二氧化硫水溶液提取黑加仑中花色苷和酚类物质的研究

二氧化硫水溶液提取黑加仑中花色苷和酚类物质的研究
J. E. Cacace and G . Mazza
摘 要：水果、蔬菜、红葡萄酒有益人体健康主要归因于其中存在的花色苷及酚类物质。

本文通过单因素实验研究了不同SO 2浓度（28、300、700、1100、1372ppm ）、温度（6、20、40、60、74℃）、液固比（6、20、40、60、74ml/g ）对黑加仑中酚类物质的提取的影响。

通过响应面法优化了花色苷和总酚的产量，以及提取液抗自由基和抗氧化活性。

实验结果表明，酚类物质的提取效果受SO 2浓度、液固比和提取温度的影响，花色苷和总酚的最佳提取条件为SO 2浓度1000−1200 ppm ，液固比为19L/kg 冻浆果，浸提温度升高，浸提的速率增加，因而总酚和花色苷萃取平衡的时间将减少。

然而，由于花色苷在较高的温度下会降解，因此建议提取温度为30-35℃。

抗氧化活性试验的结果也同时受这三个因素影响，并且液固比约高，抗氧化效果越差。

关键词：花色苷；酚类；黑加仑（黑醋栗）；二氧化硫；黄酮醇；提取工艺；抗氧化性；功能性食品；保健品
前言
研究表明水果、蔬菜中黄酮类化合物和其它植物化学物质对预防癌症、冠心病、中风有作用[1，2]。

同时，黄酮和一些酚类物质还表现出多种生物活性，如消炎、抗菌，抗氧化和舒张血管的作用[2，3]。

目前已经出现具有抗氧化活性的水果、蔬菜、谷物的产品[4，5]，研究表明，其抗氧化活性与黄酮类化合物的结构有着密切的关系[6-8]，同时，从越桔属、悬钩子属、虎耳草科酷栗属的浆果中得到花色苷和酚类化合物也具有抗氧化活性[9，10]。

对富含花色苷的植物的调查表明，浆果是酚类化合物的最重要来源之一[11]。

黑加仑是9中研究的浆果中活性第二强的[12]。

黑加仑中的花色苷主要是矢车菊-3 -葡萄糖甙，飞燕草-3 -葡萄糖苷，矢车菊-3 -芸香糖甙，和飞燕草-3 -芸香糖甙[11，13]。

其中矢车菊-3 -葡萄糖甙的抗氧化活性已被认为是目前商业用抗氧化剂（BHA 、VE ）活性的两倍[7]。

另外，浆果中的黄酮醇、有机酸等物质也具有明显的抗氧化作用，如甜樱桃和蓝莓中含有的羟基肉桂酸可抑制食物中脂肪的氧化[14]。

高浓度的羟基肉桂酸衍生物，尤其是咖啡因和P -香豆酸[15，16]，还有黄酮醇，如杨梅素，槲皮素，山萘酚，也是在黑加仑中发现[16-18]。

采用液体溶剂提取植物中的化学物质是产品生产的重要一步。

其中有两个基本概念：过程平衡和提取速率，分别表示从植物组织中提取化合物的多少和溶出速率。

植物组织中的化合物会溶解到浸提的溶液中直至达到平衡。

其中m 是平衡常数，e y 是目标化合物的在提取液中的质量分数，e x 是目标化合物占
干原料的质量分数[19，20]。

m是溶质、溶剂和温度的特征常数。

目前有采用不同的溶剂和酸化方式从葡萄酒渣[21]和草莓[22]中提取花色苷的研究，向日葵中萃取花色苷的效果也受萃取溶剂影响显著[23，24]。

有研究表明，随着提取液中SO2的增加，葡萄（Vitis vinifera）中的花色苷提取率也增加[25]。

Gao 和Mazza的研究表明[23]，从葵花籽壳中萃取花色苷受溶剂类型的影响，二氧化硫水溶液的提取效果优于乙酸和乙醇水溶液，并且尽量使用二氧化硫水溶液作为提取溶剂是减少萃取过程中有机溶剂损耗和降低成本的解决方法。

