荧光分析

到的光谱,简称荧光光谱。
（四）、荧光光谱的特点
(1)斯托克斯位移（Stokes shift）:与激发光谱 相比，荧光波长出现在更长的波长处。振 动、热辐射将会使分子失去能量，即激发
与发射荧光间的能量损失是Stokes shift产
生的主要原因。
•
(2) 荧光发射光谱与激发波长无关：无论用 λ=250和350nm作激发光源，所得荧光光谱形状 和峰的位置都是相同。
S0 吸光2 吸光1 荧光3 S2 S1 T1
荧光
荧光产生过程
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
荧光的产生
e e
S1最低
辐荧 射光
e
S0各振动能级
e
•
荧光是指是在紫外或可见光照射下，电 子跃迁至单重激发态S1(有时是S2， S3，但很 少) ，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发 态的最低振动能级，再跃回基态S0或基态中的 其他振动能级所发出的光。
• （1）荧光激发光谱（吸收光 谱）：固定测量波长(选最大发 射波长)，化合物发射的荧光(磷
光)强度与照射光波长的关系曲
线。激发光谱曲线的最高处， 处于激发态的分子最多，荧光 强度最大。 • （2）荧光发射光谱（荧光光
谱）：固定激发光波长(选最大
激发波长), 测定该波长处的荧 光发射强度随发射波长变化得 萘的激发(I)、光谱荧 光(II)和磷光(III)光谱 图
•
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能 量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态 的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定 的荧光。
(3) 吸收光谱与发射光谱镜像对称
• 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱
（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。
（五）、荧光定量分析基础
（1）荧光强度与浓度
If = fIa= f ( Io-I )
（2）金属螯合物的荧光
螯合物中配位体的发光
OH N N HO
N OH
O
N Zn
2,2`-二羟基偶氮苯 无荧光
N N
8-羟基喹啉 弱荧光
8-羟基喹啉-Zn螯合物 黄绿色强荧光
O Al
O
2,2`-二羟基偶氮苯-Al螯合物 强荧光
其它应用
‫‏‬ DNA的荧光效率低，常用荧光分子作为探针标
记DNA。溴化乙锭(EB) 是探测DNA结构的典 型的荧光探针分子，在激发波长546nm，发射
荧光分析仪
王熙熙
一、序言
原子吸收 原子光谱 原子发射 原子荧光 光谱分析 分子吸收 分子光谱 分子发光
2
紫外-可见光谱
红外光谱
分子
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光的形式释放
非辐射跃迁
以热的形式释放
称为“发光”
荧光分析是指利用某 些物质在紫外光照射下产 生荧光的特性及其强度进 行物质的定性和定量的分 析的方法。
三、荧光分析的仪器
1575年，西班牙医生N.Monardes发现荧光现象。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释， 并提出了“荧光”。
1867年，Goppelsroder首次应用铝-桑色素配合物的荧光
进行了铝的测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。
I f 2.3 f I o A
由于A=bc：故在实验条件固定时， 荧光强度与浓度成正比,即：
I f 2.3 f I obc Kc
K = 2.3 f I ob
f
I0

