第十六章：哺乳动物基因工程
基因工程和蛋白质工程
（2）用噬菌体或质粒直接从宿主细胞中将目 的基因携出
（3）使用相应的mRNA分离基因
二、基因载体
1.质粒——染色体以外的遗传单元
2.噬菌体——感染细菌的病毒
1.质粒——染色体以外的遗传单元
质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在 细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入 的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠 杆菌素因子和抗药因子等
+
连接
质粒载体
重组DNA分子 经转化或病毒感染 导入宿主细胞
宿主染色体
对含有重组DNA 分子的选择 无性繁殖（克隆）
重组DNA分子合成和克隆过程
2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体 的细胞
（1）插入失活法 （2）放射性探针检测法 （3）R-环检测法 （4）免疫测定法
（1）插入失活法
在现在的基因工程操作中，所使用的载体 通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带 有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具 有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因 与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛 选。
一、蛋白质工程的概念
蛋白质工程(protein engineering)：通过改造与 蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成 新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因 表达而获得具有新的特性的蛋白质技术
1、基因定点突变——定做新蛋白质 2、蛋白质设计——对天然蛋白质的修饰
蛋白质工程 举例：
定点突变技术：
如果外源DNA 插入，氨卞青霉素 抗性基因失活
如果外源DNA插 入，四环素抗性基 因失活
pBR322质粒结构
（2）放射性探针检测法
利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检 测有外源DNA插入的重组体，是一种快速而 灵敏的方法。
哺乳动物转基因技术
The first animal ever patented. This mouse, the so-called oncomouse, Harward University received a patent for the transgenic animals in 1988, has been genetically modified so that its cells are prone to cancer.It was produced by microinjection c-myc and mouse mammary tumor virus .
1.Introduction
⑴Definition and applications ⑵History of this technique
A. 1953年J. D. Watson & F. H. C. Crick 提出 DNA双螺旋结构.
Watson,Crick and Wilkins were awarded the Nobel Prize in Physiology or Medicine来自H. 转基因方法的探索
反转录病毒转染→显微注射→ 精子载体→ ES细 胞转染、基因打靶→ 性原细胞转染→体细胞转染、 打靶和细胞核移植转基因
1. Schnieke et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science. 1997, 278:2130-2133. 2. McCreath et al. Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells. Nature. 2000, 405:1004-1005. 3. Keefer et al. Generation of dwarf goat (Capra hircus) clones following nuclear transfer with transfected and nontransfected fetal fibroblasts and in vitro-matured oocytes. Biol. Reprod. 2001,64:849856. 4. Lai et al. Production of a-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science. 2002,295:1089-1092.
哺乳动物基因工程xin
③SV40 DNA载体的特点：
基因表达好：外源基因能高效表达； 基因重排高：病毒基因组和重组分子 常发生重排和缺失现象； 宿主范围窄：只能转染猴细胞； 装载量较小。