萃取的效果还将取决于何快速地使目标化合物在提取液中达到平衡浓度。

浓度梯度越大，扩散系数较大，物料的粒径越小，萃取的速率越快。

因此葵花籽壳破碎越彻底[23]，葡萄酒渣[26]的粒径越小，将获得更高的花色苷和酚类化合物提取率。

温度升高，粘度系数下降，扩散系数就越大[27]。

虽然有用二氧化硫水溶液作为提取液解决提取过程中花色苷热降解的报道[28]，但是从黑加仑中萃取酚类化合物，特别是萃取花色苷的最优条件迄今尚未见报道。

响应面法已经成功地用于葵花籽壳中提取花色苷产量的优化[23]，同时也被用来选择最好的提取溶剂，温度，提取时间，以最大限度地提高脱脂琉璃苣粉的抗氧化活性[29]。

本次试验目的是为了优化黑加仑中酚类化合物的提取，试验条件可按比例扩大。

1.原料和方法
1.1原料的制备：单个速冻的黑加仑；2000年生产季节（M & G Brothers Farm, Abbotsford, BC）采摘后在-36℃下冻藏，直到使用。

浆果放在液氮预冷粉碎机（model ED-5, Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA）中捣碎，机器转速为520r/min，使用6mm的筛网和
2.0mm 的刀刃间距。

在-25 ℃下用筛子（model Octagon 200, Endecotts Limited, London, U.K.）根据美国筛分标准筛分5（4.0mm），7（2.8mm），10（2.0mm），16（1.18mm），18（1.0mm），60（0.25mm）控制粒度分布。

筛子在使用前后分别称重并记录，差值即为样品在粘附在筛子上的质量。

粒度分布和平均粒径通过查与筛子孔径大小相对应的颗粒质量概率分布图获得[20]。

经破碎的浆果在0℃冷室中编号并保存于-36摄氏度与氮气密封容器中，并在2周之内使用。

1.2提取工艺：在4L的玻璃烧杯中加入经破碎的冷冻样品和
2.5L提取溶剂，提取溶剂为二氧化硫水溶液，制备方法为将Na2S2O3溶液用醋酸调节pH至
3.8。

影响因素为二氧化硫浓度，温度，浆果的重量等。

搅拌器为一直径6.35cm 的翼型轴流叶轮（model A310 Lightnin, Mixing Equipment Co. Inc., Rochester, NY）。

当烧杯在恒温水浴锅中升温至特定温度时，按固液比加入浆果样品，固液比根据干浆果的重量计算。

在提取过程中，定期取3ml提取液用分光光度计检测280或520 nm处吸光度，直至吸光度读数不再变化，此时即达到平衡。

此过程建立了一个与以往的萃取用固定的时间差[22，26]或单独用时间[23，29]作为变量所不同的研究方法。

这种技术用在这里可以更彻底的提取到目标物，因而可以获得每个条件下的最大提取量。

此时，平衡时间便成为了另外的一个变量，平衡时间可由酚类化合物浓度与萃取时间曲线获得。

用Sigma Plot公司的软件（SPSS Inc., Chicago, IL）拟合出最佳曲线并获得酚类物质的最高预测值。

用公式（1）计
算平衡常数m ，花色苷和酚类化合物的提取率F （%）用下面公式计算：
eq
C 和
fb
C （mg/g ）分别表示平衡时每g 冻浆果中提取的花色苷质量和冻浆果原料中花
色苷含量。

1.3混合条件：将转速控制在1210r/min ，来获得雷诺数10000的湍流效果[30]，为了确保混合效果相同，搅拌叶轮和容器的几何尺寸，叶轮的安装位置，叶轮与容器直径的比例在整个试验过程中都固定的。

选择叶轮直径为6.35cm ，容器直径为15.6cm ，这样叶轮直径与容器直径的比为0.41 。

叶轮距离容器底部的距离为四分之一的容器直径，即为 3.9cm 。

为了混合均匀，溶剂量为2.5L ，并对叶轮调整至推荐位置：距离容器底部为三分之一的液体深度[30]。

高度在浆果加入后会改变，但是依然在推荐的范围（11.7-23.4cm ）之内。

叶轮相对用夹子以15°的偏心角固定在没有挡板的容器中，避免涡流的形成。

叶轮距离容器侧壁的距离控制在4.1cm 。

1.4检测与分析：在提取过程只中定期对采样检测直至最终提取结束，样品用注射器通过孔径为0.45μm 的PVDF 滤膜后，用分光光度计分别检测280nm ，320nm ，360nm 和520 nm 处的吸光度，得到总酚、酒石酸酯、黄酮醇及花色苷的含量。

