黄药子及配伍当归后含药血清体外的抗肿瘤作用研究

黄药子及配伍当归后含药血清体外的抗肿瘤作用研究崔立然1，索晴2，刘树民2，杨婷婷2，刘学伟21 齐齐哈尔医学院第一附属医院，齐齐哈尔 (161041)2 黑龙江中医药大学中医药研究院，哈尔滨 (150040)E-mail：clrxh@摘要：目的：研究黄药子及黄药子配伍当归后的含药血清体外抗肿瘤作用。

方法：采用MTT法来检测黄药子及黄药子配伍当归后的含药血清对肉瘤细胞（S180）和肝癌细胞（H22）增殖的抑制作用，用荧光分光光度法检测该用药后两种癌细胞的P-糖蛋白（P-gp）的表达，结果：当归可提高黄药子对两种癌细胞的抑制率，同时可降低P-gp的表达。

结论：黄药子配伍当归后可通过降低P-gp 的表达增加黄药子抗肿瘤作用。

关键词：黄药子，当归，S180，H22，血清药理学中图分类号：R281．引言黄药子为薯蓣科薯蓣属植物黄独（Dioscorea bulbifera L.）的块茎，药性苦寒，具有散结消瘿、清热解毒、凉血止血的作用，其有广泛的药理活性，可用于瘿疾瘤肿等，但其也为肝固有毒物，其毒性严重制约了其在临床上的卓越疗效的发挥。

本研究是在实验室前期研究[1][2]黄药子的毒性及其配伍当归后减毒机制基础上，应用MTT法、荧光分光光度法观察黄药子配伍当归后含药血清对肿瘤细胞的抑制效果，皆在说明其配伍是否具有增效的作用，为中药的配伍应用提供更科学的依据。

本次实验前已经分别进行了体外药物和含药血清指纹图谱系统研究。

2. 仪器及试验材料试验药物：黄药子购于黑龙江省药材公司,鉴定为薯蓣科植物黄独(Dioscorea bulbifera L. )的块茎。

当归购于黑龙江省药材公司,鉴定为伞形科植物当归(Angelica sinensis（Oliv.）Diels)的干燥根。

黄药子饮片,头煎10倍量水,二煎8倍量水浸泡后煎煮2次,合并煎液,浓缩,喷雾干燥制粒,每1 g颗粒相当于17. 5g原药材。

用时用蒸馏水溶解稀释至所需浓度。

黄药子与当归(1: 2) ,依上煎煮制备。

仪器：CO2培养箱（HF90,上海）；超级洁净工作台（北京）；倒置显微镜（CKX41，Philippines）;酶标仪（anthos 2010 17750,anthos labtec instrument，Austria）；荧光分光光度计（RF-5000，Japana）；KDC-160HR高速冷冻离心机（安徽合肥）。

动物：雄性SD大鼠，体重200±20g，购于上海斯莱客实验动物有限责任公司。

许可证号：SCXK（沪）（2003-0003）。

细胞：肉瘤细胞（S180）和肝癌细胞（H22）（黑龙江省肿瘤研究所提供）。

实验试剂：四甲基偶氮唑盐(MTT，美国sigma)；二甲基亚砜(DMSO ，AMRESCO)，RPMI-1640培养基（GIBCO公司产品）；胎牛血清（NBS，杭州四季清公司）；罗丹明123（Rho-123，美国sigma）。

3 实验方法与结果3.1 含药血清的制备取雄性SD大鼠15只。

分为三组：空白组（灌胃给予生理盐水），黄药子组每日ig20g/kg（生药量）黄药子，黄药子加当归组（后文简称“配伍组”)每日ig 60g/kg （生药量），连续3d ，末次给药后1h ，取血，离心分离血清，56℃灭活30min 。

0.22um 微孔滤膜除菌4℃保存备用。

3.2 MTT 实验取对数生长期的肿瘤细胞，浓度为5×104个，在96孔培养板上接种细胞(100 ul /孔)，每孔6个复孔。

96孔板置37℃、5%CO 饱和湿度培养箱孵育24h 后，分别加入含药血清和空白血清，使其血清终浓度为20%，48h 后加入MTT （5mg/ml ）10ul ，于37℃，5%CO2培养箱孵育4h 后，弃上清，加入DMSO200ul/孔，旋涡震荡器上震荡10 min ，使结晶物充分溶解，与490nm 波长处用酶标仪测OD 值。

并按以下公式计算抑制率。

结果见表一抑制率%=（1-含药血清组OD 值均数/空白血清组OD 值均数）×100%Tab.1 the inhibition effect of Serum containing drug on S 180 and H 22（x ±s ，n=6）S180 H22组别 ———————— ———————A 抑制率% A 抑制率% 空白血清组 0.799±0.032 0.966±0.022黄药子组 0.502±0.078 △ 37.18 0.833±0.094△ 11.90 配伍组 0.435±0.051▲▲△45.56 0.752±0.085 ▲△ 21.54 Note: △P ﹤0.01 vs control serum ▲ ▲▲ P ﹤0.05 P ﹤0.01 vs Dioscorea bulbifera L. serum实验结果表明：黄药子和配伍组的含药血清对S 180和H 22增殖有抑制作用，其抑制率分别为37.18% 、45.56%及11.90% 、21.54%，说明配伍后对癌细胞的抑制率明显提高。