4. 反转录病毒载体 ①反转录病毒具有许多优点，便于发展作为 动物基因克隆载体。 在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基
子大小约为36kb。
腺病毒可插入较大的外源DNA片段，而且还可
以在寄主细胞中大量地增殖。其次，能最大
限度地合成病毒编码的蛋白质。
①腺病毒的一般生物学特性 带有反向的末端重复序列，而且在每一 条单链的5’-末端还共价地连接着一种蛋 白质分子。 当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会
自发地环化起来，尔后许多环形分子又
5
5 5 5 5 5 5
15
35 5 15 35 5 15
6
6 16 16 16 6 6
3 3
9
10 11 12
5
5 5 5
35
5 15 35
6
16 16 16
3
3 3 3
2.电击转化法（electroporation）
将受体细胞悬浮于含有待转化DNA的溶液 中，在盛有上述悬浮液的电击池两端施 加短暂的脉冲电场，使细胞膜产生细小
宿主范围广：对受体细胞是否处于分裂
期要求不严格。
使用效果好：外源基因在载体上容易高 效表达。
3.猴肿瘤病毒（SV40）
SV40病毒编码的蛋白质
蛋白质 T抗原 合成时间 早期 功能 启动DNA复制
t抗原
VP1 VP2 VP3
早期
晚期 晚期 晚期
未知
主要的病毒外壳蛋白 次要的病毒外壳蛋白 次要的病毒外壳蛋白
(完整word版)陈阅增普通生物学第3版课后思考题(完整版)
第一章．绪论1、生命体细胞作为基本单位的组构，有哪些重要的特点？2、为什么说生物体是一个开放的系统？3、在五界系统中，为什么没有病毒?4、在二界或三界系统中,细菌、真菌均隶属于植物界，在五界系统中，它们都从植物界中划出来，或独立或为原核生物界和真菌,这样做的理由是什么?5、三叶草—蝴蝶—蜻蜓—蛙—蛇—鹰是一种常见的食物链，但其中没有分解者，试将分解者以适当方式加到这个食物链中。
6、分子生物学的发展如何深化和发展了人们关于生物界统一性的认识？7、怎样理解科学是一项具有自我修正机制的社会活动？8、为什么说地球上的生态系统是目前人类生存的地球表层环境得以维持的支持系统？第二章．生命的化学基础1、动物是由于氧气（O2）氧化糖(C6 H12 O6)产生CO2和H20 获得能量.假设你想知道所产生的CO2中的氧是来自于糖还是氧气,试设计一个用180作为示踪原子的实验来回答你的问题。
2、有人说：“不必担心工农业所产生的化学废料会污染环境，因为组成这些废料的原子本来就存在于我们周围的环境中."你如何驳斥此种论调？3、兔子吃的草中有叶黄素，但叶黄素仅在兔子的脂肪中积累而不在肌肉中积累。
发生这种选择性积累的原因在于这种色素的什么特性？4、牛能消化草,但人不能,这是因为牛胃中有一种特殊的微生物而人胃中没有.你认为这种微生物进行的是什么生化反应?如果用一种抗生素将牛胃中所有的微生物都消灭掉，牛会怎样?5、有一种由9种氨基酸组成的多肽，用3 种不同的酶将此多肽消化后，得到下列5个片段（N 代表多肽的氨基酸)：丙一亮一天冬一酪一撷一亮酪一撷一亮N 一甘一脯一亮天冬一酪一撷一亮N 一甘一脯一亮一丙一亮试推测此多肽的一级结构。
第三章. 细胞结构与细胞通讯1、为什么低等动物不能单纯靠细胞体积的膨大而进化为高等动物?2、原核细胞和真核细胞的差别关键何在？3、植物一般不能运动，其细胞的结构如何适应于这种特性？4、动物能够运动，其细胞结构如何适应于这种特性？5、细胞器的出现和分工与生物由简单进化到复杂有什么关系?6、动、植物细胞的质膜在成分和功能上基本相同,其生物学意义何在？7、最近发现了食欲肽（orexin ），一种似乎能调节任何动物食欲的信号分子。
基因工程默写
基因工程1.基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA 分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
2.1944年，艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移3.1958年，梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
随后不久，克里克提出中心法则。
4.1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
5.1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
6.1972年，伯格首先在体外进行了DNA改造的研究，成功地构建了第一个体外重组DNA 分子7.1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，并实现物种间的基因交流。
至此，基因工程正式问世。
8.1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼9.1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
此后，基因工程进入了迅速发展的阶段。
10.1985年，穆里斯等人发明PCR，为获取目的基因提供了有效手段。
11.2013年，华人科学家张锋（1982—）及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术——CRISPR（成簇规律间隔短回文重复）技术编辑了哺乳动物基因组。
