第十六章：哺乳动物基因工程

缺点：转基因进入细胞后往往多拷贝 随机整合在染色体上，导致受体细 胞基因灭活或转基因不表达。

1.磷酸钙共沉淀法 ①基本步骤
A.细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA 的能力。
B.将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐， 生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中。

C.由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉 淀物进入细胞，DNA释出后先进入细 胞质、再进入细胞核，整合到受体细 胞的染色体上。

4.DNA显微注射法 应用玻璃显微注射器，可以把重组 DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞 质或细胞核。

①真正的显微注射(true microinjection) 法，DNA是由注射针直接注入细胞。

②“穿刺”(pricking)导入法，DNA是 处在细胞周围培养基中，它通过穿 刺形成的小孔进入细胞的内部，或 是随穿刺的针头一道进入的。
⑤安全性能好：不合成分泌致病物 质，不致癌。

三、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 1.营养缺陷型哺乳动物受体细胞

①含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺
陷的受体细胞（tk-）：不能在含有次黄嘌
呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养 基（HAT培养基）上生长，载体上的标记基 因tk能与之遗传互补。

②含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编

其优势如下：
①遗传背景清楚，生理代谢稳定。 ②与人的亲缘关系接近，外源蛋白修
饰准确。 ③基因转移和载体表达系统完善。

④耐受剪切力，便于大规模培养。
⑤被美国FDA确认为安全的基因工程受体 细胞。

第三节 转基因导入动物体内的方法 一、动物细胞物理转化法
优点：转基因不含任何病毒基因组片 段，对于基因治疗尤为安全。

二、高等哺乳动物受体细胞的条件 1.以高效表达外源基因的高等哺乳 动物受体细胞应具备下列条件：
①细胞系特征：丧失细胞接触抑制 性和锚地依赖性特征，便于大规 模培养。

②遗传稳定性：外源基因多次传代 后不至于丢失，易于长期保存。
③合适的标记：便于转化株的筛选 和保持。

④生长快且齐：分裂周期短，生长 均一，便于控制。

④第二种脂质体转染法又称脂质体载体法： 它是将外源DNA包装在脂质体的内部，然 后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间 的融合作用，使外源DNA进入细胞质，尔 后再进入细胞核，实现基因的表达。

⑤脂质体载体法的优越性：
A.制备程序比较简单，可以通过多 聚碳酸脂滤膜消毒灭菌；
B.用它包装的DNA在4℃下可长期保 存不失活性，

高等哺乳动物转基因技术

高等哺乳动物细胞基因表达技术

转基因动物个体

动物工程细胞

哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型
人体基因治疗

蛋白质多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型

第二节 转基因的动物受体细胞 一、高等哺乳动物细胞的生长特性
1.正常的哺乳类动物细胞具有下 列四大生物学特征：
①锚地依赖性：细胞必须附在固体 上或固定的表面才能生长分裂。

②血清依赖性：细胞必须具有生长因 子才能生长。
③接触抑制性：细胞与细胞接触后， 生长便受到抑制。
④形态依赖性：细胞呈扁平状，并有 长纤维网状结构。

上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培 养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平 面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正 常细胞会改变某些特征而越过生理临界点， 继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞 系形成，此时的细胞成为细胞系。
码基因缺陷的受体细胞（hprt-）：不能在
含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶 核苷的培养基（HAT培养基）上生长，载体 上的标记基因hprt能与之遗传互补。

2.哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记：

3.常用的高等哺乳动物受体细胞 目前，用于医疗用品大规模生产的高 等哺乳动物受体细胞主要是：中国仓 鼠卵巢细胞。

影响因素： 脉冲的最大电压
脉冲持续的时间 与DNA浓度则无多大关系。

3.脂质体包埋法
脂质体(liposomes)是一种人造的脂 质小泡(lipid vesicles)，外周是脂 双层，内部是水腔。用它作载体可以 把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。

①脂质体的制备的两种方法：
A.将适宜的脂质悬浮在液体介质中， 然后迅速地振荡，使之形成大小相 当一致的脂质体；

②影响磷酸钙转染效率的因素：
A.DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量； B.共沉淀物与细胞接触的保温时间； C.甘油或DMSO等促进因子作用的持续
时间等。

磷酸钙转染的最适条件筛选

培养皿号 (10 cm)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

pXGH5(ug)

pUC13(ug)

细胞与沉淀 物的保温时
间(h)

甘油刺激时 间(min)

5

5

6

-

5

15

6
Leabharlann Baidu
-

5

35

6

-

5

5

16

-

5

15

16

-

5

35

16

-

5

5

6

3

5

15

6

3

5

35

6

3

5

5

16

3

5

15

16

3

5

35

16

3

2.电击转化法（electroporation）
将 受 体 细 胞 悬 浮 于 含 有 待 转 化 DNA 的溶液中，在盛有上述悬浮液的电 击池两端施加短暂的脉冲电场，使 细胞膜产生细小的空洞并增加其通 透性，此时外源DNA片段便能不经 胞饮作用直接进入细胞质。

二、动物病毒转染法
通过病毒感染的方式将外源基因 导入动物细胞内的转基因方法。 具有定向性好，实验重复性佳， 导入效率高等优点。缺点是载体 宿主范围有限。
第十六章 哺乳动物基因工程

第一节 高等哺乳动物基因工程的基本概念
一．概念： 动物基因工程是利用DNA重组技术 对动物所进行的工程操作。

二．分为：
1.遗传学动物基因工程：外源基因能 够通过配子进行垂直传递并稳定的 遗传。
2.非遗传性动物基因工程：转基因仅 在当代表现，不能够遗传给子代。

高等哺乳动物的基因工程
B.用小型的注射针头，将脂质注射到 酒精水溶液中，并快速混匀。

②脂质转染法：以脂质体为媒介的外源 DNA导入受体的方法，叫做脂质转染法。

③第一种脂质转染法：将外源DNA与阳离子 型 的 脂 质 体 混 合 形 成 DNA- 脂 质 复 合 物 。 这种复合物可有效地被受体细胞捕获， 实现基因的高频率转移，故这种方法又 叫做DNA-脂质复合物转染法。在这个过 程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部， 而是通过两者之间的静电引力作用结合 在一起的。