UGRP1蛋白的表达_纯化_抗体制备及亚细胞定位

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生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位

㊀Ｇｕｉｈａｉａ㊀Ａｕｇ.２０２１ꎬ４１(８):１２１９－１２２５ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍＤＯＩ:１０.１１９３１/ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１９１２０２０武丽霞ꎬ韩丽ꎬ赵宜婷ꎬ等.生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位[Ｊ].广西植物ꎬ２０２１ꎬ４１(８):１２１９－１２２５.ＷＵＬＸꎬＨＡＮＬꎬＺＨＡＯＹＴꎬｅｔａｌ.ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎＰＩＮ１ｉｎｃｒｏｐｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏ[Ｊ].Ｇｕｉｈａｉａꎬ２０２１ꎬ４１(８):１２１９－１２２５.生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位武丽霞１ꎬ２ꎬ３ꎬ韩㊀丽１ꎬ２ꎬ３ꎬ赵宜婷１ꎬ２ꎬ３ꎬ周㊀璇１ꎬ２ꎬ３ꎬ杜云龙１ꎬ２ꎬ３∗(１.云南农业大学植物保护学院ꎬ昆明６５０２０１ꎻ２.云南生物资源保护与利用国家重点实验室ꎬ云南农业大学昆明６５０２０１ꎻ３.云南农业大学农业生物多样性与病害控制教育部重点实验室ꎬ昆明６５０２０１)摘㊀要:生长素输出载体在植物发育中起非常重要的作用ꎮ然而ꎬ生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在农作物水稻㊁小麦㊁玉米和大豆的根和胚中的亚细胞定位尚不清楚ꎮ该研究首先分析了ＯｓＰＩＮ１ｂ和它的同源物的氨基酸序列特征ꎬ发现小麦(ＴａＰＩＮ１)㊁玉米(ＺｍＰＩＮ１ｂ)和大豆(ＧｍＰＩＮ１ｂ)中的ＰＩＮ１序列与水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ序列分别具有６１.５％㊁６２.５％㊁６１.９％的相似性ꎮ然后根据水稻日本晴 ( Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ )的ＯｓＰＩＮ１ｂ的氨基酸序列ꎬ人工合成ＯｓＰＩＮ１ｂ多肽并注射健康的新西兰白兔获得了抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ在通过免疫印迹方法检测抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体的有效性后ꎬ发现可以利用该抗体有效检测到水稻叶片及根中ＯｓＰＩＮ１ｂ的表达ꎮ为检测ＯｓＰＩＮ１及其同源物在不同作物胚根和胚中子叶细胞的定位ꎬ利用制备的抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体并通过免疫组化实验ꎬ发现水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ㊁小麦的ＴａＰＩＮ１和玉米的ＺｍＰＩＮ１ｂ非极性定位在早期的胚根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上ꎬ大豆中的ＧｍＰＩＮ１ｂ非极性定位在胚根表皮细胞的质膜上ꎬ而在胚的子叶细胞中是胞质定位ꎮ为进一步检测水稻中ＯｓＰＩＮ１ｂ的亚细胞定位ꎬ对水稻根分生区表皮细胞用蛋白质转运抑制剂ＢＦＡ(ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ)及抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体处理后ꎬ进行免疫组化实验ꎬ结果发现水稻中的ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过胞吞转运途径从水稻根表皮细胞膜进入细胞质中ꎮ该研究利用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体有效检测了ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物在水稻㊁小麦㊁玉米和大豆的胚根表皮细胞及胚中子叶表皮细胞的亚细胞定位ꎬ这将有助于进一步揭示生长素输出载体ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物通过调控生长素极性运输而参与作物发育的作用机制ꎮ关键词:生长素输出载体ꎬＰＩＮ１ꎬ水稻ꎬ小麦ꎬ玉米ꎬ大豆中图分类号:Ｑ９４３㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀文章编号:１０００￣３１４２(２０２１)０８￣１２１９￣０７ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎＰＩＮ１ｉｎｃｒｏｐｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏＷＵＬｉｘｉａ１ꎬ２ꎬ３ꎬＨＡＮＬｉ１ꎬ２ꎬ３ꎬＺＨＡＯＹｉｔｉｎｇ１ꎬ２ꎬ３ꎬＺＨＯＵＸｕａｎ１ꎬ２ꎬ３ꎬＤＵＹｕｎｌｏｎｇ１ꎬ２ꎬ３∗收稿日期:２０２０－０２－０５基金项目:国家自然科学基金(３１４６０４５３ꎬ３１６６０５０１ꎬ３１８６００６４)ꎻ云南省教育厅重大科研专项计划(ＺＤ２０１５００５)ꎻ教育部留学回国人员科研启动基金([２０１３]１７９２)ꎻ云南省应用基础研究计划的重点项目(２０１７ＦＡ０１８)[ＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(３１４６０４５３ꎬ３１６６０５０１ꎬ３１８６００６４)ꎻＭａｊｏｒＳｐｅｃｉａｌＰｒｏｇｒａｍｆｏｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈꎬＥｄｕｃａｔｉｏｎＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(ＺＤ２０１５００５)ꎻＰｒｏｊｅｃｔｏｆＳＲＦｆｏｒＲＯＣＳꎬＳＥＭ([２０１３]１７９２)ꎻＫｅｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＡｐｐｌｉｅｄＢａｓｉｃＲｅｓｅａｒｃｈＰｌａｎｏｆＹｕｎｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ(２０１７ＦＡ０１８)]ꎮ作者简介:武丽霞(１９９４－)ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为水稻根系发育ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)２４１６２０６２４８＠ｑｑ.ｃｏｍꎮ∗通信作者:杜云龙ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士研究生导师ꎬ研究方向为激素与根系发育ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｕｎｌｏｎｇｄｕ＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍꎮ(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＢｉｏ￣ＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｏ￣ＢｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＣｈｉｎａꎬＹｕｎｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＫｕｎｍｉｎｇ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒｐｌａｙｓａｎｅｘｔｒｅｍｅｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.ＨｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＰＩＮ１ｉｎｔｈｅｒｏｏｔｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｓｏｆｃｒｏｐｓｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｒｅｍａｉｎｓｕｎｃｌｅａｒ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄꎬａｎｄｉｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰＩＮ１ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｗｈｅａｔ(ＴａＰＩＮ１)ꎬｍａｉｚｅ(ＺｍＰＩＮ１ｂ)ａｎｄｓｏｙｂｅａｎ(ＧｍＰＩＮ１ｂ)ｓｈａｒｅｄ６１.５％ꎬ６２.５％ａｎｄ６１.