动物细胞培养技术实验指导(全面)
动物细胞培养技术
动物细胞培养技术动物细胞培养技术是生物学领域中的一项重要技术，它可以帮助科学家们研究动物细胞的结构、功能和生理过程。
通过培养动物细胞，科学家可以模拟生物体内的生理环境，从而更好地理解细胞的生物学特性。
本文将介绍动物细胞培养的基本原理和常用的培养技术。
一、动物细胞培养的基本原理动物细胞培养是指将动物体内的细胞取出并在体外特定的培养基中进行培养的过程。
培养基是一种模拟生物体内环境的营养液，它提供了细胞所需的必要营养物质和生长因子。
在培养基中，细胞可以获得适当的营养和生长条件，从而保持其生物学特性并进行增殖。
动物细胞培养的基本原理包括以下几点：1. 细胞来源：细胞可以来源于动物组织、器官或体液中，常用的细胞来源包括胎儿组织、胚胎组织、肿瘤组织等。
2. 细胞分离：细胞从组织中分离的方法通常包括机械分离、化学分离和酶解分离。
分离后的细胞可通过离心等方式得到单个的细胞悬液。
3. 培养基选择：根据细胞的特性和要求，选择合适的培养基。
培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基，无血清培养基常用于细胞实验室中。
4. 细胞培养条件：通过调整培养温度、湿度、pH值、氧气含量等条件，提供合适的环境促进细胞的生长和增殖。
5. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，需要进行细胞传代以保持其活力。
传代的方法通常是将细胞分散至新的培养容器中，以维持细胞的适宜密度。
二、常用的1. 无血清培养技术：无血清培养基是一种不含胎牛血清的培养基，通过添加人工合成的生长因子和营养物质来满足细胞的生长需求。
无血清培养技术避免了胎牛血清中含有的未知因子对实验结果的干扰，提高了实验的可重复性。
2. 原代细胞培养技术：原代细胞培养是将从动物体内直接获得的组织进行分离和培养。
这种方法可用于细胞的初次培养和研究。
但由于原代细胞在培养中只能进行有限的传代，其使用寿命较短，因此需要定期重新取材。
3. 细胞系的建立：细胞系是细胞通过传代培养，并保持了一定生物学特性和遗传稳定性的细胞群。
动物细胞培养实验2
实验题目：动物细胞培养教师：XXX实验类型：综合学时：26(参考)内容：一、实验目的通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。
初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外生长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌操作。
三、试剂与器材1.材料出生后2-3天的乳鼠2.试剂平衡盐液－Hank液细胞消化液 0.5%水解乳蛋白-Hank液犊牛血清碳酸氢钠 1万单位/ml青、链霉素 3%谷氨酰胺磷酸盐缓冲液3.实验器材镊子解剖刀剪眼科剪眼科镊纱布块玻璃漏斗量筒记号笔试管试剂瓶三角瓶移液管培养皿培养瓶吸管橡皮头显微镜血细胞计数板计数器酒精灯酒精棉球试管架试管解剖板碘酒棉球口罩二氧化碳培养箱超净工作台灭菌锅倒置显微镜四、实验内容原代培养：取肾→消化分散组织→计数与稀释→分装培养→观察。
传代培养：配置培养液→消化细胞→细胞计数→培养观察。
培养细胞冷冻保存。
五、关键步骤及注意事项1. 注意无菌操作，及时更换培养液。
六、思考题1. 简述细胞传代培养的操作程序注意事项？2. 细胞培养获得成功的关键要素是什么？3. 简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。
动物细胞培养方法
动物细胞培养方法
动物细胞培养是一种常用的实验手段，广泛应用于细胞生物学、药物研发、生物医学研究等领域。
以下是一般性的动物细胞培养方法：
1.细胞系的选择：选择合适的动物细胞系是动物细胞培养的第一步。
细胞系的选择要考虑细胞类型、来源、生长特性和用途等因素。
2.细胞培养基的准备：准备适用于所选细胞系的培养基。
培养基包括基本培养基和补充物，如生长因子、抗生素等。
不同的细胞系需要不同的培养基。
3.细胞的解冻：从冷冻保存的细胞库中取出细胞，进行解冻。
解冻过程要尽可能快速，以减少细胞对冷冻损伤的敏感性。
4.细胞传代：当细胞达到一定的密度时，需要将其传代，以维持细胞的生长状态。
传代过程包括细胞的分离、计数和重新接种。
5.细胞培养条件的控制：控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等。
通常细胞培养箱会提供稳定的培养环境。
6.细胞的观察和检测：定期观察细胞的形态、生长状态，并进行必要的细胞检测，如细胞计数、细胞周期分析等。
7.防止细胞污染：严格遵循无菌操作规程，防止培养物受到细菌、真菌、支原体等的污染。
使用无菌操作室和经过无菌处理的实验器材。
8.制备细胞冻存物：定期制备细胞冻存物，以备将来使用。
冻存物的制备需要使用适当的冻存液和合适的冷冻保存温度。