标准样品使用绿原酸，咖啡酸，槲皮素和矢车-3-葡萄糖苷。

冷冻浆果（10克）在搅拌机中按先前说那样用80％乙醇萃取后测定成分[31]。

取大约4g 破碎的冷冻黑加仑，加入100ml SO 2 浓度为1100ppm 的提取液，并在20℃恒温箱中浸泡60h ，然后用no. 541滤纸抽滤，滤液定容至100ml ，按上述方法分析组分。

冷冻黑加仑干物质含量测定方法为：将2-4g 样品放入真空烘箱中70℃ 保持30h 。

高效液相色谱系统组成由液相色谱系统(Agilent 1100 series, Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA)，并个配备一个光电二极管阵列探测器，自动进样器，和一个控制模块。

每次加样5μm ，柱子为一个反相C18柱(Zorbax SB, 5 μm, 4.6 × 250 mm, Agilent Technologies Inc.)和一个保护柱(Inertsil 5 ODS-2, 5 μm, 30 × 4.6 mm, Phenomen ex, Torrance, CA)。

溶剂A 采用甲酸/水（5:95V / V ），溶剂B 为甲醇溶液。

B 溶液配置如下（v/v ）：0 min ，10%； 0−30 min, 10−25%； 30−50 min, 25−45%；50−55 min, 45−100%； 55−60 min, 100%； 60−65 min, 100−10%.流速为1.0ml/min ，通过峰面积计算成分含量。

标准品为绿原酸，咖啡酸，槲皮素和矢车- 3 -葡萄糖甙，其标准曲线分别在280nm ，320nm ，360nm 和525 nm 处测定。

提取物抗氧化活性用其清除一定浓度的DPPH ·自由基的方法来表示，如Fukumoto 和Mazza [7]用此方法研究了β-胡萝卜素的抗氧化活性。

同时抗氧化活性也可以用一定浓度差的提取液的抗氧化指数来表示。

因此，Wettasinghe 和 Shahidi 参照β-胡萝卜素抗氧化活性的研究方法，将样品浓度控制在16−150 ppm ，并在0和90min 后依次测定不同浓度样品的吸光度，便计算出抗氧化指数[29]。

A0为未加药DPPH溶液的空白吸光度，A i为加药后DPPH溶液的吸光度，A j 为样品溶液自身的吸光度。

1.5实验方法设计：采用响应面发优化提取效果[32]。

采用中心复合三因素五水平设计。

由18个试验点组成，包括4个中心实验。

独立变量为二氧化硫浓度，温度和固液比，二氧化硫浓度分别为28 ppm，300 ppm，700 ppm，1100 ppm和1372 ppm。

固液比在6到74之间（表1）。

测定总酚提取率，平衡时间，分配系数，抗氧化活性，抗自由基的活性，等提取液的抗氧化指标。

表1.中心组合实验设计
编号温度 (℃) 液固比a SO2浓度b
1 20 (−1) 20 (−1) 300 (−1)
2 20 (−1) 20 (−1) 1100 (+1)
3 20 (−1) 60 (+1) 300 (−1)
4 20 (−1) 60 (+1) 1100 (+1)
5 60 (+1) 20 (−1) 300 (−1)
6 60 (+1) 20 (−1) 1100 (+1)
7 60 (+1) 60 (+1) 300 (−1)
8 60 (+1) 60 (+1) 1100 (+1)
9 6 (−1.68) 40 (0) 700 (0)
10 74 (+1.68) 40 (0) 700 (0)
11 40 (0) 6 (−1.68) 700 (0)
12 40 (0) 74 (+1.68) 700 (0)
13 40 (0) 40 (0) 28 (−1.68)
14 40 (0) 40 (0) 1372 (+1.68)
15 40 (0) 40 (0) 700 (0)
16 40 (0) 40 (0) 700 (0)
17 40 (0) 40 (0) 700 (0)
18 40 (0) 40 (0) 700 (0)
a 按干物质计算ml/g ；
b 通过计算得出ppm
数据分析采用软件RSREG，PLOT和REG procedures of SAS（SAS Institute Inc., Cary, NC）拟合成二阶多项式方程来优化提取条件。