该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
第1节重组DNA技术的基本工具1.切割DNA的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶，这类酶主要是从中分离纯化出来的。
它们能够的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开，产生两种形式的末端。
2.DNA连接酶分为两类，一类是，另一类是。
后者既可以缝合双链DNA片段互补的，又可以缝合双链DNA片段的，但连接后者的效率比较低。
高等哺乳动物的基因转移
高等哺乳动物的基因转移
哺乳动物细胞的物理转化法 哺乳动物细胞的病毒转染法
哺乳动物细胞的物理转化法
利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达 盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻 了负担。但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随 机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达。
哺乳动物细胞的病毒转染法
以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒 共转染特定的受体细胞。这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导 入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围 有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等。
脂质体介导法
将待转化的DNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面 活性剂的存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。
将这种脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融 合，DNA随即进入胞质和核内。
利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLa 细胞。
哺乳动物细胞的物理转化法
显微注射法
通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌 鼠，从其输卵管内取出受精卵；
借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄 性原核内。
上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操 作，所以不太适用于基因的克隆和表达。
哺乳动物细胞的物理转化法
血影细胞介导法
哺乳动物细胞的物理转化法
磷酸钙共沉淀法
将待转化的DNA溶解在磷酸பைடு நூலகம்冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此 时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；
将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时 此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受 体细胞；
哺乳动物细胞表达系统
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
哺乳动物转基因技术研究
哺乳动物转基因技术研究摘要介绍了转基因哺乳动物的研究概况，综述了哺乳动物转基因技术基本方法，外源基因的整合和表达，转基因哺乳动物的检测方法以及哺乳动物转基因技术的应用和存在的问题。
关键词转基因哺乳动物；外源基因；转基因技术20世纪70年代开创的DNA重组技术已被广泛的应用在生命科学的各个研究领域，并取得了丰硕的研究成果。
转基因哺乳动物自20世纪80年代初诞生以来，一直是生命科学研究和讨论的热点，随着研究的不断深入和实验技术的不断完善，转基因技术得到了广泛的应用。
转基因技术是20世纪遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第4代技术，是生物学领域发展史上126年中14个转折点之一。
1转基因哺乳动物的研究概况1980年Gordon等首先采用受精卵原核注射方法，将疱疹病毒基因SV40DNA 片段和PBR322原核DNA分别注射到小鼠受精卵的雄原核内，移植受体后获得了相应的转基因小鼠。
1982年Palmiter等又将带有小鼠MT启动子的大鼠生长激素基因（rGH）导入小鼠受精卵，得到了21只小鼠，其中7只带有目的基因，有6/7的小鼠比同窝对照组生长快近2倍，这些快速生长的转基因小鼠被誉为“超级小鼠”（super mouse），表明整合了的外源基因可以在宿主体内得到有效正确表达，表达产物可以在宿主动物体内行使正常的功能。