9.特殊操作：针对具体实验需求，可能需要进行细胞转染、感染、药物处理等特殊操作。
在进行动物细胞培养时，实验者需具备丰富的培养经验和相关技能，同时需按照实验室的标准操作规程进行操作，以确保实验的准确
性和可重复性。
动物细胞培养实验方案
动物细胞培养实验方案一、实验目的：1.掌握动物细胞的培养技术；2.了解动物细胞的生长特点和培养条件要求；3.学习观察和分析动物细胞的形态变化和生长状态。
二、实验器材与试剂准备1.器材：细胞培养器皿（如培养皿、蜡烛罩、CO2培养箱等）、离心机、显微镜、细胞计数板、计时器等；2.试剂：细胞培养基、培养液添加剂（如酶、抗生素等）、PBS缓冲液、生长因子、染色剂等。
三、实验步骤1.细胞培养基的配制：按照制定的配方将培养基粉末加入适量的无菌去离子水中，搅拌均匀后，进行高温高压灭菌，冷却后分装至培养器皿中；3.细胞处理和接种：将收集到的组织先用PBS缓冲液洗涤，然后使用细胞裂解酶或胰酶等消化酶消化组织，使细胞分散，处理成单个细胞后，用细胞计数板计数，并将细胞悬液接种到预先准备好的培养器皿中；4.细胞培养条件的控制：将培养器皿置于CO2培养箱中，设定适当的温度（通常为37℃）、湿度和CO2浓度（通常为5%），并保持稳定；5.细胞培养的观察和记录：观察培养皿中细胞的形态变化和生长状态，记录细胞的外观、增殖情况、易于观察的指标等；6.细胞的子培养和冻存：当细胞达到一定密度时，可以进行子培养，即将细胞从一个培养皿中转移到新的培养皿中，以促进细胞的增殖和保存细胞生物资料。
此外，也可以将分散的细胞加入由培养液和冻存剂组成的试管中，通过冷冻的方式保存细胞，并用于后续的实验。
四、实验控制与常见问题的解决1.环境控制：细胞培养箱中的温度、湿度和CO2浓度的调整应尽量保持稳定；2.培养基的配制：根据细胞培养物的不同，可以选择不同配方的培养基，确保培养基的质量符合要求；4.洗涤步骤：组织或细胞的洗涤步骤应轻柔，避免对细胞的损伤；5.细胞的接种量：对于粘附性细胞，接种量应适当，以避免细胞过度堆积或过度稀释。
五、实验结果和分析观察培养皿中细胞的生长状态、细胞数量以及形态的变化，记录生长状态、增殖情况和其他可以观察到的指标，并进行数值化分析和统计。
动物细胞培养技术实验指导(全面)
实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
动物细胞原代培养实验项目指导
附件-4综合设计性实验项目指导一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。
三、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。
这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。
原代培养是建立各种细胞系的第一步。
利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。
原代培养科分为组织培养法和消化法两种。
台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
四、实验材料：1.新生兔2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。
2. 取一定量的配制好的DMEM培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。
（二）新生兔细胞原代培养1. 准备（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
（2）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
实验 动物细胞培养基础实验技术
实验动物细胞培养基础实验技术——器械的清洗与消毒实验目的：学习并掌握细胞培养使用的器皿、器械的洗涤和消毒。
实验用品：1．仪器和用品：超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器、紫外灯、0.22μm/0.45μm微孔滤膜。
2．试剂：75%酒精、5%HCl、1‰新洁尔灭、重铬酸钾。
实验内容：1．准备培养用血清瓶（PBS、培养基，约10套，包括20、50ml）、培养瓶（50个）、玻璃滴管（若干）、离心管（10ml）、EP管若干、不锈钢滤器、胶塞、滴头等。
2．分别包装上述物品，其中血清瓶和瓶盖分别包装，玻璃吸管置于不锈钢筒中、玻璃离心管、 EP管分别置于饭盒中。
3．将上述物品置于高压灭菌锅中进行消毒灭菌。
4．实验室准备。
实验步骤（一）清洗1．玻璃器皿的清洗浸泡刷洗浸酸冲洗（1）. 新购玻璃血清瓶先用洗衣粉洗，再以0.1-0.05 mol/l HCl 浸泡数小时，然后用铬酸浸泡过夜，最后用自来水、一次与二次去离子水洗净后才能开始使用。
（2）. 用过之玻璃血清瓶，用洗衣粉洗净后铬酸浸泡过夜，最后用自来水、用一次与二次去离子水冲洗干净。