９％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓｗｉｔｈｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＮｅｘｔꎬａｎａｒｔｉｆｉｃｉａｌＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅＯｓＰＩＮ１ｂａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｒｉｃｅＮｉｐｐｏｎｂａｒｅａｎｄｉｎｊｅｃｔｅｄｉｔｉｎｔｏｈｅａｌｔｈｙＮｅｗＺｅａｌａｎｄｗｈｉｔｅｒａｂｂｉｔｓｔｏｏｂｔａｉｎａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ.ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｔｈｅｐｒｅｐａｒｅｄｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＯｓＰＩＮ１ｂｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｅｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｒｉｃｅｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓ.ＦｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｉｎｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｃｅｌｌｓｏｆｅｍｂｒｙｏｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｒｏｐｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｓａｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂꎬｗｈｅａｔＴａＰＩＮ１ａｎｄｍａｉｚｅＺｍＰＩＮ１ｂａｐｏｌａｒｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｉｎｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔａｎｄｍａｉｚｅｇｒｏｗｎｉｎｅａｒｌｙｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓꎬａｎｄｓｏｙｂｅａｎＧｍＰＩＮ１ｂａｐｏｌａｒｌｙｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓꎬｂｕｔｗａｓｃｙｔｏｓｏｌｉｃｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｃｏｔｙｌｅｄｏｎｃｅｌｌｓｏｆｅｍｂｒｙｏ.ＴｏｆｕｒｔｈｅｒｄｅｔｅｃｔｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂꎬｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｒｉｃｅｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｍｅｒｉｓｔｅｍｒｅｇｉｏｎｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓＢＦＡ(ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ)ａｎｄａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｓａｙ.ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＯｓＰＩＮ１ｂｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅｏｆｒｉｃｅｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｅｎｔｅｒｉｎｔｏｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｖｉａｅｎｄｏｃｙｔｉｃｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｍａｎｎｅｒ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｉｎｔｈｅｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓｏｆｐｒｉｍａｒｙｒｏｏｔｓａｎｄｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓｏｆｅｍｂｒｙｏｓｏｆｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅａｎｄｓｏｙｂｅａｎｗｅｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙꎬａｎｄｉｔｗｉｌｌｆａｃｉｌｉｔａｔｅｕｓｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＯｓＰＩＮ１ｂａｎｄｉｔｓｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐｏｌａｒａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｔｏｉｎｖｏｌｖｅｉｎｃｒｏｐｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒꎬＰＩＮ１ꎬｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅꎬｓｏｙｂｅａｎ㊀㊀生长素输出载体蛋白在调节植物生长素极性运输中起重要作用ꎮ生长素极性运输参与胚胎形态发生(Ｂｌｉｌｏｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)和侧生器官的形成(Ｃａｓｉｍｉｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００１)ꎮ拟南芥基因组中的ＰＩＮ基因家族编码ＰＩＮ１－８的８种生长素输出载体蛋白(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３ꎻＢｅｎｊａｍｉｎｓ＆Ｓｃｈｅｒｅｓꎬ２００８)ꎮＰＩＮ蛋白可以通过内吞作用转运到细胞质中ꎬ并形成循环小泡返回质膜(Ｇｅｌｄｎｅｒｅｔａｌ.ꎬ２００１)ꎮＡｔｐｉｎ１突变体植株表现出针状花序并且花和维管组织发育表现明显缺陷(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８)ꎮＡｔＰＩＮ１的极性定位还影响胚胎的发育(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎮＡｔＰＩＮ１分布于维管组织(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８)㊁木质部薄壁组织(Ｇäｌｗｅｉｌｅｒｅｔａｌ.ꎬ１９９８ꎻＰａｌｍｅ＆Ｇäｌｗｅｉｌｅｒꎬ１９９９)㊁根表皮和皮层细胞(Ｂｌｉｌｏｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)㊁分生组织表皮和原基表皮(Ｇｕｅｎｏｔｅｔａｌ.ꎬ２０１２)的细胞质中ꎮ但是ꎬ目前人们对单子叶植物和双子叶植物之间ＰＩＮ１蛋白的亚细胞定位差异仍不清楚ꎮＡｔＰＩＮ１的同源基因可以存在于水稻(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻＬｉｅｔａｌ.ꎬ２０１９)㊁小麦(Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ.ꎬ２０１８)㊁玉米(Ｇａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８)和大豆(Ｗａｎｇｅｔａｌ.ꎬ２０１５)的基因组中ꎮ在水稻的维管组织和根原基中可以检测到ＯｓＰＩＮ１的表达(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５)ꎬＯｓＰＩＮ１以生长素依赖性的方式参与水稻根㊁茎㊁花序和分蘖的发育(Ｘｕｅｔａｌ.ꎬ２００５ꎻＬｉｅｔａｌ.ꎬ２０１９)ꎮＺｍＰＩＮ１ａ主要定位在玉米幼苗的上叶原基(Ｇａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８)㊁根中的中柱鞘细胞和内皮层细胞(Ｃａｒｒａｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００６)㊁胚芽鞘(Ｋａｍａｄａｅｔａｌ.ꎬ２０１８)和叶片(Ｍｏｏｎｅｔａｌ.ꎬ２０１３)的表层细胞ꎮ此外ꎬＺｍＰＩＮ１ａ在根冠细胞中显示为胞质定位０２２１广㊀西㊀植㊀物４１卷(Ｆｏｒｅｓｔａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ在花序初生原基细胞中显示为非极性定位(Ｓｋｉｒｐａｎｅｔａｌ.