自此便掀起了培育转基因动物的大潮，按照研究转基因小鼠的思路，转基因兔、转基因绵羊、转基因猪、转基因山羊及转基因牛都陆续育成。
特别是1997年英国罗斯林研究所克隆羊“多莉”的诞生，突破了有性生殖的框架，表明高等动物也可以由无性生殖来繁殖。
同年美国PPL公司和罗斯林研究所合作，利用该法生产出具乳腺表达人第九因子的绵羊[1]。
利用转基因克隆技术获得了克隆猪、体内含有外源基因的转基因猪、体内有2个基因被“关闭”了的转基因克隆猪和基本不含人体免疫排斥基因的“基因敲除”克隆猪等[2]。
我国从1984年开始转基因动物研究，并于同年最先获得了含人B2珠蛋白基因的转基因小鼠。
基因工程-外源基因在哺乳动物细胞中的表达
基因工程523 416789重组DNA技术与基因工程的基本概念重组DNA 技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化8.4 高等哺乳动物的基因转移8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达8.3 高等哺乳动物的载体系统8.2 高等哺乳动物的受体系统8.1 高等哺乳动物基因工程的基本概念8.5 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白高等哺乳动物细胞的生长特性动物基因工程指利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。
遗传学动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传。
非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。
8.1 高等哺乳动物基因工程的基本概念8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型8.1.1 高等哺乳动物细胞的生长特性8.1.2 高等哺乳动物受体细胞的条件8.1.3 高等哺乳动物受体细胞的遗传标记8.1.4 常用的高等哺乳动物受体细胞8.1 高等哺乳动物基因工程的基本概念8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达8.1.1 高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征：锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制形态依赖性：细胞呈扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代，且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。
有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞称为细胞系。
初中生物十八章知识点归纳总结
初中生物十八章知识点归纳总结生物学是一门研究生命的科学，它涉及到从微观的细胞结构到宏观的生态系统的各个方面。
作为初中生物的学习者，我们需要对生物的各个知识点进行全面的了解和掌握，以便更好地理解和应用生物学的原理。
以下是初中生物十八章的知识点归纳总结。
第一章：细胞的基本结构和功能细胞是生物体的基本单位，它具有以下基本结构和功能：1.细胞膜：由脂质双层构成，控制物质的进出。
2.细胞核：包含遗传物质DNA，控制细胞的生命活动。
3.细胞质：包含细胞器，参与细胞的代谢过程。
第二章：遗传的基本规律遗传是生物进化和变异的基础，遵循以下基本规律：1.孟德尔遗传规律：包括显性和隐性等基因的遗传方式。
2.染色体遗传：特定基因通过染色体传递给后代。
3.基因突变：基因序列的突变可能导致遗传多样性。
第三章：细胞的有丝分裂有丝分裂是细胞的一种重要的生殖方式，包括以下步骤：1.前期：染色体复制和准备分裂。
2.中期：染色体排列和纺锤体形成。
3.后期：染色体分离和细胞分裂。
第四章：细胞的无丝分裂无丝分裂是原核生物细胞的一种特殊分裂方式，主要包括以下步骤：1.染色体复制和准备分裂。
2.染色体分离和细胞分裂。
无丝分裂与有丝分裂的区别在于核分裂时是否伴有纺锤体的参与。
第五章：遗传的分子基础遗传的分子基础是DNA的结构和功能，包括以下方面的内容：1. DNA的结构：由核苷酸组成的双螺旋结构。
2. DNA的复制：通过DNA聚合酶进行，保证遗传信息的传递。
3. DNA的转录和翻译：转录产生mRNA，翻译产生蛋白质。
第六章：变异与进化变异与进化是生物多样性的基础，涉及以下内容：1.突变：导致个体间基因差异的变化。
2.自然选择：适应环境的个体更有生存优势。
3.进化：适应环境的种群逐渐改变。
第七章：植物的组织与结构植物的组织结构决定了植物的形态和功能，包括以下方面的内容：1.细胞壁：由纤维素构成的植物细胞的外层。
2.细胞质器官：包括叶绿体、细胞核等。
基因组学杨金水电子版 基因工程 电子版