此外，玻璃器皿的瓶子的盖子必须也泡铬酸，培养瓶瓶盖可以不用泡铬酸，高温灭菌的时候要拧上瓶盖，留有一定的缝隙，灭菌后盖紧。
瓶盖的上面应当用锡箔纸或者牛皮纸包住，用绳子扎紧2．塑料器皿的清洗自来水充分浸泡冲洗 2%NaOH浸泡过夜蒸馏水漂洗3次 2%-5%盐酸浸泡30min 自来水冲洗晾干紫外线照射30min3．胶塞等橡胶类的清洗自来水冲洗 2%NaOH 煮沸15min 自来水冲洗蒸馏水煮沸10min 自来水冲洗5次以上2%-5%HCl煮沸15min 晾干晾干后高压灭菌4．金属器械的清洗新购置的器械用过的器械（二）包装分为局部包装和全包装。
为了防止消毒灭菌后再次遭受污染。
按照不同类别进行包装。
（三）消毒灭菌主要包括物理法和化学法。
物理法：热灭菌、蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、熏蒸消毒、煮沸消毒。
动物细胞培养技术实验
实验十五动物细胞培养技术及其应用一．实验目的通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。
二. 实验内容1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术；2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术；3.细胞污染检测方法与技术；4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。
三．实验用品1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH试纸、酒精棉球等3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。
四．实验方法与步骤（一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏1. 缓冲液及培养基配制Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。
4℃下保存。
胰蛋白酶液：称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。
MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。
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实验篇实验一实验器材的清洗实验物品（一）每一大组公用物品（每班分6大组）吸球4个、酒精棉球瓶两个、消毒水一瓶、吸瓶两个、计数板1块、洗液缸一个、95%酒精1瓶。
（二）每一小组公用物品（两人一小组）刻度吸管5毫升4支, 小漏斗1个、 80-200铜滤网1块、培养皿2个、 l00毫升盐水瓶及塞子4个、l0毫升盐水瓶及塞子1个、100ml培养瓶及塞子4个、10ml 培养瓶及塞子1个、镊子1个、剪刀1把、冻存管（1.5毫升，2毫升）2个、软毛刷2个、塑料盆一个。
（二）公用物品小滤器、大滤器2个、1000毫升量筒2个、100毫升量筒2个、家用剪刀、耐酸乳胶手套长的两双、短的四双、酒精一壶、玻璃棒几个、 0.22μm的小滤膜一盒、电炉3个。
清洗注意事项和要求（一）使用后的实验器材应立即投入清水中。
带毒的玻璃器皿需先浸泡在5％来苏儿或1％盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。
（二）浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。
（三）煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂（直径35厘米的铝锅，用洗衣粉10克左右）；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化PH值上升。
（四）软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。
玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液PH和毒害细胞。
（五）浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。
（六）器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。
清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。
（七）清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落人灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。
（八）刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。