ꎬ２００９)ꎮ但是ꎬ目前尚不清楚ＰＩＮ１在不同作物的根和胚中的亚细胞定位ꎬ包括水稻㊁小麦㊁玉米和大豆ꎮ在这项研究中ꎬ我们基于水稻日本晴 ( Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ )的ＯｓＰＩＮ１ｂ氨基酸序列ꎬ制备了抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ利用该抗体开展的免疫组化实验发现水稻的ＯｓＰＩＮ１ｂ及小麦和玉米中的同源蛋白可以非极性定位在根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上ꎬ而大豆的ＧｍＰＩＮ１ｂ可以非极性地定位在根中表皮细胞的质膜上ꎬ但是ꎬ在胚的子叶表皮细胞中是细胞质定位ꎮ此外ꎬ水稻根表皮细胞质膜上的ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过内吞运输途径进入到细胞质中ꎮ这些ＰＩＮ１定位结果将有助于我们研究生长素极性运输在水稻㊁小麦㊁玉米和大豆作物发育中的作用ꎮ１㊀材料与方法１.１植物材料植物材料为水稻品种Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ和丽江新团黑谷 ( ＬＴＨ )(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａｓｕｂｓｐ.ｊａｐｏｎｉｃａ)㊁小麦(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＣｈｕａｎｍａｉ１０７ )㊁玉米(ＺｅａｍａｙｓＢ７３ )和大豆(ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＷｉｌｌｉａｍｓ )ꎬ各作物种子置于２８ħ条件下水培萌发ꎬ使用生长了７ｄ的胚根分生区细胞和１ｄ的子叶胚来检测ＯｓＰＩＮ１ｂ及同源物的亚细胞定位ꎮ１.２抗体的制备和检测根据水稻Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ的生长素输出载体ＯｓＰＩＮ１ｂ(Ｏｓ０２ｇ０７４３４００)的氨基酸序列人工合成多肽ＱＳＳＲＮＰＴＰＲＧＳＳＦＮＣꎬ并将其注入新西兰兔体内ꎮ通过ＥＬＩＳＡ方法检测到纯化的抗兔ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎬ其浓度为０.５１ｍｇｍＬ￣１(１ʒ２００００)(杭州华安生物技术有限公司)ꎮ１.３免疫杂交和免疫组化检测为检测ＯｓＰＩＮ１ｂ的表达ꎬ提取了水稻叶片和根的总蛋白ꎬ并用一抗[抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体(１ʒ２００)]和二抗[山羊抗兔的ＩｇＧ￣ＨＲＰ(１ʒ５０００)]进行了免疫杂交ꎮ为了检测蛋白亚细胞定位ꎬ使用或不使用５０ｍｍｏｌＬ￣１ＢｒｅｆｅｌｄｉｎＡ(ＢＦＡ)(ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ)对不同农作物的根和胚处理９０ｍｉｎꎬ然后使用改良的免疫组织化学分析方法进行检测(Ｐａｃｉｏｒｅｋｅｔａｌ.ꎬ２００６)ꎮ具体如下:首先ꎬ将样品在２５ħ室温条件下用４％戊二醛溶液固定１ｈꎻ然后ꎬ３７ħ条件下用２％崩溃酶处理１ｈꎻ最后ꎬ用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体(１ʒ２００)和二抗[驴抗兔的ＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)￣Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８抗体(１ʒ５００)](ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)进行免疫组化检测ꎮ使用ＬｅｉｃａＳＰ５激光共聚焦显微镜(ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ)观察ＯｓＰＩＮ１ｂ的定位ꎮ１.４生物信息学分析从ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)获得ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源蛋白的氨基酸序列ꎬ通过在线网站(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｕｎｉｐｒｏｔ.ｏｒｇ/)分析ＯｓＰＩＮ１ｂ的跨膜结构域ꎬ使用软件ＶｅｃｔｏｒＮＴＩＳｕｉｔｅ６进行氨基酸序列比对ꎬ所有图片均使用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ软件处理ꎮ２㊀结果与分析２.１不同作物的ＰＩＮ１序列相似性分析为了检测不同作物中生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１的亚细胞定位ꎬ首先ꎬ我们对拟南芥(ＡｔＰＩＮ１)㊁水稻(ＯｓＰＩＮ１ｂ)㊁小麦(ＴａＰＩＮ１)㊁玉米(ＺｍＰＩＮ１ｂ)和大豆(ＧｍＰＩＮ１ｂ)中ＰＩＮ１的氨基酸序列进行比对分析(图１)ꎮ结果表明:ＡｔＰＩＮ１㊁ＴａＰＩＮ１㊁ＺｍＰＩＮ１ｂ㊁ＧｍＰＩＮ１ｂ的序列与ＯｓＰＩＮ１ｂ分别具有５８.６％㊁６１.５％㊁６２.５％㊁６１.９％的相似性ꎬ在ＯｓＰＩＮ１ｂ的氨基酸序列中存在１０个跨膜区ꎮ２.２水稻中ＯｓＰＩＮ１ｂ的检测ＰＩＮ１序列在水稻㊁小麦㊁玉米和大豆之间显示出高度相似性(图１)ꎮ我们选择ＯｓＰＩＮ１ｂ中的序列ＱＳＳＲＮＰＴＰＲＧＳＳＦＮＣꎬ通过人工合成多肽免疫兔子制备了抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体ꎮ为检测抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体的有效性ꎬ我们提取了水稻叶片和根的总蛋白ꎬ并使用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体进行免疫杂交检测ꎮ结果表明ꎬ用ＯｓＰＩＮ１ｂ抗体可以检测到目标蛋白ＯｓＰＩＮ１ｂ(图２)ꎮ２.３ＰＩＮ１在不同农作物中的亚细胞定位通过免疫组织化学分析进一步检测了水稻㊁小麦㊁玉米和大豆根中ＰＩＮ１的亚细胞定位ꎬ发现１２２１８期武丽霞等:生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位水稻ꎬ小麦ꎬ玉米ꎬ大豆和拟南芥之间的ＰＩＮ１氨基酸序列比对ꎬ红框中的氨基酸序列为水稻ＯｓＰＩＮ１ｂ的跨膜结构域ꎮＰＩＮ１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｅａｌｉｇｎｅｄａｍｏｎｇｒｉｃｅꎬｗｈｅａｔꎬｍａｉｚｅꎬｓｏｙｂｅａｎａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬａｎｄｒｅｄｂｏｘｅｓｓｈｏｗｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎｓｏｆｒｉｃｅＯｓＰＩＮ１ｂａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｃｅｓ.图１㊀ＰＩＮ１的氨基酸序列比对Ｆｉｇ.１㊀ＰＩＮ１ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔＰＩＮ１虽然可定位于根表皮细胞的细胞质膜上ꎬ但没有明显的极性分布(图３:Ａ－Ｄ)ꎮ在检测ＰＩＮ１在胚细胞中的定位时ꎬ发现ＰＩＮ１虽然可分布在水稻(图３:Ｅ)㊁小麦(图３:Ｆ)和玉米(图３:Ｇ)胚中子叶表皮细胞的细胞质膜上ꎬ但没有明显的极性分布ꎮ大豆中的ＧｍＰＩＮ１ｂ非极性分布在根表皮细２２２１广㊀西㊀植㊀物４１卷提取水稻日本晴叶片(Ａ)和根(Ｂ)中的总蛋白ꎬ用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体进行免疫杂交ꎮ箭头指示目标蛋白ＯｓＰＩＮ１ｂ的条带ꎮＴｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｒｉｃｅｌｅａｖｅｓ(Ａ)ａｎｄｒｏｏｔｓ(Ｂ)ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｒｉｃｅＮｉｐｐｏｎｂａｒｅａｎｄｂｌｏｔｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ.ＡｒｒｏｗｐｏｉｎｔｓｔｏｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎＯｓＰＩＮ１ｂ.图２㊀蛋白免疫杂交检测水稻叶片和根中的ＯｓＰＩＮ１ｂＦｉｇ.２㊀ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂｉｎｒｉｃｅｌｅａｖｅｓａｎｄｒｏｏｔｓｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｍｅｔｈｏｄ胞的细胞质膜上ꎬ而在胚的子叶表皮细胞中则分布于细胞质中(图３:Ｈ)ꎮ２.