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中国合肥与日本新潟两地白念珠菌分离株的生物学特性比较
中国合肥与日本新潟两地白念珠菌分离株的生物学特性比较
中华皮肤科杂志1999年第1期第32卷论著
作者：姚敬业青木茂治周家华久和彰江杨远丽仲村健二郎郑芹
单位：姚敬业周家华杨远丽郑芹(230061 合肥市卫生防疫站)；青木茂治久和彰江仲村健二郎(日本齿科大学新潟齿学部综合研究中心)
关键词：白念珠菌；蛋白酶；磷脂酶类
【摘要】目的由合肥、新潟两地，分别取白念珠菌分离株32株及36株，展开试验。

旨在探索不同地区可能出现的差别。

方法试验包括形态学(芽管、厚膜孢子)、生理学(碳源同化试验、蛋白酶、磷脂酶)及生物分型试验。

结果形态学、生理学试验，两地的菌株均无显著性差异；但生物分型有区别——两地菌株除了唯一的型别()为共有外，其他8个型别均不相同。

结论生物分型可作为流行病学调查工具。

Comparative Studies on Biological Characteristics of Candida Albicans Strains Isolated from Hefei, China, and Niigata, Japan
YAO Jingye, Aoki Shigeji, ZHOU Jiahua, et al. Hefei Sanitation ＆Anti－epidemic Station, Hefei 230061 【Abstract】Objective To compare the biological characteristics of Candida albicans strains isolated from Hefei,China(32 strains) and Niigata,Japan(36 strains).Methods The study included morphological (germ tubes, chlamydospores), physiological (assimilation, protease, phospholipase) and biotyping by a series of killer yeast method.Results There were no significant differences between two regions in all tests except the biotypes:8 out of 9 biotypes were different, only one biotype () was in common between the two regions.Conclusion Biotyping of C.albicans seems to be a useful method for epidemiological investigation.
【Key words】Candida albicans Protease Phospholipase
我们的目的旨在通过实验室资料较深入地了解白念珠菌(白念)的生物学特性，比较不同地区的分离株，探索可能出现的差异。

材料和方法
一、材料
白念来源：合肥32株(取自健康人口腔28株、阴道2株、皮肤2株)；日本新潟36株(取自健康中学生口腔36株)。

碳源同化试验实验板：由日本Seretec出品，内含12种糖。

生物分型用的标准系列杀手(killer)，共24株。

由意大利都灵大学引进。

二、方法
1.芽管形成：菌株置马血清中，37℃孵育2～4h后镜检。

2.厚膜孢子：菌株转种于玉米粉琼脂(CM)，辅以0.2％吐温80，25℃孵育4～7d后镜检。

3.碳源同化试验：操作按使用说明书进行。

4.蛋白酶测定：方法参照Polak。

菌株在SD(葡萄糖沙堡)琼脂上生长茂盛后，用无菌水洗下，使吸光度550nm 达到0.025。

再取10μL本悬液滴加于试验平皿上(平皿含0.1％KH2PO4，0.05％MgSO4，1％葡萄糖，0.16％马血清及1％琼脂)。

37℃孵育7d后，测量菌苔直径。

然后，平皿用5％三氯醋酸固定2h，考马斯蓝染色过夜。

次日，蒸馏水脱色，背景呈蓝色。

如菌株能产生细胞外蛋白酶，则因本酶可分解马血清而在菌苔周围出现透明环。

测量透明环的直径作为分母，以菌苔直径作为分子，比值愈小则酶的活力愈大。

5.磷脂酶测定：方法参照Price。

取上述悬液10μL，滴加于卵黄平皿表面(SD琼脂加NaCl到1mol/L，CaCl2到5mmol/L，另加5％卵黄至2.5％)。

37℃孵育48h观察。

如菌株能产生细胞外磷脂酶，则菌苔周围可见沉淀环。

测量此沉淀环的直径作为分母，以菌苔直径作为分子。

此比值愈小则酶的活力愈大。

6.生物分型：方法参照Bruatto。

用作分型的24株标准系列杀手，由都灵大学V.Vidotto教授提供。

菌种名称：K1，毕赤氏酵母菌株1034；K2，毕赤氏酵母菌株1035；K3，异毕赤氏酵母3；K4，异毕赤氏酵母5739；K5，异毕赤氏酵母Um866；K6，加利福尼亚毕赤氏酵母WC40；K7，加拿大毕赤氏酵母WC41；K8，迪门纳毕赤氏酵母WC44；K9，姆拉克毕赤氏酵母WC51；K10，克鲁弗毕赤氏酵母1002；K12，异落毕赤氏酵母WC38；
K16，酿酒酵母B2210；K18，赫比阿毕赤酵母WC45；K27，粉状毕赤氏酵母185；K37，姆拉克毕赤氏酵母255；K41，酿酒酵母SC8；K44，乳克鲁维酵母IF01；K48，乳克鲁维酵母2359；K49，乳克鲁维酵母2360；K50，脆弱克鲁维酵母25；K51，脆弱克鲁维酵母ATTC34439；K113，乳克鲁维酵母10B-383；K114，乳克鲁维酵母2132-2B；M83，白念珠菌NKS。

