果日间不精密度为7.72%,未灭活自制质控血清检测结果日间不精密度为
2.92%,灭活自制质控血清检测结果日间不精密度为
3.70%；灭活与未灭活自制质控血清配对t检验,t=-0.860，P=0.397，P＞0.05，两组检测结果无显著性差异；对灭活前后两组数据进行单因素方差分析，F=0.901，P=0.346，P＞0.05，两组检测结果均值无显著性差异，见表1、2、3。

自制质控血清无论灭活与否对检测结果影响不大，弱阳性对照品不精密度偏大，与自制血清质控品相比作为室内质控品不具优势，因此自制血清完全适合作为室内质量控制的质控品，且未灭活自制血清制备方法简便，结果稳定，无需灭活，更适合基层医院PCR实验室。

2.SPSS17.0统计学软件绘制的弱阳性对照品、未灭活自制血清质控品的L-J质控图11月份30天的变化情况，见图1、2。

从图上可以清楚看到室内质控的变化趋势，且弱阳性对照品不精密度高，质控点的离散趋势偏大，自制血清与其相比更适合作为室内质量控制品。

图中U Spec、L Spec为上下警告线，数值为2个标准差，UCL、LCL为失控线，数值为3个标准差。

Average为平均值，VAR00001、VAR00003为数据来源于SPSS17.0统计学软件中表格的列数。

注：P>0.05差异无统计学意义
三、讨论
HBV DNA含量是诊断和监测乙型病毒性肝炎的重要指标[2]。

目前测定HBV DNA含量的常用方法是实时荧光定量PCR法，想获得可靠的HBV DNA含量测定结果，必须加强临床基因扩增检验实验室的质量管理[3]。

用于实验室质量控制目的的样本被称为质控品，这种性质的质控品应具有小的瓶间差异，这样测定结果之间的差才能归究于方法本身，浓度应处于正常和病理范围之内。

本室通过商品化试剂盒自带的弱阳性对照品,灭活血清,未灭活血清三者的比较可以发现自制质控血清是能够保证PCR实验室的质量控制。

弱阳性对照品作为室内质控品不精密度偏大,而自制质控血清无论灭活与未灭活,变异系数小,均一稳定,在当前买不到商品化的质控品的情况下,是完全能够保证实验室室内质量控制。

特别是未灭活血清,配制方法简便,无需灭活,-20℃保存非常稳定,对于一般实验室完全可以做到。

需要注意的问题就是乙肝病毒的传染性,要注意加强自我防护,严格遵循PCR实验室的防污染的要求进行操作。

试剂盒要存放在试剂准备区,阳性标准品与自制质控血清要存放在标本提取区,虽然阳性标准品是乙型肝炎病毒的DNA片断,但也要遵循实验室防污染的要求,作为传染物来对待,质控血清要在密封盒中保存,在操作过程中每完成一步要及时更换手套。

通过L-J质控图可以看到自制质控血清完全在控,并且日间不精密度低，说明在-20℃的条件下,乙型肝炎病毒DNA是稳定、无扩增的。

通过L-J质控图的变化,质控偏低的情况下,而阳性标准品结果可靠,可以及时发现问题,比如试剂盒中提取液活性降低导致的质控总体偏低,从而达到评价试剂质量的目的,保证实验室检验质量的准确可靠。

对于未安装LIS系统的实验室，可以利用统计学软件SPSS17.0绘制L-J质控图，进行数据处理，从而对实验室室内质量控制进行评价。

综上所述，自制质控血清质量稳定，精密度可靠，无需特殊处理便可满足PCR实验室HBV DNA检测室内质量控制的需要。

参考文献
[1］张海霞，郭杰，张连祥.临床实验室胸腔积液标本的分析前质量控制影响因素探讨［J］.中华检验医学杂志，2012，35（10）：948-950.
[2］李金明.感染性疾病免疫测定的室内质量控制［J］.医学检验与临床，2007，18（1）：3-6.
[3］郭向华，黄雁翔，靳海英，等. HBV DNA荧光定量PCR室内质控分析［J］.中国卫生检验杂志，2010，20（2）：437-438.。