基因组学杨金水电子版基因工程电子版导读：就爱阅读网友为您分享以下“基因工程电子版”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持! 作者：吴乃虎出版社：高等教育出版社第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系二、基因工程的诞生与发展第二节基因工程是生物科学发展的必然产物一、基因是基因重组的物质基础二、DNA的结构和功能三、基因操作技术的发展促进基因工程的诞生和发展四、基因工程的内容第三节基因的结构——基因操作的理论基础一、基因的结构组成对基因操作的影响二、基因克隆的通用策略第一篇基因操作原理第二章分子克隆工具酶第一节限制性内切酶一、限制与修饰二、限制酶识别的序列三、限制酶产生的末端四、DNA末端长度对限制酶切割的影响五、位点偏爱六、酶切反应条件七、星星活性八、单链DNA的切割九、酶切位点的引入十、影响酶活性的因素十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性第二节甲基化酶一、甲基化酶的种类二、依赖于甲基化的限制系统三、甲基化对限制酶切的影响第三节DNA聚合酶一、大肠杆菌DNA聚合酶二、KIenow DNA聚合酶三、T4噬菌体DNA聚合酶四、T7噬菌体DNA聚合酶五、耐热DNA聚合酶六、反转录酶七、末端转移酶第四节其他分子克隆工具酶一、依赖于DNA的RNA聚合酶二、连接酶三、T4多核苷酸激酶四、碱性磷酸酶五、核酸酶六、核酸酶抑制剂七、琼脂糖酶八、DNA结合蛋白九、其他酶第三章分子克隆载体第一节质粒载体一、质粒的基本特性二、标记基因三、质粒载体的种类第二节λ噬菌体载体一、λ噬菌体的分子生物学二、λ噬菌体载体的选择标记……第四章人工染色体载体第五章表达载体第六章基因操作中大分子的分离和分析第七章基因芯片技术第八章PCR技术及其应用第九章DNA序列分析第十章DNA诱变第十一章DNA文库的构建和目的基因的筛选第十二章基因组研究技术第二篇基因工程应用第十三章植物基因工程第十四章动物基因工程第十五章酵母基因工程第十六章细菌基因工程第十七章病毒基因工程第十八章医药基因工程第十九章基因工程产品的安全及其管理第一章基因工程概述第一节基因操作与基因工程一、基因操作与基因工程的关系基因操作（gene manipulation）：指对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。
高中生物基因工程知识点总结
高中生物基因工程知识点总结一、基因工程1、基因工程：通过诱导、控制、修饰和组装酶分子改造生物的技术手段，即基因工程。
2、基因是什么：基因是DNA（deoxyribonucleic acid）在调控生物表达的功能单位，它是细胞在传递遗传信息的实体，也是遗传的核心物质。
它决定着生物体的各种性状特征。
3、基因的分类：基因可以按照性质和功能分为结构基因、调控基因和其他基因。
4、基因工程改造方法：基因工程技术有多种，包括基因重组技术、克隆技术、突变技术、转基因技术和增幅技术等。
二、基因工程在实验室中应用1、基因工程在实验室中的应用：基因工程技术在实验室中的应用大大提高了有关生命科学研究的准确性和灵敏度，广泛应用于药物研发、蛋白质检测、临床诊断等领域。
2、基因芯片：基因芯片是一种微小的电子设备，它可以通过在芯片上安装的特定探针来检测特定基因的表达情况或者其他特征。
这种技术可以用来快速检测病毒、细菌等多种病原体，也可以用来研究和监测人体疾病的进展情况。
3、基因测序：DNA测序技术是利用数字技术对准确确定和分析DNA序列的一种技术。
它可以用来检测基因组DNA的结构、查找靶基因和生物多样性、研究基因变异和肿瘤等。
4、基因合成：基因合成技术是以整合DNA的方式制造新的蛋白质的技术，它是把细菌、哺乳动物等常用基因以指定的比例混合在一起。
三、基因工程的发展1、基因工程的发展趋势：基因工程的发展将继续走向优化、分析和精细化。
将进一步提升对生命系统的认识，并能更好地利用基因信息提高生物系统的性能。
2、基因工程的应用场景：基因工程可用于转基因作物的研发、制药新药研发、生物燃料的生物柴油等方面的开发应用，还可以进行生命科学的深入研究，探索新的生物机理。
3、基因工程的未来发展：基因工程技术将在药物研发、医疗诊断、育种良种、食品检测、农药残留和农作物耐药性等方面获得更大的应用，发挥更大的作用，更好地促进人类健康。
1基因工程的基本概念汇总
质粒DNA
基因片段
重组DNA
基因工程的安全性
一、基因工程的安全隐患
1. 对环境的影响
重新组合一种在自然见尚未发现的的生物性状有可 能给现有的生态环境带来不良影响。
2. 新型病毒的出现 制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因 的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。
3. 癌症扩散
我国生产的部分基因 工程疫苗和药物
微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业 化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微 生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决 产量问题，还能大大降低生产成本。
1976年，27岁的风险投资人Robert Swanson 与University of California的教授Herb Boyer共 饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前 景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并 取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。 第一个基因工程公司在学术界和商业界的满 腹怀疑中诞生了！