４水稻中ＯｓＰＩＮ１ｂ的胞吞检测由于ＯｓＰＩＮ１ｂ蛋白定位于细胞质膜上(图３:ＡꎬＥ)ꎬ因此ꎬ我们进一步检测了ＯｓＰＩＮ１ｂ是否可以通过胞吞的方式从细胞质膜转运入细胞质ꎮ用蛋白转运抑制剂ＢＦＡ处理水稻Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ和ＬＴＨ的根尖ꎬ用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体开展免疫组织化学实验ꎬ结果发现在细胞质中可以检测到ＯｓＰＩＮ１ｂ蛋白的聚集(图４)ꎮ这表明ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过胞吞途径从细胞质膜转移到细胞质中ꎮ３㊀讨论与结论生长素输出载体蛋白ＰＩＮ家族在植物发育中起着至关重要的作用ꎮ在这项研究中ꎬ我们利用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体有效检测了水稻㊁小麦㊁玉米和大豆的胚根分生区表皮细胞及胚中子叶表皮细胞的ＯｓＰＩＮ１及其同源物的亚细胞定位ꎬ结果发现ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物分布在水稻㊁小麦㊁玉米和大豆的根和胚中子叶表皮细胞的细胞质膜及细胞质中ꎮ不同作物中的相同细胞定位表明ＰＩＮ１在不同植物发育中ꎬ其调节生长素分布功能是保守的ꎮ此外ꎬ我们也注意到与拟南芥ＡｔＰＩＮ１的极性定位相比(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎬ在不同农作物的根表皮细胞中ꎬＯｓＰＩＮ１及其同源物的定位是非极性的ꎮＯｓＰＩＮ１ｂ的氨基酸序列与ＡｔＰＩＮ１具有５８.６％的相似性ꎬ因此ꎬ不同作物和拟南芥ＡｔＰＩＮ１蛋白的亚细胞定位模式存在的差异可能与不同植物中ＰＩＮ１蛋白结构差异有关ꎮ玉米中的ＺｍＰＩＮ１ａ在不同玉米组织中的定位存在极性定位(Ｃａｒｒａｒｏｅｔａｌ.ꎬ２００６ꎻＧａｌｌａｖｏｔｔｉｅｔａｌ.ꎬ２００８ꎻＭｏｏｎｅｔａｌ.ꎬ２０１３ꎻＫａｍａｄａｅｔａｌ.ꎬ２０１８)㊁非极性定位(Ｓｋｉｒｐａｎｅｔａｌ.ꎬ２００９)和胞质定位(Ｆｏｒｅｓｔａｎｅｔａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ一些研究也发现ＡｔＰＩＮ１的极性分布与胚发育中的生长素动态相关(Ｆｒｉｍｌｅｔａｌ.ꎬ２００３)ꎮ在本研究中ꎬ用于ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物细胞定位观察的胚根及子叶胚都处于植物发育的早期阶段ꎬ这表明不同作物中ＰＩＮ１的定位还与作物组织发育阶段有关ꎮ此外ꎬ利用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体可以检测到ＯｓＰＩＮ１ｂ蛋白ꎮ进一步分析结果发现ＯｓＰＩＮ１ｂ与ＯｓＰＩＮ１ａ氨基酸序列相似性为６２.４％ꎬＯｓＰＩＮ１ａ㊁ＯｓＰＩＮ１ｂ蛋白分子量分别为６４.７㊁５９.３ｋＤꎬ且ＯｓＰＩＮ１ａ氨基酸序列中含有用于制备抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体的序列ＱＳＳＲＮＰＴＰＲＧＳＳＦＮＣꎮ因此ꎬ不能完全排除所检测到的蛋白条带中含有ＯｓＰＩＮ１ａꎬ而这也可能部分解释了我们在根表皮细胞中所观察到的ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物的非极性定位ꎮＰＩＮ蛋白由于胞吞作用而产生的细胞定位的改变可影响生长素的极性运输ꎬ从而进一步调控器官形成(Ｋｌｅｉｎｅ￣Ｖｅｈｎｅｔａｌ.ꎬ２００８)ꎮ本研究结果发现ＯｓＰＩＮ１ｂ可以通过胞吞途径进入到细胞质中ꎮ这显示由于细胞的胞吞作用ꎬＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物的细胞质膜及细胞质定位可能会发生变化ꎬ并参与调控植物内生长素的分布ꎮＰＩＮ蛋白的细胞定位可受到其他物质如水杨酸的调控(Ｄｕｅｔａｌ.ꎬ２０１３)ꎮ但是ꎬ我们观察到ＯｓＰＩＮ１ｂ的定位可由自身胞吞作用而改变ꎬ因此ꎬ不同作物中ＰＩＮ１蛋３２２１８期武丽霞等:生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位水稻日本晴 (ＡꎬＥ)ꎬ小麦(ＢꎬＦ)ꎬ玉米(ＣꎬＧ)和大豆(ＤꎬＨ)的根(Ａ－Ｄ)和胚(Ｅ－Ｈ)用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体开展免疫组化实验ꎮ标尺＝１０μｍꎮＲｏｏｔｓ(Ａ－Ｄ)ａｎｄｅｍｂｒｙｏｓ(Ｅ－Ｈ)ｏｆｒｉｃｅＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ (ＡꎬＥ)ꎬｗｈｅａｔ(ＢꎬＦ)ꎬｍａｉｚｅ(ＣꎬＧ)ａｎｄｓｏｙｂｅａｎ(ＤꎬＨ)ｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｓａｙｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ.Ｂａｒｓ＝１０μｍ.图３㊀ＰＩＮ１在根和胚的子叶表皮细胞中的亚细胞定位Ｆｉｇ.３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＰＩＮ１ｉｎｒｏｏｔａｎｄｅｍｂｒｙｏｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓ用２５μｍｏｌＬ￣１ＢＦＡ处理水稻品种丽江新团黑谷 (Ａ)和日本晴 (Ｂ)的根尖９０ｍｉｎꎬ然后用抗兔的ＯｓＰＩＮ１ｂ多克隆抗体通过免疫组化检测ＯｓＰＩＮ１ｂ的胞吞ꎮ箭头指示根表皮细胞胞质中ＯｓＰＩＮ１ｂ蛋白聚集体ꎮ标尺＝１０μｍꎮＲｏｏｔｓｏｆｒｉｃｅｌｉｎｅｓＬＴＨ (Ａ)ａｎｄＮｉｐｐｏｎｂａｒｅ (Ｂ)ｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２５μｍｏｌＬ￣１ＢＦＡｆｏｒ９０ｍｉｎꎬａｎｄｂｌｏｔｔｅｄｗｉｔｈａｎｔｉ￣ｒａｂｂｉｔＯｓＰＩＮ１ｂｐｏｌｙｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｓｓａｙ.ＡｒｒｏｗｐｏｉｎｔｓｔｏｔｈｅＯｓＰＩＮ１ｂｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｃｙｔｏｐｌａｓｍａｏｆｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓ.Ｂａｒｓ＝１０μｍ.图４㊀水稻根表皮细胞中ＯｓＰＩＮ１ｂ的胞吞检测Ｆｉｇ.４㊀ＥｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＯｓＰＩＮ１ｂｉｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍａｏｆｒｉｃｅｒｏｏｔｅｐｉｄｅｒｍａｌｃｅｌｌｓ４２２１广㊀西㊀植㊀物４１卷白的亚细胞定位是一个动态的过程ꎮ不同作物中ＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物可非极性定位于细胞质膜及细胞质中ꎬ这是一个动态的分布过程ꎬ并与植物所处的发育阶段密切相关ꎮＯｓＰＩＮ１ｂ及其同源物的亚细胞定位将有助于揭示生长素输出载体通过影响生长素极性分布而参与调控农作物中根和胚发育的分子机制ꎮ登录号㊀文章中相关蛋白在ＮＣＢＩ数据库中的登录号分别为ＡｔＰＩＮ１(ＮＰ＿１７７５００.１)㊁ＯｓＰＩＮ１ｂ(ＸＰ＿０１５６１６０１４.１)㊁ＴａＰＩＮ１(ＡＡＳ１９８５８.１)㊁ＺｍＰＩＮ１ｂ(ＡＢＨ０９２４３.１)㊁ＧｍＰＩＮ１ｂ(ＮＰ＿００１２３７５４６.２)ꎮ参考文献:ＢＥＮＪＡＭＩＮＳＲꎬＳＣＨＥＲＥＳＢꎬ２００８.Ａｕｘｉｎ:ｔｈｅｌｏｏｐｉｎｇｓｔａｒｉｎｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＡｎｎＲｅｖＰｌａｎｔＢｉｏｌꎬ５９(１):４４３－４６５.ＢＬＩＬＯＵＩꎬＸＵＪꎬＷＩＬＤＷＡＴＥＲＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２００５.ＴｈｅＰＩＮａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒｎｅｔｗｏｒｋｃｏｎｔｒｏｌｓｇｒｏｗｔｈａｎｄｐａｔｔｅｒｎｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｒｏｏｔｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ４３３(７０２１):３９－４４.ＣＡＲＲＡＲＯＮꎬＦＯＲＥＳＴＡＮＣꎬＣＡＮＯＶＡＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２００６.ＺｍＰＩＮ１ａａｎｄＺｍＰＩＮ１ｂｅｎｃｏｄｅｔｗｏｎｏｖｅｌｐｕｔａｔｉｖｅｃａｎｄｉｄａｔｅｓｆｏｒｐｏｌａｒａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｐｌａｎｔａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍａｉｚｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ１４２(１):２５４－２６４.ＣＡＳＩＭＩＲＯＩꎬＭＡＲＣＨＡＮＴＡꎬＢＨＡＬＥＲＡＯＲＰꎬｅｔａｌ.ꎬ２００１.ＡｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｐｒｏｍｏｔｅｓＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｌａｔｅｒａｌｒｏｏｔｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１３(４):８４３－８５２.