RSREG软件被用来估计模型中各个变量对结果的影响，拟合程度在0.1％的显着水平。

响应面模型中，通过保持最有效的独立变量固定在一个恒定值来获得预测模型的拟合值。

2.结果与讨论
在3天中，将冷冻黑加仑破碎，制得的黑加仑粒子的粒度分布和平均粒径几乎相同。

颗粒重量和粒径分布均匀，粒径分布见图1. 获得的平均粒径为1.6mm ，从而保证了试验结果不受原料取样的干扰。

图1.冷冻黑加仑经520r/min 破碎机破碎后的粒度分布（采用用6毫米筛网和一个2.1毫米刀片间距）
分析结果见表2，黑加仑中花色苷含量比文献报道值要高。

但是，Banaszczyk 、Pluta 、Moyer 等人[34]用同样的样品用乙醇在搅拌器中提取得到的花色苷含量与cv. Ben Lomond [10]得到的结果相似。

此外，在波兰的cv. Ben Lomond 用水提花青素的结果也在季节性变化的范围之内[34]。

由于采用提取平衡的方法[19]，为了确保提取完全，需要采用足够长 提取时间(60h )，这就导致了一些非酚类化合物的溶入乙醇，就导致了吸光度在280nm 处的增加。

Mok 和 Hettiarachchy [28]研究了用1000 ppm 的二氧化硫水溶液提取葵花籽壳中非花色苷多酚，García-Viguera 等人[22]研究了用水溶液提取草莓中花色苷。

当用高效液相法测定样品成分时，花色苷的含量和分光光度计检测的结果相近，但是，用高效液相测定的总酚含量明显要低，这可能是因为蛋白质在280nm 附近有吸收，干扰了吸光度检测的结果。

表2.破碎冻黑加仑的成分a
a 以mg 每g 干物质表示下列数值：
b 绿原酸；
c 咖啡酸；
d 槲皮素；
e 矢车- 3 -葡萄糖甙；
f 由分光光度计所测吸光度计算所得；
g 用HPLC 测定的结果。

对总酚产率回归模型进行方差分析，从表3中可以看出，回归模型达到显著水平 (P <0.01) ，而误差项不显著，说明回归方程与实际情况吻合较好。

而花色苷产率，酒石酸酯
样品 总酚b 酒石酸酯c
黄酮醇d 花色苷e
干物质含量(%)
1f 89.4 2.8 2.1 15.8 22.9 2 91 2.7 1.8 14.9 22.1 3 86.3 2.8 1.9 15.2 22.4 平均 88.9 ± 2.4 2.8 ± 0.08
1.9 ± 0.14
15.3 ± 0.44
22.5 ± 0.41
1g 21.7 2.2 1.6 15.7 2 19.5 2 1.3 14.2 3 18.7 1.9 1.3 13.5 平均
20.0 ± 1.6
2.0 ± 0.12
1.4 ± 0.17
14.5 ± 1.1
产率、黄酮醇产率（数据未列出）无统计学意义(P >0.1)。