操作方法（一）清洗液（俗称酸液）的配制方法常用清洁液配方重铬酸钾100g，浓硫酸200ml，蒸馏水800ml。
以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。
配好后倒入洗液缸中备用。
新配制的清洁液呈棕红色。
当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。
配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。
（二）物品的清洗1、新购置物品玻璃器皿清洗步骤清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干（或50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。
2、用过的玻璃器皿清洗步骤带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→刷洗→自来水冲洗→凉干（50℃烤干）→浸入清洁液中（俗称浸酸）过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次或浸泡2次（每次24小时）→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。
3、橡皮帽和橡皮塞的清洗新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法如下；2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2～5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用．4、塑料制品（塑料培养板、针头式加压塑料小滤器）的清洗用后立即用流水冲洗→浸于自来水中过夜→用纱布或棉签刷洗→流水冲洗→晾干→浸于清洁液中15分钟→流水冲洗20遍→去离子水浸洗三次→双蒸水中浸泡24小时→晾干备用。
注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开，按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，备用。
5、不锈钢除菌滤器的清洗先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2～3次（去离子水浸泡24小时）→三蒸水冲洗2～3次或浸泡24小时→干燥备用。
6、镊子、剪刀纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。
7、金属滤网自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。
实验二实验器材的包装和消毒实验用品实验一中清洗的所有物品、脱脂棉一卷/班、纱布一卷/班、高压锅一个/班、无菌操作台一台/组、牛皮纸1张/组，纸绳一卷/组、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔一个/组。
实验方法（一）包装1、包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。
2、瓶类：需用局部包扎，用牛皮纸包扎。
随后单个或几个一起用纸包好。
3、玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等）加脱脂棉，吸管、滴管，随后置玻璃吸管筒或铜制、铝制吸管筒内（内放纱布），塞上棉塞或盖上有孔盖子（内外孔对好），外包上两层牛皮纸，若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。
4、带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。
6、为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面注以符号或写上字“－”“＋”。
（二）器皿的消毒干热消毒主要用于玻璃器皿的消毒。
160℃、l20分钟，消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。
湿热消毒即高压蒸汽消毒：布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些培养用液等都可用此方法消毒灭菌。
消毒时间是从压力达到15磅，温度达到121℃时算起。
一般蒸气消毒30分钟。
橡皮手套和储在小瓶内的溶液都不应超过15分钟。
消毒后，调节活塞使压力在7分钟左右均匀地下降到零。
这样能使任何可能存在的液体得以与周围蒸气以相同的速度散热，而不至于激烈的沸腾。