ＤＵＹＬꎬＴＥＪＯＳＲꎬＢＥＣＫＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１３.Ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓｗｉｔｈｃｌａｔｈｒｉｎ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｅｎｄｏｃｙｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ[Ｊ].ＰＮＡＳꎬ１１０(１９):７９４６－７９５１.ＦＯＲＥＳＴＡＮＣꎬＦＡＲＩＮＡＴＩＳꎬＶＡＲＯＴＴＯＳꎬ２０１２.ＴｈｅｍａｉｚｅＰＩＮｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｏｆａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ[Ｊ].ＦｒｏｎｔＰｌａｎｔＳｃｉꎬ３(１６):１６.ＦＲＩＭＬＪꎬＶＩＥＴＥＮＡꎬＳＡＵＥＲＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２００３.Ｅｆｆｌｕｘ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｕｘｉｎｇｒａｄｉｅｎｔｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅａｐｉｃａｌ￣ｂａｓａｌａｘｉｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅ(Ｌｏｎｄｏｎ)ꎬ４２６(６９６３):１４７－１５３.ＧＡＬＬＡＶＯＴＴＩＡꎬＹＡＮＧＹꎬＳＣＨＭＩＤＴＲＪꎬｅｔａｌ.ꎬ２００８.Ｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｍａｉｚｅｂｒａｎｃｈｉｎｇ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ１４７(４):１９１３－１９２３.ＧÄＬＷＥＩＬＥＲＬꎬＧＵＡＮＣꎬＭＵＬＬＥＲＡꎬｅｔａｌ.ꎬ１９９８.ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｏｌａｒａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｂｙＡｔＰＩＮ１ｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｖａｓｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２８２(５３９７):２２２６－２２３０.ＧＥＬＤＮＥＲＮꎬＦＲＩＭＬＪꎬＳＴＩＥＲＨＯＦＹＤꎬｅｔａｌ.ꎬ２００１.ＡｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｂｌｏｃｋＰＩＮ１ｃｙｃｌｉｎｇａｎｄｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ４１３(６８５４):４２５－４２８.ＧＵＥＮＯＴＢꎬＢＡＹＥＲＥꎬＫＩＥＲＺＫＯＷＳＫＩＤꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１２.ＰＩＮ１￣ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｅａｆｉｎｉｔｉａｔｉｏｎｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌꎬ１５９(４):１５０１－１５１０.ＫＡＭＡＤＡＭꎬＭＩＹＡＭＯＴＯＫꎬＯＫＡＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒｃｈｅｍｉｃａｌｆｉｘａｔｉｏｎｉｎｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎａｌｙｓｅｓｏｆＰＩＮｐｒｏｔｅｉｎｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｐｏｌａｒａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔ:ｒｅｌｅｖａｎｃｅｔｏｓｐａｃｅｆｌｉｇｈｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ[Ｊ].ＬｉｆｅＳｃｉＳｐａｃｅＲｅｓ(Ａｍｓｔ)ꎬ１８:４２－５１.ＫＬＥＩＮＥ￣ＶＥＨＮＪꎬＤＨＯＮＵＫＳＨＥＰꎬＳＡＵＥＲＭꎬｅｔａｌ.ꎬ２００８.ＡＲＦＧＥＦ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓａｎｄｐｏｌａｒｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆＰＩＮａｕｘｉｎｃａｒｒｉｅｒｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＣｕｒｒＢｉｏｌꎬ１８(７):５２６－５３１.ＬＩＹꎬＺＨＵＪＳꎬＷＵＬＬꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１９.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｏｆＰＩＮ１ｐａｒａｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬ６０(１２):２７２０－２７３２.ＭＯＯＮＪꎬＣＡＮＤＥＬＡＨꎬＨＡＫＥＳꎬ２０１３.Ｔｈｅｌｉｇｕｌｅｌｅｓｓｎａｒｒｏｗｍｕｔａｔｉｏｎａｆｆｅｃｔｓｐｒｏｘｉｍａｌ￣ｄｉｓｔａｌｓｉｇｎａｌｉｎｇａｎｄｌｅａｆｇｒｏｗｔｈ[Ｊ].Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ１４０(２):４０５－４１２.ＰＡＣＩＯＲＥＫＴꎬＳＡＵＥＲＭꎬＢＡＬＬＡＪꎬｅｔａｌ.ꎬ２００６.Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｉｎｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓꎬ１(１):１０４－１０７.ＰＡＬＭＥＫꎬＧÄＬＷＥＩＬＥＲＬꎬ１９９９.ＰＩＮ￣ｐｏｉｎｔｉｎｇｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔ[Ｊ].ＣｕｒｒＯｐｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌꎬ２(５):３７５－３８１.ＳＫＩＲＰＡＮＡꎬＣＵＬＬＥＲＡＨꎬＧＡＬＬＡＶＯＴＴＩＡꎬｅｔａｌ.ꎬ２００９.ＢＡＲＲＥＮＩＮＦＬＯＲＥＳＣＥＮＣＥ２ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗｉｔｈＺｍＰＩＮ１ａｓｕｇｇｅｓｔｓａｒｏｌｅｉｎａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｄｕｒｉｎｇｍａｉｚｅｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬ５０(３):６５２－６５７.ＳＩＮＧＨＫꎬＳＩＮＧＨＪꎬＪＩＮＤＡＬＳꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１８.ＳｔｒｕｃｔｕｒａｌａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｎａｕｘｉｎｅｆｆｌｕｘｃａｒｒｉｅｒＰＩＮ１ａｎｄｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｉｎｃｏｍｍｏｎｗｈｅａｔ[Ｊ].ＦｕｎｃｔＩｎｔｅｇｒＧｅｎｏｍｉｃꎬ１９(１):２９－４１.ＷＡＮＧＹＱꎬＣＨＡＩＣＬꎬＶＡＬＬＩＹＯＤＡＮＢꎬｅｔａｌ.ꎬ２０１５.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｔｈｅＰＩＮａｕｘｉｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｓｏｙｂｅａｎ(Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ) [Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ１６(１):９５１－９６３.ＸＵＭꎬＺＨＵＬꎬＳＨＯＵＨＸꎬｅｔａｌ.ꎬ２００５.ＡＰＩＮ１ｆａｍｉｌｙｇｅｎｅꎬＯｓＰＩＮ１ꎬｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎａｕｘｉｎ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓｒｏｏｔｅｍｅｒｇｅｎｃｅａｎｄｔｉｌｌｅｒｉｎｇｉｎｒｉｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌꎬ４６(１０):１６７４－１６８１.(责任编辑㊀周翠鸣)５２２１８期武丽霞等:生长素输出载体蛋白ＰＩＮ１在作物根和胚中的亚细胞定位。