对总酚和花色苷的提取平衡时间也非常显着（p <0.01）。

不过，对于抗氧化活性指标的响应面分析模型（表4）显示该模型无显着性变异性，其原因是由于其抗氧化活性太低，无法由β-胡萝卜素的抗氧化活性测定测定。

但是用DPPH法检测出很强的清除自由基的活性，并且其模型具有显著性和变异性。

回归系数和变异系数和调整后的总酚、花色苷产率、提取时间以及黑加仑提取物抗氧化指数的二阶回归方程见表5. 。

总酚花色苷编号提取率a分配系数平衡时间b提取率c分配系数平衡时间b
1 25.4 0.13 128 12.
2 0.25 130
2 32.1 0.18 52 13.4 0.37 55
3 33.3 0.06 68 12.7 0.09 70
4 55.6 0.11 48 13.4 0.12 51
5 23.5 0.12 45 11.4 0.21 32
6 35.6 0.3 15 13.3 0.38 38
7 26.6 0.05 18 13.1 0.08 22
8 39.2 0.31 10 13.7 0.12 22
9 36.4 0.09 135 13.5 0.14 136
10 23.4 0.2 20 9.7 0.11 20
11 23.7 0.47 62 11.6 1.17 80
12 41.3 0.12 29 13.3 0.1 29
13 24.3 0.04 88 11.7 0.08 92
14 40.6 0.3 32 12.5 0.13 40
15 36.9 0.09 40 13.1 0.13 42
16 31.4 0.16 33 12 0.13 37
17 32.5 0.07 22 12.8 0.16 46
18 31 0.11 40 13.7 0.17 40
model ***d** *** NS ** ***
linear *** *** *** * ** ***
quadratic NS * ** NS ** NS cross-produ
* NS NS NS NS NS ct
R20.928 0.841 0.944 0.63 0.813 0.921
effects
SO2浓度*** ** *** NS NS **
温度** NS *** NS NS ***
液固比*** ** * NS *** NS
a. 总酚的产率以冻干浆果计算（mg/g）；
b. 以min计；
c. 花色苷提取率（以矢车-3-葡萄糖苷计）以冻干浆果计算（mg/g）；d . ***表示在P <0.01水平上显著，**表示在P <0.05水平上显著，*表示在P <0.1水平上显著
编号清除自由基活性a抗氧化活性抗氧化指数 (%)
1 −4.0
2 892 85.8
2 −3.75 694 83
3 −3.53 711 58.5
4 −4.30 74
5 42.8
5 −4.14 937 87.9
6 −4.16 74
7 87
7 −4.99 1331 70.1
8 −6.14 501 70.4
9 −4.43 1189 67.6
10 −5.36 569 80.5
11 −5.21 1142 91.8
12 −5.56 263 51.6
13 −3.59 822 74.2
14 −5.50 416 63.8
15 −4.64 656 70.8
16 −4.75 555 72.1
17 −4.18 369 75.9
18 −4.36 348 70.3
model *b NS ***
linear ** NS ***
quadratic NS NS NS
cross-product NS NS ***
R20.772 0.627 0.977
effects
SO2浓度NS NS **
温度* NS ***
液固比* NS *** a．μM DPPH/μM；b. ***表示在P <0.01水平上显著，**表示在P <0.05水平上显著，*表示在P <0.1水平上显著
总酚花色苷
变量a提取率平衡时间提取率平衡时间抗氧化指数（%）
intercept 25.41*** 241.5*** 12.2*** 338.0*** 96.83*** X10.014*c−0.16*** 0.0012* −0.29***
X2−4.06** −6.30***
X3−1.20** −2.85** −0.49***
X12 5.1×10-5* 4.5×10-5***
X22−0.0015* 0.032*** −0.00054*** 0.025**
X32
X1X20.0004** 0.0040**
X1X30.0008*** −0.0012* 0.0031** −0.00058***
X2X30.00047* 0.044*
X1X2X3−1.2×10-5** −5.5×10-5* 9.9×10-6***
model *** *** ** *** ***
R20.945 0.919 0.508 0.946 0.968
a 多项式方程为，X1 为SO2浓度，X2为温度，X3 为液固比
随着液固比的增加，花色苷和总酚产量也随之增加，达到平衡所需时间减少（图2），在SO2浓度为300 ppm时比在1100 ppm时这种趋势更加明显。

提取温度从20℃上升至60 ℃时花色苷提取率并没有增加，但是提取平衡所需时间缩短了，温度通过影响扩散系数而会影响一个特定物质的提取率，提高温度会增加扩散系数，从而使扩散速度增加，提取时间缩短。