原 核 生 物 基 因 表 达 的 调 控Βιβλιοθήκη 调节基因启动子操纵基因
结构基因
Ｒ
转录
Ｐ
Ｏ
RNA聚合酶
lacZ
lacY
lacA
转录
信使RNA 翻译
阻抑物
乳糖
半乳糖苷酶
酶
酶
阻抑物与乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基 因结合，使得结构基因进行转录。
1 基因工程的基本概念
C 重组DNA技术与基因工程的基本用途
胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提
取获得大量同一 DNA 分子，也称基因克隆或重组 DNA
基因工程知识点超全
基因工程一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的额，因此又叫做DNA重组技术。
二、基因工程的基本工具1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”2、DNA连接酶-----"分子缝合针”3、基因进入受体细胞的载体“分子运输车”1．“分子手术刀”计计限制性核酸内切酶（限制酶）（1）存在：主要存在于原核生物中。
（2）特性：特异性，一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
（3）切割部位：磷酸二酯键（4）作用：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（5）识别序列的特点：瓠腿沛外林蔚黔睫混日龄睫GC G C用处题挪班岫如」「肿第 CCCG 切割后末端的种类醐帆DNA 分子经限珊片段末端通常有两 种形式产产在它识别序列的条链分别切开时，和平末端。
当限制酶中轴线两侧将DNA的两产生的是黏性末端，当限制酶在它识别序列的 中轴线处切开时，产生的则是平末端。
£coRIGAA ｛在G与ACTT 之间切割）TTC AAG中轴线CCC ：GGG CTTAA黏性末端CCC AATTCGGG Sma I（在G 与C 之间切割）GGG|CCCGGGGCC3.分子运输车载体 ⑴载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一个至多个限制酶切点，供外源DNA 片③具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒，它是能力的双链环状DNA 分子。
⑶其他载体：九噬菌体的衍生物、动植物病毒。
(4)载体的作用：①作为运载工具，将目的基因送入受体细胞。
②在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
【解题技巧】(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
基因工程笔记总结
基因工程笔记总结一、基因工程的概念。
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
又称为DNA重组技术。
（一）基因工程的理论基础。
1. DNA是遗传物质。
- 肺炎双球菌的转化实验和噬菌体侵染细菌的实验证明了DNA是遗传物质，这为基因工程中对DNA的操作提供了理论依据。
2. DNA双螺旋结构和中心法则的确立。
- 沃森和克里克构建的DNA双螺旋结构模型，阐明了DNA的结构特点，为DNA的切割、连接等操作提供了可能。
- 中心法则揭示了遗传信息的传递规律，使得人们能够理解基因表达的过程，从而在基因工程中对目的基因的表达进行调控。
3. 遗传密码的破译。
- 遗传密码的破译使得人们能够根据蛋白质的氨基酸序列推测出相应的DNA序列，反之亦然，这有助于在基因工程中准确获取目的基因并预测其表达产物。
二、基因工程的基本工具。
1. “分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）- 来源：主要从原核生物中分离纯化而来。
- 作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
例如，EcoRI限制酶识别的序列是 - GAATTC -，在G和A之间切开。
- 结果：产生黏性末端（如EcoRI产生的是黏性末端）或平末端。
2. “分子缝合针”——DNA连接酶。
- 类型。
- E.coli DNA连接酶：来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来。
- T4 DNA连接酶：来源于T4噬菌体，既可以连接黏性末端，也可以连接平末端。
- 作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3. “分子运输车”——载体。
- 种类。
- 质粒：是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子，是基因工程最常用的载体。
- λ噬菌体的衍生物：经过改造后可作为基因工程的载体。
基因工程基础知识复习归纳