待检菌株接种SD琼脂，25℃孵育3d。

无菌水洗下制成悬液(吸光度0.25,530nm)。

此悬液2mL与40mL改良SD琼脂混合(琼脂中还含0.003％亚甲蓝，0.1mol/L枸橼酸，0.2mol/L KH2PO4缓冲液，pH为4.5)，然后倾注于反应盘中(13.5cm×9.5cm)。

待琼脂凝固后，在固定的位置上，按标准杀手顺序(K1、K2、K3……、K114、M83)逐个接种24株杀手酵母于盘上，每一杀手酵母株滴加一环(图1)。

25℃孵育3d。

如待检菌株对某一杀手酵母表现敏感，则该杀手酵母菌苔周围可见无菌的透明带；如不敏感，则无透明带。

今规定：凡第1横排出现透明带者记1分；同理，第2横排记2分，第3横排记4分。

然后，按纵列将3个得分相加。

如此，便可得到一个8位数的生物分型。

例如，图1中的菌株，其生物分型即为。

图1反应盘中的白念菌株其生物分型为
结果
形态学：两地菌株共68株，均可产生芽管及厚膜孢子。

碳源同化试验：全部菌株可同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖与山梨糖；不能同化纤维二糖、乳糖、鼠李糖、肌醇、核糖醇与卫矛醇。

以上结果与白念的典型描述是一致的。

蛋白酶测定：合肥菌株32株，比值最高为0.96，最低为0.50，平均值0.70；新潟菌株36株，比值最高为0.97，最低为0.52，平均值0.71。

取两组平均值作t检验，P ＞0.05，说明两地菌株在蛋白酶的活力方面无显著性差异。

磷脂酶测定：合肥菌株32株，比值最高为0.92，最低为0.56，平均值0.71；新潟菌株36株，比值最高为0.92，最低为0.52，平均值为0.72。

经t检验，P ＞0.05，说明两地菌株的磷脂酶活力无显著性差异。

生物分型：合肥菌株可分为6个生物型，新潟菌株可分为4个生物型。

型别中最多见的是型(合肥分离株27株；新潟分离株31株)。

值得注意的是，两地菌株中也只有这一生物型别是共有的，其他8个型别均不相同。

如型(新潟3株)，型(合肥1株)，型(合肥1株)等。

讨论
形态学方面，念珠菌属中只有白念可产生芽管，可藉此与其他酵母鉴别。

本文中68株白念均可产生芽管。

关于厚膜孢子，有人认为抗真菌治疗有可能影响厚膜孢子形成。

但本文中的菌株绝大多数来自健康人，未发现不能形成厚膜孢子者。

细胞外蛋白酶被认为与毒力因素有最大的关联。

近年来，另一种细胞外酶——磷脂酶，被假定为又一种毒力因素。

临床患者的分离株固然可产生这两种酶，但本文菌株绝大多数来自健康人口腔，实验证明亦可产生此两种酶。

两地菌株，在两种酶的活力比较方面无显著性差异(P ＞0.05)。

生物分型是本文中两地菌株之间唯一有明显差异的项目。

生物分型可用以追踪传染源，作为流行病学调查的手段。

Bruatto还注意到艾滋病患者口腔白念分离株，在抗真菌治疗过程中，其生物型别可发生变化。

也许将来，生物分型可协助观察病情变化并显示与真菌毒力的联系。

志谢安徽医科大学皮肤科朱一元教授，意大利都灵大学真菌研究所V.Vidotto教授提供分型用菌株
参考文献
Polak A. Virulence of Candida albicans mutants. Mycoses, 1992,35:9-15.
Price MF, Wilkinson ID, Gentry LO. Plate method for detection of phospholipase activity in Candida albicans. Sabouraudia, 1982,20:4-14.
Bruatto M, Vidotto V, Marinuzzi G, et al. Candida albicans biotypes in human immunodeficiency virus type 1-infected patients with oral candidasis before and after antifungal therapy. J Clin Microbiol, 1991,24:726-730. Ruchel R, De Bernardis F, Ray TL, et al. Candida acid proteinases. J Med Vet Mycol, 1992,30(Suppl 1):123-133.
(收稿：1997－08－19修回：1998－05－05）。