其中H 22组虽抑瘤效果不佳，但配伍后也能提高抑制率。

表明当归可能通过某种环节增强了黄药子的疗效。

3.3 P-gp 表达测定取对数生长期的肿瘤细胞，浓度为5×104个，加入到96孔板上，每孔加含细胞的培养液100ul ，置37℃，5%CO 2培养箱孵育24h 后，分别加入含药血清和空白血清，使其血清终浓度为20%，与加药后30min 、60min 、120min 、180min ，240min 用PBS 润洗预孵育30 min 后加入20ul （30ug/ml ）的Rho-123于37℃，5%CO2培养箱孵育30min 后，弃上清以冰冷的PBS 洗细胞数次除去细胞外吸附的荧光染料， 细胞内积聚的染料用正丁醇萃取，样品中的Rho-123荧光强度用荧光分光光度计测定（Ex=330nm ；Em=528 nm ）。

结果见图一，图二1020304050600.5h 1h 2h 3h 4h i n t e n s i t yFig. 1 Intracellular Rho-123 in S 180 cells for various length of times1020304050600.5h 1h 2h 3h 4hi n t e n s i t yFig. 2 Intracellular Rho-123 in H 22 cells for various length of times实验结果：从图一、图二可以显示各组随着暴露时间的延长,细胞内蓄积的Rho-123的荧光强度在0.5h 到1h 吸收最快，并且荧光强度在1h 时最大，2h 以后呈下降趋势到3h 基本趋于平稳，配伍组在1h 后明显大于黄药子组和空白血清组（P ﹤0.05），标志细胞对进入胞内的Rho-123 的排泌能力下降,P-gp 表达降低。

空白血清组细胞荧光强度在1h 达到最大吸收后无明显变化，而黄药子组在2h 后荧光强度低于空白血清组（P ﹤0.05），标志细胞对进入胞内的Rho-123 的排泌能力下降,P-gp 表达升高。

4 讨论中药虽成分众多,但只有那些被消化吸收进入血液的成分或其代谢产物才有产生药效的可能，本实验采用含药血清进行体外实验，研究了黄药子及其配伍当归后的药效及其可能的机制，其快速、敏感、条件易控、重现性好，避免中药制剂直接体外给药的诸多干扰因素，不但能反映中药母体药物及其可能代谢产物的药理作用，而且还能反映有可能由药物诱导机体内源性成分所产生的作用，结果显示S 180、H 22中P-gp 的表达水平与其MTT 体外药敏试验有较好的相关性，说明黄药子配伍当归后增效的一个重要机理是降低P-gp 的表达，抑制P-gp 泵的功能达到蓄积药物，增加药效的作用。

P-gp 是一种分子量为170kDa 的依赖ATP 的跨膜转运蛋白,是多药耐药(MDR)基因的表达产物,可将多种结构和特性不相关的外源性和内源性对细胞有潜在毒作用物质排出细胞[3]。

P-gp 过度表达是肿瘤细胞产生耐药的主要原因，P-gp 抑制药可以抑制P-gp 对肿瘤药物的外排作用，使肿瘤细胞内的药物浓度提高，从而逆转MDR [4]。

本实验研究表明通过配伍降低P-gp 的表达可以提高黄药子的抗肿瘤效果，至于黄药子配伍当归如何影响P-gp ，引起药物积聚，可能的因素有基因转录活性的调控，或蛋白表达水平的下调，抑或竞争性抑制，当然亦有可能为别构效应等结果，有待进一步的研究。

参考文献[1] 刘树民，李玉洁，罗明媚．当归对黄药子的减毒作用[J] ．中西医结合肝病杂志，2004，14（4）；216[2] 刘树民,张琳,李颖．黄药子与当归配伍对大鼠肝脏CYP1A2、CYP2E1基因mRNA表达的影响[J]．中药药理与临床，2006; 22 (3、4)；97[3] 刘志伟，陈佳琳，陈秉衡．铜对人类肠道上皮Caco-2细胞的毒性研究[J]．卫生研究，2004，33（3）；284[4] 戚世伟。

P糖蛋白抑制药逆转肿瘤多药耐药的研究进展[J] 。

医药导报，2006，25（7）；682 Studies on Anti-tumor by serum containing of Compatibilityof Dioscorea bulbifera L and Angelica sinensis Diels In vitro Cui Liran1，Suo Qing2，Liu Shumin2，Yang Tingting2，Liu Xuewei21 The First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University，Qiqihar，heilongjiang （161041）2 Institute of Traditional Chinese Medicine，Heilongjiang University of Traditional ChineseMedicine，Harbin （150040)AbstractObjective：To explore the inhibition effect of the inhibition effect of Serum containing drug on tumor. Methods：The effect of Serum containing drug on S180 and H22 were analyzed with MTT assay. The expression of P-glycoprotein was detected with Fluorescence Spectrophotometry before and after Compatibility.Results：inhibition effect can be increased after compatibility,the expression of P-gp could be decreased significantly after compatibility. Conclusions：the inhibition effect on tumor could be stronged by Dioscorea bulbifera L combining with Radix Angelicae Sinensis.Keywords：Dioscorea bulbifera L.；Angelica sinensis Diels；S180；H22；Serum pharmacology。