猪塞内卡谷病毒VP1蛋白原核表达及多克隆抗体制备

·2175·猪塞内卡谷病毒VP1蛋白原核表达及多克隆抗体制备莫红芳1，2，3，石宗承1，陆晶山4，5，何东贤1，2，3，杨延辉2，6，梁淑芳4，5，俸祥仁1，钱平2*，韦巧燕4，5*（1广西农业职业技术大学动物科技学院，广西南宁530007；2华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉430070；3广西大学动物科学技术学院，广西南宁530004；4广西壮族自治区柳州种畜场，广西柳州545003；5武宣县金兴生猪养殖专业合作社，广西来宾545902；6重庆三峡职业学院动物科技学院，重庆404155）摘要：【目的】原核表达猪塞内卡谷病毒（Seneca valley virus ，SVV ）VP1蛋白，制备SVV-CH-HB2016VP1蛋白多克隆抗体并分析其抗原性，为进一步研发SVV 病毒诊断试剂盒和亚单位疫苗提供参考依据。

【方法】对SVV-CH-HB2016VP1基因序列进行密码子优化，构建质粒pUCK/VP1-opt ，双酶切后连接至pET-28a （+）载体，构建原核表达质粒pET-28a-VP1。

将重组质粒pET-28a-VP1转化大肠杆菌BL21（DE3）分子伴侣感受态细胞，经IPTG 诱导表达获得重组VP1蛋白。

采用Western blotting 方法分析VP1蛋白的反应原性，并以包涵体变性和复性方式纯化。

随后将VP1蛋白免疫新西兰白兔，分离血清获得重组VP1蛋白的多克隆抗体。

以间接酶联免疫吸附试验（ELISA ）法测定抗体的效价水平，以Protein A+G Agarose 抗体纯化试剂盒纯化多克隆抗体。

通过Western blotting 和间接免疫荧光抗体试验（IFA ）法验证多克隆抗体与SVV-CH-HB2016毒株反应的特异性。

【结果】成功构建原核表达质粒pET-28a-VP1，在IPTG 终浓度为0.1mmol/L 、37℃诱导4h 条件下，重组VP1蛋白成功表达并主要以包涵体形式存在；Western blotting 分析结果显示，重组VP1蛋白可与His-Tag Mouse mAb 发生特异性结合，具有良好的反应原性；经变性和复性纯化的重组包涵体蛋白纯度和浓度均较高；采用间接ELISA 法检测多克隆抗体的效价为1∶32000；纯化后的抗体无明显杂带，纯度大于90.0%；Western blotting 和IFA 鉴定结果表明，多克隆抗体可特异性识别SVV-CH-HB2016毒株，重组VP1蛋白具有较好的免疫原性。

水稻osgprp家族基因结构与表达分析

摘要富含甘氨酸和脯氨酸的蛋白（glycine and proline-rich protein，GPRP）基因广泛分布于植物界中，且已被证实在植物的生长发育和逆境适应过程中扮演着非常重要的角色。

然而，目前仅在少数几种植物中对其基因结构特征、表达特性和功能预测等进行了初步报道，水稻中有关这类家族基因的研究鲜有报道。

本研究克隆了3个候选的水稻OsGPRP基因，结合生物信息学分析手段，对这3个OsGPRP基因的结构特征进行了分析；基于荧光定量PCR等方法对正常和逆境下OsGPRP家族基因在水稻不同组织部位的表达模式进行了分析；利用烟草叶片瞬时表达法对预测的OsGPRP蛋白进行了初步的亚细胞定位分析。

此外，还对OsGPRP1和OsGPRP3蛋白进行了原核表达分析；利用pCXUN质粒构建了OsGPRP1和OsGPRP2基因的过量表达载体，以农杆菌介导法转化水稻，获得了转基因T2代植株。

为进一步研究水稻OsGPRP家族基因的生物学功能奠定了基础。

主要研究结果如下：1. 水稻OsGPRP家族基因结构特征分析借助生物信息学分析手段，成功筛选并克隆了3个水稻OsGPRP家族基因；3个水稻OsGPRP基因含有2-3个外显子和1-2个内含子，编码170-197个氨基酸，蛋白大小为16.8-19.7kDa，等电点为7.53-9.82；启动子中含有多种逆境响应元件；蛋白序列结构特征分析表明，3个OsGPRP含有典型的植物GPRP蛋白保守结构域（N端XYPP重复序列、中部富含A的疏水区和C端HGK重复区），符合植物GPRP蛋白家族的结构特征。

系统进化树分析结果显示，OsGPRP1和OsGPRP3属于同一分枝，OsGPRP2属于另一分枝。

2. 正常和逆境下OsGPRP基因在水稻不同组织部位中的表达模式荧光定量PCR结果显示，正常情况下3个OsGPRP基因在水稻幼苗的根、茎、叶和抽穗期的幼穗中存在差异表达，均在叶中表达量最高；在低温、干旱和高盐逆境下，3个OsGPRP基因在水稻不同组织部位中的表达模式存在明显差异，OsGPRP2和OsGPRP3在根和茎中均显著上调表达，OsGPRP1和OsGPRP2在叶中下调表达；在干旱胁迫下，OsGPRP1基因在水稻根中显著上调表达；在盐胁迫下，OsGPRP3在叶中显著上调表达。

蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究

蛋白表达的亚细胞定位影响基因免疫诱导的体液免疫应答水平的研究杨军;陈晓黎;王一理;司履生【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2012(007)004【摘要】目的研究表达产物的不同亚细胞定位对基因免疫诱导的体液免疫应答水平的影响,为基因疫苗的设计提供参考.方法利用分子克隆技术,分别构建能表达不同细胞定位的EGFP-HPV16L1 融合蛋白和截短型 EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白的重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1 和 pcDNA-EGFPHPV16L1△NLS 真核表达载体;通过转染 CHO 细胞,并在倒置荧光显微镜下观察表达产物的细胞定位;用重组pcDNA 载体免疫 BALB/c 小鼠;EGFP 作为抗原,ELISA法检测血清抗体吸光度.结果①重组 pcDNA-EGFP-HPV16L1 转染的CHO 细胞核内可见到绿色荧光,pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表达载体转染的 CHO 细胞质内可见到绿色荧光;②两种不同的重组 pcDNA 载体均可诱导 BALB/c 小鼠体液免疫反应,但重组pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS 真核表达载体免疫组小鼠 IgG 抗体 A450 值显著高于重组pcDNAEGFP-HPV16L1 真核表达载体免疫组小鼠 IgG 抗体 A450值(P < 0.001).结论表达产物的不同细胞定位可影响基因免疫诱发的体液免疫应答水平,定位于细胞质内的蛋白分子较定位于细胞核的蛋白分子能诱导机体更强的体液免疫反应,这为以增强体液免疫反应为目的的基因疫苗的设计提供了参考.【总页数】6页(P270-275)【作者】杨军;陈晓黎;王一理;司履生【作者单位】710004,西安交通大学医学院第二附属医院病理科;710004,西安交通大学医学院第二附属医院病理科;710061,西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所,生物医学信息工程教育部重点实验室,司履生;710061,西安交通大学生命科学与技术学院癌症研究所,生物医学信息工程教育部重点实验室,司履生【正文语种】中文【相关文献】1.徐淮山羊SCD1基因的克隆和亚细胞定位研究及转基因小鼠的制备 [J], 朱才业;韦光辉;李伟;王丹;郑蒙蒙;刘志永;张亚妮;李碧春2.外源HCV核心基因表达载体在HepG2中蛋白表达的亚细胞定位 [J], 张志培;王小平;徐鉷;朱以芳;陈德凤;王文勇;黄立军;程庆书3.猪Prox1基因的染色体定位和亚细胞定位的研究 [J], 袁继红;龙欢;田明芳;杨在清4.灵芝CRZ1的亚细胞定位及其编码基因在子实体不同发育阶段的转录水平分析[J], 屠均亮;徐军伟5.PFT-α对热化疗损伤结肠上皮细胞P53蛋白表达及亚细胞定位的影响 [J], 张安平;刘宝华;张连阳;童卫东;高羽;何渝军;付涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