各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品 l0磅l0分钟布类、玻璃制品、金属器械等 15磅20分钟实验三培养用液的配置实验用品实验器材：1000ml的量筒2个，1000ml的烧杯2个，磁力搅拌器一台，玻璃棒两个，感量0.1mg的分析天平,100ml的盐水瓶若干,化学试剂:NaCl,KCl, KH2PO4 ,Na2HPO4.12H2O 2.85g 或Na2HPO4.2H2O, NaHCO3, 小牛或胎牛血清,胰蛋白酶,醋酸。
实验要求及方法（一）PBS液实验室常用含0.85%,pH7.2的PBS(简称pH7.2的PBS)1.PBS贮存液配法NaCl(AR) 8.5g； KCl(AR) 0.2g； KH2PO4 0.27g；Na2HPO4.12H2O 2.85g (或Na2HPO4.2H2O 1.13g) 溶于100ml双蒸水中。
2.PBS应用液配法取贮存液50ml加双蒸水450ml即成,经103kPa(121.3℃)15分钟灭菌,置室温或4℃保存备用。
3．配制BSS液的要求（l）BSS液中各试剂规格为一级GR试剂（guaranteed reagent）或二级AR （analytic reagent）试剂.（2）配制后液体呈桃红色，pH 7.4左右没有混浊和沉淀。
（3）含钙镁离子的物质要单独溶解.（4）可配制10倍浓度的贮存液，滤过消毒，分装，每瓶10毫升；冰箱保存。
使用时每瓶加三蒸水至 l00毫升。
（5）配制离散细胞用的消化液和细胞洗涤液时，宜采用无钙、离子的D—Hanks 液，或PBS液。
（二）血清灭活处理的方法:1.选用与血清瓶同规格的对照瓶一个。
2.对照瓶内放入与血清等体积的水。
3.温度预试：使水浴锅温度保待在56℃。
放入内4～5支温度计，选择2～3支温度计，4.血清灭活：血清瓶与带温度计的对照瓶一齐放入水浴箱中，待温度计所示温度上升至56℃时定时30分钟。
5.大瓶血清灭活后进行分装。
6.分装后，抽样做无菌试验，－20～－70℃保存。
（三）配制合成培养基（液）注意事项。
1．用三天内制备的玻璃三蒸水配制培养液2．按二周用量配制为宜，配量过多，存放时间过长会造成培养基老化、变质、产生沉淀。
3．培养液中各成分是否完全溶解的判断方法：将培养液置室温或4℃冰箱30分钟后，观察瓶底有无颗粒产生。
4．根据实验需要，在培养液中加入适量37℃单独溶解的NaHCO3溶液。
正常体细胞培养液中NaHCO3量为20～22克／升，肿瘤细胞为1.5～1.7克／升。
5．干粉培养基不易溶于水，实验室采用空气CO2助溶法即将甲液在磁场上搅拌一段时间，当甲液pH值下降到5.8左右时（橙黄色）氨基酸和维生素基本溶解,在甲液内再加入溶解有NaHCO3的乙液，两液混和后，营养液pH值为7.0～7.1，抽滤后pH值上升0.1。
此法操作简便，营养液pH值稳定。
（四）胰蛋白酶液胰蛋自酶是一种黄白色粉末，水解蛋白质时作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架．从而使细胞分离。
胰蛋白酶的活力是用解离酪蛋白的能力表示的，常用的有1：125和1:250两种,即1份胰蛋白酶能解离125份或250份酪蛋白。
不同的细胞对胰蛋白酶液的浓度、作用温度和作用时间等要求也不一样。
一般来说，浓度越大、温度越高、作用时间越长，对细胞的分离能力也越大，但超过一定限度就会损伤细胞。
常用的胰蛋白酶液的浓度是0.25％利0.125％，作用温度37℃或室温，pH7.4左右。
Ca2+ Mg2+和血清的存在都会降低其活力O.25％胰蛋白酶液的配制方法如下。
l.过滤消毒法。
①按实验需要称取酶粉，用少量D-Hanks液或PBS液将胰蛋白酶粉调成糊状。
②加适量D-Hanks液或PBS液(橙红色)，磁力搅拌溶解③溶解后的酶液（深红色）滤过除菌，分装，-20℃冻存。
2.高热消毒法。
利用胰蛋白酶在酸性条件下有较好的热稳定性对其进行高热消毒。
①、按实验需要称取酶粉溶于1毫摩尔／升pH3.0的HCl中。
②、酶液和2倍D－Hanks液同时在0.1兆帕，120℃条件下灭菌20分钟。
③、两液冷却至室温时，等量混匀。
酶液浓度高时，消毒后有少量的沉淀，去除沉淀后，两液等体积混匀。
然后用10摩尔／升的NaOH调消化液PH值至7.2（橙红色或深红色）④、经计算，消毒后酶浓度下降50％。
如消毒前酶浓度为0.1%～0.5％，消毒后为0.05％～O.25％。
高热消毒法比过滤消毒法更加简便、安全、可靠。
（五）PH调整液1、 NaHCO3溶液常用的浓度有7.4％、5.6％、3.7％三种，配制时37℃三蒸水溶解后通过滤膜过滤除菌，分装于安瓶中4℃冰箱保存，每支一次用完。
使用时，NaHCO3液要逐滴加入，并不时搅动培养液。
以防pH值过高。
2、 10％醋酸液高压灭菌,分装， 4℃冰箱保存。
使用方法和要求同NaHCO3液。
（六）200毫摩尔／升L-谷氨酰胺L－谷氨酰胺2.9222克（M=146.15），加适量50℃三蒸水溶解．定容至l00毫升，滤过除菌，1毫升／安瓶，一20℃保存使用时每 l00毫升培养基中加 1毫升谷氨酰胺。