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体〔供体〕的基因与载体在体外进展拼接重组，然后转入另一种生物体〔受体/宿主〕内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的开展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆〔Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程〞、“DNA重组〞为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因〔供体〕：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子〔克隆载体、表达载体〕。
宿主〔受体〕：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞〔组织、器官或个体〕。
4.基因工程的根本步骤〔切、接、转、增、检〔大肠杆菌是中心角色〕〔1〕目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，别离出带有目的基因的DNA片断。
〔2〕重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记〔抗菌素抗性〕的载体分子上。
〔3〕重组体的转化：将重组体〔载体〕转入适当的受体细胞中。
〔4〕克隆鉴定：摘要转化成功的细胞克隆〔含有目的基因〕。
〔5〕目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
拓展阅读：哺乳动物胚胎工程及其进展简介
哺乳动物胚胎工程及其进展简介随着科学技术的高度发展，建立在生命科学理论基础上的生物技术在人类生产生活中的作用越来越大。
生物技术主要包括四个方面：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。
而动物胚胎工程就是细胞工程的重要组成部分，是动物育种、品种改良的有效途径，是细胞生物学和发育生物学研究生命本质的有效方式。
在这里，我想简单地介绍一下哺乳动物胚胎工程及其进展情况。
1.胚胎体外培养这是胚胎工程的基础。
体外培养要求获得较多的受精卵或胚胎作供体。
学者运用促性腺激素对卵巢发育作用的原理，在母畜发情周期的适当时期注入适量的促性腺激素，可以诱发母畜卵巢内较多的卵泡同时发育、成熟、排卵，这种技术称超数排卵技术，可使动物提供较多的胚胎以供实验。
日本花田章等以培养基加胎儿血浆的方法做出了体外培育卵子成熟的实验，扩大了超数排卵境界，使人们可以利用屠宰场母畜的卵巢，在体外培育得到成熟卵。
2.胚胎移植胚胎体外培养到一定发育阶段，必须移植到同步发情的母畜子宫内。
解决同步发情的方法有两种：一是利用自然同期发情的母畜，此法在实践上较难办到；二是诱发同期发情，就是掌握发情规律，通过注射某些药物（如孕激素、雌激素等）诱发同期发情，这样可减少母畜的数量又能保证每天有一定数量的同期发情母畜作宿主。
在我国、胚胎移植成功率达50％，国外可达70％。
3.胚胎保存一种方法是低温保存在37℃以下，0℃以上使胚胎细胞分裂暂停，新陈代谢降低，但并未停止，保存时不必加入抗冻剂及一系列冷冻和解冻处理，适于短期保存和近距离运输。
再一种方法是超低温保存，利用液氮（-196℃）、液氦（-269℃）保存，胚胎新陈代谢完全停止。
该方法较复杂，有一系列冷冻和解冻过程，而且抗冻剂处理不当就会造成胚胎损伤和死亡。
解冻后经检查鉴定正常的胚胎须立即放在37℃的磷酸盐缓冲液内等待移植。
该法可长期保存及做远距离运输。
对于保存的胚胎，可以鉴别死活，还可对其做出性别判断，准确度达60％4.胚胎分割胚胎发育到囊胚期以前没分化的细胞具有全能性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶 核苷的培养基（HAT培养基）上生长，载体 上的标记基因hprt能与之遗传互补。
2.哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记：
3.常用的高等哺乳动物受体细胞 目前，用于医疗用品大规模生产的高 等哺乳动物受体细胞主要是：中国仓 鼠卵巢细胞。
间(h)
甘油刺激时 间(min)
5
5
6
-
5
15
6
-
5
35
6
-
5
5
16
-
5
15
16
-
5
35
16
-
5
5
6
3
5
15
6
3
5
35
6
3
5Байду номын сангаас
5
16
3
5
15
16
3
5
35
16
3
2.电击转化法（electroporation）
将 受 体 细 胞 悬 浮 于 含 有 待 转 化 DNA 的溶液中，在盛有上述悬浮液的电 击池两端施加短暂的脉冲电场，使 细胞膜产生细小的空洞并增加其通 透性，此时外源DNA片段便能不经 胞饮作用直接进入细胞质。
其优势如下：
①遗传背景清楚，生理代谢稳定。 ②与人的亲缘关系接近，外源蛋白修
饰准确。 ③基因转移和载体表达系统完善。
④耐受剪切力，便于大规模培养。
⑤被美国FDA确认为安全的基因工程受体 细胞。
第三节 转基因导入动物体内的方法 一、动物细胞物理转化法
优点：转基因不含任何病毒基因组片 段，对于基因治疗尤为安全。
⑤安全性能好：不合成分泌致病物 质，不致癌。