在SO2浓度为1100 ppm，液固比为60 mL/g时，提取温度从20℃升高至60 ℃时，花色苷的提取率降低，这个可能是由于花色苷在高温下会热降解造成的。

图2.
总酚的提取率会受三个因素的影响，但是主要还是受二氧化硫的浓度和液固比的影响。

随着液固比的增加，总酚提取率明显增加（图3A），尤其是在温度比较低的时候，总酚提取率与液固比保持线性增长，以干基绿原酸当量计算，从25mg增加到78mg。

总酚化合物在高温下增长缓慢，可能是由于一些热敏感物质的热降解或二氧化硫在高温下从提取液中挥发造成的。

Kalt等人报道温度对从蓝莓中提取总酚比提取花色苷的影响要小[35]。

在SO2浓度较高的情况下，增加液固比有利于总酚的提取，但是在SO2浓度较低的情况下其效果不明显（图3B）。

提取的限制步骤为SO2浓度低，在高浓度SO2时，溶剂的溶解性能增加，然后增加液固比可以获得一个较高的总酚提取率。

图3
总酚的提取率随着SO2浓度的增加而增加，但是在高的液固比时增幅比较明显。

花色苷的提取也随SO2浓度的增加而增加，但效果不显着。

SO2对提取效果的影响确切机制还不清楚，但是有报道[23]说SO2与细胞壁作用，有可能是溶解度增加、扩散改善的原因。

随着SO2浓度的增高，从葡萄[25]，葵花籽壳中[23，28]提取花色苷的产率也增加。

在室温下用纯水提取黑加仑中花色苷和总酚的产率与用最低SO2浓度（28ppm）提取的效果差不多[9]，溶剂的组成会影响溶剂的密度，粘度，进而影响扩散速度和提取率，它还影响活度系数，从而改变一个特定化合物在溶剂中的溶解度。

同时受溶剂组成影响的还有介电常数，此属性是衡量正反带点粒子间电荷相互作用强度的，也与一个溶剂的溶解性能有关。

因此通过改变压力和温度，减少溶剂的介电常数（εH2O；εMeOH= 32.6；εEtOH= 24.3），可以提高天然产物的提取率。

当SO2浓度增加时，水的介电常数可能减小。

纯SO2液体在20℃时的介电常数为14 ，较低的介电常数减少了溶剂分子分离的所需的能量，并允许溶质分子进入它们之间[37]。

这些研究结果表明了一个机制，SO2是通过改变溶剂的溶解度来增加酚类物质提取的。

花色苷的提取率受液固比和温度的影响（图4），虽然效果并不显着。

SO2浓度为1100ppm时，固液比保持恒定，花色苷提取率在40℃达到最高，然后温度随着温度继续升高而下降，温度的升高将同时有利于花色苷溶解度和扩散系数的增加，但是其主要原因是提高了扩散系数。

当温度超过35-40 ℃时，花色苷的提取率减少，其原因是由于花色苷在高温下会热分解，这与Pifferi 和Vaccari (24)的研究结果完全一致。

花色苷的降解和细胞膜的通透性都随温度升高而增加，这两个因素都将影响花色苷的提取率。

然而，图4 的结果显示花色苷的热降解的影响更大，其提取率是用60℃水从蓝莓中提取花色苷的15倍。

这项研究结果表明，在任何液固比的情况下，在60℃时花色苷的提取量都要比25℃时要低。

另外花色苷产率也受液固比影响，在实验中花色苷提取率随液固比几乎是线性增长（图
4），增加的液固比是通过改变花色苷的浓度梯度，从而增加了提取率。

图4.
响应面模型显示，总酚和花色苷的分配系数和平衡时间都显著（表3.）。

分配系数主要受液固比的影响，平衡时间主要受SO2浓度和温度的影响。

用乙醇溶液提取酚类化合物的平衡时间也只要受这些因素影响。

对于总酚和花色苷提取平衡时间的响应面模型显示，当提取时间随着提取温度的降低而大幅度增加，较低的温度导致了扩散速率的减小，进而导致了提取时间的增加。

较低的SO2浓度也会使提取平衡时间增加，当较高浓度的SO2时，有SO2浓度所产生的有利影响可能弥补提取时间减少和温度升高所造成的提取率下降，最短提取花色苷的平衡时间出现在SO2浓度为900ppm，65 ℃，液固比为10 mL/g的时候，最短提取总酚的平衡时间出现在SO2浓度为900ppm，60℃，液固比为45 mL/g的时候。