b
对于一给定物质，当激发光波长和强度一定时，
荧光强度只与溶液浓度有关：
I f Kc
线性关系只有在极稀溶液中才成立。对于较浓溶液， 由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不成线 性关系。
重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 …
（二）、荧光的产生
• 荧光：受光激发的分子从
第一激发单重态的最低振动 能级回到基态所发出的辐射。 寿命为10-8~ 10 -11s。由于 是相同多重态之间的跃迁， 几率较大，速度大，速率常 数kf为106~109 s-1。
同步扫描荧光 •
根据激发和发射单色器在扫
描过程中彼此间所保持的关系，同步 扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能 量差及可变波长三种； • 同步扫描技术可简化光谱，谱 带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率； 如图。 • 合适的Δλ可减少光谱重叠；酪 氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似， 发射光谱严重重叠，但Δλ<15nm的 同步光谱只显示酪氨酸特征光谱； Δλ>60nm时，只显示色氨酸的特征 光谱，实现分别测定。
S1 S电子能级 V振动能级 R转动能级
V1
Ro Ro Ro
So
a
b
c
Vo
2、电子激发态的多重态（M） •
•
M=2S+1
S为电子自旋量子数的代数和(0或1)
• S=0，M=1，单重态S （所有电子都是自旋配对的） S=1,M=3，三重态T（电子在跃迁中自旋方向改变，自旋平行）
•
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单
内滤效应和自吸现象
• 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射
光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内 滤光作用”。如色胺酸中的重铬酸钾。 • 内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光 发射光谱的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长 波长一端有重叠。 在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身 吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强
1、仪器流程图
检测器
If 单色器 记录器 液槽
I0 光源 单色器
（1）光源 汞 弧灯 气 山 弧灯 激光光源 （ 2 ）单色器
高发射强度
低压汞灯：254 nm 荧光光源强度 > 紫外-可见吸收光谱光源强度 激光诱导荧光 Laser Induced fluorescence
滤光片
棱镜 光栅
色散器：常用光栅
荧光
磷光
3
二、荧光的基本原理
（一）光吸收过程
1、分子能级与跃迁 每个分子都有一系列分立的电子能级，在每个 电子能级中又包含一系列的振动能级层和转动能级。 基态(S0)→激发态(S1、S2…)： 吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位； 激发态→基态： 多种途径和方式(见能级图)； 速度最快、激发态寿命最短的途径占优势。
三维荧光光谱
I F ∝f (λex 、λem) 固定发射波长、扫描激发波长
蒽的激发光谱
I F ∝f (λex 、λem) 固定激发波长、扫描发射波长
蒽的发射光谱
3、荧光分析的特点

灵敏度高


选择性好
仪器简单 应用范围广
4、定量分析
• （1）标准曲线法
直接荧光标准曲线法
荧光熄灭工作曲线法
第一单色器选激发光波长
第二单色器选荧光波长
（3）试样室：
四面光石英池 固体试样架
四 面 光 比 色 皿
2、新技术
• （1）激光荧光分析：用波长更长，强度更大的激
光作光源，提高荧光法的灵敏度和专一性。可协调 激光器作光源，荧光单色器省略。 • （2）同步荧光分析：激发光谱和荧光光谱中选择 一适宜的波长差值。 • （3）时间分辨荧光分析等。
If : 荧光强度 Io : 所吸收的辐射强度； f ：荧光效率
Io A lg I I I 010
A
I f f I o (1 10 )
A
将指数展开：
(2.3 A) (2.3 A) I f f I o [2.3 A ] 2 3
2 3
如果吸光度A < 0.05, 方括号中其他各项与 第一项相比均可忽略：
波长590nm具有荧光强度与DNA数量成正比的
特点，可用于定量分析。
• 如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8 秒 • 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长更
长。
（三）荧光光谱（激发光谱与发 射光谱）
由于荧光属于被激发后的发射光谱，因此它 具有两个特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和发射光谱(emission Spectrum)或称荧 光光谱(fluorescence spectrum) 。 •
F Fx
F Fx
Cx
Cs
Cx
Cs
（2）直接比较法
空白荧光为F0时， Cs/Cx=(Fs-F0)/(Fx-F0)
5、 定性分析
• 由两个特征光谱（荧光光谱，激发光
谱）定性，可靠性强。但一定有标准品作 对照。
6、应用
• （1）无机化合ห้องสมุดไป่ตู้分析：
•
• 无机离子可以与一些有机化合物形成有荧 光的络合物。 有机化合物绝大多数是芳香族化合物， 通 常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子 形成五元环或六元环的螯合物。螯合物的生成， 分子的刚性平面结构增大，使原来不发荧光或荧 光较弱的化合物转变为强荧光化合物。