三、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记 1.营养缺陷型哺乳动物受体细胞
①含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）编码基因缺
陷的受体细胞（tk-）：不能在含有次黄嘌
呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养 基（HAT培养基）上生长，载体上的标记基 因tk能与之遗传互补。
②含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）编
B.用小型的注射针头，将脂质注射到 酒精水溶液中，并快速混匀。
②脂质转染法：以脂质体为媒介的外源 DNA导入受体的方法，叫做脂质转染法。
③第一种脂质转染法：将外源DNA与阳离子 型 的 脂 质 体 混 合 形 成 DNA- 脂 质 复 合 物 。 这种复合物可有效地被受体细胞捕获， 实现基因的高频率转移，故这种方法又 叫做DNA-脂质复合物转染法。在这个过 程中，DNA并不是被包装在脂质体的内部， 而是通过两者之间的静电引力作用结合 在一起的。
④第二种脂质体转染法又称脂质体载体法： 它是将外源DNA包装在脂质体的内部，然 后通过脂质体的双层膜同受体细胞膜之间 的融合作用，使外源DNA进入细胞质，尔 后再进入细胞核，实现基因的表达。
⑤脂质体载体法的优越性：
A.制备程序比较简单，可以通过多 聚碳酸脂滤膜消毒灭菌；
B.用它包装的DNA在4℃下可长期保 存不失活性，
②血清依赖性：细胞必须具有生长因 子才能生长。
③接触抑制性：细胞与细胞接触后， 生长便受到抑制。
④形态依赖性：细胞呈扁平状，并有 长纤维网状结构。
上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培 养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平 面的形式生长，即单层细胞生长。有时，正 常细胞会改变某些特征而越过生理临界点， 继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞 系形成，此时的细胞成为细胞系。
二、高等哺乳动物受体细胞的条件 1.以高效表达外源基因的高等哺乳 动物受体细胞应具备下列条件：
①细胞系特征：丧失细胞接触抑制 性和锚地依赖性特征，便于大规 模培养。
②遗传稳定性：外源基因多次传代 后不至于丢失，易于长期保存。
③合适的标记：便于转化株的筛选 和保持。
④生长快且齐：分裂周期短，生长 均一，便于控制。
缺点：转基因进入细胞后往往多拷贝 随机整合在染色体上，导致受体细 胞基因灭活或转基因不表达。
1.磷酸钙共沉淀法 ①基本步骤
A.细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA 的能力。
B.将待转移的DNA加入氯化钙和磷酸盐， 生成DNA-磷酸钙沉淀，加入培养液中。
C.由于细胞的吞噬作用，DNA-磷酸钙沉 淀物进入细胞，DNA释出后先进入细 胞质、再进入细胞核，整合到受体细 胞的染色体上。
第十六章 哺乳动物基因工程
第一节 高等哺乳动物基因工程的基本概念
一．概念： 动物基因工程是利用DNA重组技术 对动物所进行的工程操作。
二．分为：
1.遗传学动物基因工程：外源基因能 够通过配子进行垂直传递并稳定的 遗传。
2.非遗传性动物基因工程：转基因仅 在当代表现，不能够遗传给子代。
高等哺乳动物的基因工程
高等哺乳动物转基因技术
高等哺乳动物细胞基因表达技术
转基因动物个体
动物工程细胞
哺乳动物遗传性状改良 药物筛选研究评价模型
人体基因治疗
蛋白质多肽物质大规模生产 药物筛选研究评价模型
第二节 转基因的动物受体细胞 一、高等哺乳动物细胞的生长特性
1.正常的哺乳类动物细胞具有下 列四大生物学特征：
①锚地依赖性：细胞必须附在固体 上或固定的表面才能生长分裂。
二、动物病毒转染法
通过病毒感染的方式将外源基因 导入动物细胞内的转基因方法。 具有定向性好，实验重复性佳， 导入效率高等优点。缺点是载体 宿主范围有限。
4.DNA显微注射法 应用玻璃显微注射器，可以把重组 DNA直接注射到哺乳动物细胞的细胞 质或细胞核。
①真正的显微注射(true microinjection) 法，DNA是由注射针直接注入细胞。
②“穿刺”(pricking)导入法，DNA是 处在细胞周围培养基中，它通过穿 刺形成的小孔进入细胞的内部，或 是随穿刺的针头一道进入的。
②影响磷酸钙转染效率的因素：
A.DNA-磷酸钙共沉淀物中DNA的数量； B.共沉淀物与细胞接触的保温时间； C.甘油或DMSO等促进因子作用的持续
时间等。
磷酸钙转染的最适条件筛选
培养皿号 (10 cm)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pXGH5(ug)
pUC13(ug)
细胞与沉淀 物的保温时
影响因素： 脉冲的最大电压
脉冲持续的时间 与DNA浓度则无多大关系。
3.脂质体包埋法
脂质体(liposomes)是一种人造的脂 质小泡(lipid vesicles)，外周是脂 双层，内部是水腔。用它作载体可以 把外源DNA导入培养的哺乳动物细胞。
①脂质体的制备的两种方法：
A.将适宜的脂质悬浮在液体介质中， 然后迅速地振荡，使之形成大小相 当一致的脂质体；