当花色苷提取温度≤35 ℃时，随着SO2浓度从1300ppm变化到200 ppm时，最短提取时间从40min 变化到100min。

SO2浓度的增加会使溶液的介电常数减小，从而使减小溶剂分子间的作用力，用二氧化硫溶液作为提取剂能在短时间内获得一个高的花色苷提取率，从60%变化到90%，然而总酚的回收率比较低，由26%变化至62%，这个主要是因为一些非酚类物质280nm 有吸收而干扰了测定。

花色苷和总酚提取的平衡时间分别在20 min至136 min和10min至135 min (Table 3)之间。

在类似的工艺条件下，用乙醇溶液提取所需平衡时间要更加长，为26min至328min[31]。

从葵花籽壳中完全提取花色苷所需时间为10至60min[23]，在短时间内就有非常高的提取率，但是应该注意SO2浓度和温度的选择，以便最大限度提高产率。

抗氧化指数的响应面模型是一个马鞍型（图5）。

该指数受到全部3个实验因素的影响，其中最主要的影响因素是液固比，液固比越高，抗氧化指数越低，可能是较高的液固比将提取物稀释的缘故。

用β-胡萝卜素法检测抗氧化活性并没有显示出差异。

但是用DPPH 法检测清除自由基活性时显示温度和液固比对其有影响，在高液固比和温度组合时可以获得最高的清除自由基活性。

清除自由基活性由−3.5 增强至−6.1μM DPPH/μM 。

与最为参考的α-维生素E（众所周知的抗氧化剂活性-1.71μM DPPH/μM）和BHT（-2.75μM DPPH/μM）相比，提取物的抗氧化活性毫不逊色。

清除自由基活性的差异是由于提取物组分的不同造成的，提取温度的不同会造成提取物成分的不同，为了进一步探讨这种现象，用高效液相色谱分析不同温度（6℃、40℃、74℃）下的提取物组分。

图5.
高效液相的测定结果表明花色苷含量随着提取温度增加而减少（图6）。

从图4.中可以看出，当提取温度超过35-40℃市时，提取温度升高，花色苷含量提取率降低。

高效液相检出的结果是，74℃时花色苷的提取率比6℃下降了53%，四种主要黑加仑中主要的花色苷[11，13，31]含量（峰2. 飞燕草-3 -葡萄糖甙；峰3. 飞燕草-3 -芸香糖甙；峰4. 矢车菊-3 -葡萄糖苷；峰5.矢车菊-3 -芸香糖甙）都在按相同比例减少，在74℃时，一些在黑加仑中含量较少的花色苷（峰6；峰7；峰10；峰11）以无法检出。

图6.黑加仑提取物组分分析
峰1.绿原酸；峰2. 飞燕草-3 -葡萄糖甙；峰3. 飞燕草-3 -芸香糖甙；峰4. 矢车菊-3 -葡萄糖苷；峰5.矢车菊-3 -芸香糖甙；峰6. 峰7. 峰10. 峰11.为酰基化的花色苷。

除了在花色苷的减少，温度在74℃时比6℃时，高效液相色谱图谱在280nm （图6.）和320nm出的检测结果显示，总酚和酒石酸酯分别下降了48%和21%。

在74℃时，，HPLC 图谱中峰的数量和峰面积相比6℃时都减少了。

用乙醇溶液提取黑加仑中绿原酸和酒石酸酯，随着温度升高，提取率增加[31]，因此，在较高温度下，用乙醇溶液提取这些化合物的效果比用二氧化硫水溶液提取效果好。

3.结论：
在水中添加可以改善黑加仑中酚类化合物的提取效果。

最佳提取条件为1000-1200 ppm的二氧化硫的浓度，提取达到的平衡时间随着温度的升高而减少。

由于较高的温度会
使花色苷降解，所以对于提取花色苷来说，建议采用的提取温度为30-35℃，通过提高液固比可以提高总酚和花色苷的提取率，当每kg冻浆果中加入19L提取液时可以得到最大的提取率。