A型塞内卡病毒VP1蛋白的原核表达及纯化

中国畜牧兽医 2022,49(7):2708-2715C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c in e A 型塞内卡病毒V P 1蛋白的原核表达及纯化杜文琪1,夏立叶1,李桂梅1,2,3,单虎1,2,3(1.青岛农业大学动物医学院,青岛266109;2.山东省新兽药创制协同创新中心,青岛266109;3.山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心,青岛266109)摘要:ʌ目的ɔ实现A 型塞内卡病毒(S e n e c av i r u sA ,S V A )V P 1蛋白在大肠杆菌中的高效可溶性表达,以建立S V A 抗体液相芯片技术检测方法㊂ʌ方法ɔ根据G e n B a n k 收录的S V A V P 1基因序列(登录号:K Y 747514.1),基于大肠杆菌的密码子偏好性优化合成V P 1基因,克隆到p C o l dT F 载体,构建重组质粒p C o l dT F -V P 1㊂将重组质粒pC o l dT F -V P 1转化大肠杆菌B L 21(DE 3)感受态细胞,进行I P T G 诱导表达㊂通过优化诱导时间及I P T G 浓度得出最佳诱导表达条件㊂采用H i s 标签镍柱纯化V P 1重组蛋白,将纯化后的S V A V P 1蛋白与荧光微球进行偶联,偶联好的微球与阴阳性血清反应,利用L u m i n e x 200系统上机检测背景及阴阳性血清的中值荧光强度(M F I ),从而判断阴阳性,以用于猪血清中S V A 抗体的检测㊂ʌ结果ɔ重组质粒p C o l dT F -V P 1成功转入大肠杆菌B L 21感受态细胞,并以可溶性蛋白形式表达㊂经诱导表达在约82k u 处出现阳性条带㊂当重组菌株诱导条件为16ħ㊁I P T G 终浓度为1.2m m o l /L ㊁诱导时间为3h 时,V P 1蛋白表达量最高;经W e s t e r nb l o t t i n g 分析,可在82k u 处出现明显条带㊂将V P 1蛋白与荧光微球偶联,阴性对照(背景)的平均荧光值为17(<100)㊂测试孔的平均M F I 为2339.5(>2000),证明S V A V P 1蛋白与微球偶联成功,偶联成功的荧光微球可用于检测猪血清中S V A 抗体的检测㊂ʌ结论ɔ本研究在大肠杆菌中成功表达并纯化了S V AV P 1蛋白,初步建立了S V A 抗体液相芯片检测方法,为后续研究奠定了基础㊂关键词:A 型塞内卡病毒(S V A );V P 1蛋白;大肠杆菌;蛋白纯化;可溶性表达;液相芯片中图分类号:S 852.65+1文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2022.07.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-27基金项目:山东省生猪产业技术体系(S D A I T -08-07)联系方式:杜文琪,E -m a i l :976234938@q q.c o m ㊂通信作者李桂梅,E -m a i l :201201054@q a u .e d u .c n P r o k a r y o t i cE x pr e s s i o na n dP u r i f i c a t i o no f S e n e c aV i r u sAV P 1P r o t e i n D U W e n q i 1,X I A L i ye 1,L IG u i m e i 1,2,3,S H A N H u 1,2,3(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Q i n gd a o 266109,C h i n a ;2.N o ve l V e t e r i n a r y P h a r m a c y I n n o v a t i o nC e n t e r of S h a n d o ng P r o v i n c e ,Q i n gd a o 266109,C h i n a ;3.Re s e a r c hC e n t e rf o rE ng i n e e r i n g T e ch n o l o g yi nV e t e r i n a r y M e d i c i n e a n dV e t e r i n a r yD i a g n o s t i c R e a g e n t o f S h a n d o n g P r o v i n c e ,Q i n gd a o 266109,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b je c t i v e ɔT h i ss t u d y w a sa i m e dt oe x pr e s sS e n e c av i r u sA (S V A )V P 1p r o t e i ni n E s c h e r i c h i a c o l i (E .c o l i ),a n de s t a b l i s ht h ed e t e c t i o n m e t h o do fS V A a n t i b o d y b y l i q u i dc h i pt e c h n o l o g y .ʌM e t h o d ɔA c c o r d i n g t o t h eS V A V P 1g e n e s e qu e n c e (K Y 747514.1)f r o m G e n B a n k ,t h e V P 1g e n ew a s s y n t h e s i z e db a s e do n t h e c o d o n p r e f e r e n c e o f E .c o l i ,a n d c l o n e d i n t o p C o l dT F v e c t o r t o c o n s t r u c t t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l dT F -V P 1.T h e p C o l dT F -V P 1w a s t r a n s f o r m e di n t o E .c o l i B L 21(D E 3)c o m p e t e n tc e l l sa n di n d u c e db y I P T G.T h e i n d u c i n g co n d i t i o n s w e r e s t u d i e db y o p t i m i z i n g th e i n d u c t i o n t i m e a n d I P T Gc o n c e n t r a t i o n .R e c o m b i n a n tV P 1p r o t e i nw a s p u r i f i e d b y n i c k e l c o l u m n .T h e p u r i f i e d S V A V P 1p r o t e i n w a s c o u pl e d w i t h f l u o r e s c e n t m i c r o s p h e r e s ,a n d t h em i c r o s p h e r e sw e r e r e a c t e dw i t hS V An e ga t i v e a n d p o s i t i v e s e r u m.L u m i n e x7期杜文琪等:A型塞内卡病毒V P1蛋白的原核表达及纯化200s y s t e m w a s u s e d t o d e t e c t t h e b a c k g r o u n d a n d t h em e d i a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y(M F I)o f t h e n e g a t i v e a n d p o s i t i v e s e r u m.ʌR e s u l tɔT h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l dT F-V P1w a s s u c c e s s f u l l y t r a n s f o r m e d i n t o E.c o l i B L21c o m p e t e n t c e l l s a n d e x p r e s s e d a s s o l u b l e p r o t e i nw i t h t h em o l e c u l a r w e i g h t o f82k u.T h eV P1p r o t e i nw a s e x p r e s s e da t t h eh i g h e s t y i e l dw h e n i n d u c i n g a t16ħf o r 3ha n d t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o no f I P T G w a s1.2m m o l/L.T h ea v e r a g e M F Io fn e g a t i v ec o n t r o l w a s17(<100).T h e a v e r a g eM F I o f t h e t e s tm i c r o s p h e r e sw a s2339.5(>2000),i n d i c a t i n g t h a t S V A V P1p r o t e i nw a s s u c c e s s f u l l y c o u p l e dw i t h t h em i c r o s p h e r e s.T h e c o u p l e d f l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s c o u l db eu s e dt od e t e c tS V A a n t i b o d y i n p o r c i n es e r u m.ʌC o n c l u s i o nɔV P1p r o t e i no fS V A w a s s u c c e s s f u l l y e x p r e s s e d i n E.c o l i.T h e e x p r e s s i o n c o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d,t h e t a r g e t p r o t e i nw a s p u r i f i e da n d c o u l db eu s e d t od e v e l o p a l i q u i d c h i p a n a l y s i s f o r d e t e c t i o no f S V Aa n t i b o d y.K e y w o r d s:S e n e c av i r u st y p e A(S V A);V P1p r o t e i n;E s c h e r i c h i ac o l i;p r o t e i n p u r i f i c a t i o n; s o l u b l e e x p r e s s i o n;l i q u i d c h i p猪塞内卡病毒病是由A型塞内卡病毒(S e n e c a v i r u sA,S V A)引起的猪发生水疱性相关疾病的传染性疾病[1]㊂S V A可感染不同品种和年龄的猪,仔猪感染后死亡率高,成年猪感染后症状不明显,育肥猪感染后出现生产停滞,饲料转化率降低㊂S V A最早于2002年在美国首次分离到,早期研究显示该病毒对人和动物无致病性[2-3]㊂2008和2012年分别于加拿大和美国在感染了水疱病的猪中发现了S V A㊂2014和2015年,研究发现S V A感染与母猪水疱病(S V D)的暴发及巴西和美国的新生猪死亡率有关[2]㊂随后美国㊁澳大利亚㊁意大利㊁巴西㊁哥伦比亚㊁泰国等均有相关报道[4]㊂2015年,中国广东地区养猪场出现了猪塞内卡病毒病,随后湖南㊁河南㊁福建㊁黑龙江等地均有相关报道[5]㊂S V A是小核糖核酸病毒科(P i c o r n a v i r i d a e)塞内卡病毒属(S e n e c a v i r u s)中唯一一种病毒,基因组长约为7.3k b,包括1个大的开放阅读框(O R F)㊁5'-端非翻译区(5'-U T R)和多腺苷酸化的3'-端非翻译区(3'-U T R)[6]㊂S V A的衣壳蛋白主要由V P1㊁V P2㊁V P3和V P44种结构蛋白构成,其中V P1和V P2蛋白决定塞内卡病毒的细胞嗜性,V P1和V P3蛋白决定塞内卡病毒的抗原性,此外V P2和V P4蛋白参与塞内卡病毒的核酸包装㊂V P1最具抗原性,可刺激机体产生中和抗体[7],常被用作S V A诊断试剂的研制㊂S V A临床症状与猪水疱病㊁口蹄疫(F M D)等水疱性疾病难以区分,且尚无商品化疫苗,给S V A 的防控工作带来巨大挑战㊂目前,在血清学方面可用于S V A筛查的抗体检测方法主要包括酶联免疫吸附试验(e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y, E L I S A)㊁间接免疫荧光抗体试验(i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c t a n t i b o d y t e s t,I F A)和病毒中和试验(v i r u sn e u t r a l i z a t i o nt e s t,V N),但耗时久㊁需样本量大㊁花费成本高,且在单个反应中同时检测多种分析物的能力受到限制[8]㊂液相芯片也称为微球体悬浮芯片,是1995年美国L u m i n e x公司基于x MA P(f l e x i b l em u l t i a n a l y t e p r o f i l i n g)技术研发的新型生物芯片技术平台,其检测更加开放灵活,能同时检测多个样品的多个目标,可确保数小时内获得更灵敏的检测结果,且仅需极少量的样品,具有常规方法无法比拟的优势[9]㊂本研究旨在原核表达可溶性S V A的V P1蛋白,将其纯化后与荧光微球进行偶联,初步建立S V A抗体单重液相芯片检测方法,以期为后续完成其评估性试验以及实现S V A与其他相似疾病的鉴别诊断奠定基础㊂1材料与方法1.1材料1.1.1菌株与载体大肠杆菌D H5α和B L21(D E3)感受态细胞(T a K a R a公司);原核表达载体p C o l dT F质粒由青岛农业大学预防兽医学重点实验室保存㊂1.1.2主要试剂 S a n P r e p柱式质粒D N A小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司);I P T G(上海蓝季科技发展有限公司);H i s标签蛋白纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司);B r a d f o r d蛋白浓度测定试剂盒㊁增强型H R P-D A B底物显色试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司);抗H i s单克隆抗体㊁预染蛋白质分子质量标准及S D S-P A G E上样缓冲液(北京索来宝科技有限公司);辣根过氧化物酶(H R P)标记的山羊抗小鼠I g G (北京中杉金桥生物技术有限公司);磁珠检测平底9072中国畜牧兽医49卷板㊁96孔板避光封板膜㊁B i o-P l e x偶联试剂盒㊁B i o-P l e x羧基磁珠(M C10044)㊁E D C和S-N H S㊁B i o-P l e x检测反应试剂盒(伯乐生命医学产品(上海)有限公司);生物素化的抗H i s单克隆抗体(6ˑH i s T a g M o n o c l o n a lA n t i b o d y,B i o t i n)(I n v i t r o g e n公司);S V A阳性血清及阴性血清均为青岛农业大学预防兽医学重点实验室保存㊂1.2方法1.2.1重组质粒的构建及鉴定根据G e n B a n k 收录的塞内卡病毒V P1基因序列(登录号: K Y747514.1),在不影响V P1蛋白氨基酸序列的前提下,对该序列进行分析和密码子优化,同时构建p C o l dⅠ-V P1重组载体,由中美泰和生物技术有限公司合成和测序㊂用N e dⅠ和P s tⅠ对p C o l dⅠ-V P1原核表达质粒进行双酶切,37ħ水浴酶切4h,利用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行分离后回收目的基因V P1㊂利用连接酶将目的基因V P1连接于表达载体p C o l dT F中,将连接产物转化大肠杆菌D H5α感受态细胞,涂布于含氨苄青霉素的L B平板过夜培养,挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的L B液体培养基,37ħ㊁220r/m i n振荡培养12h,提取质粒㊂构建p C o l dT F-V P1原核表达质粒,将采用双酶切方法鉴定为阳性的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序㊂1.2.2 V P1重组蛋白诱导表达将阳性重组质粒转化大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞,加入L B 液体培养基,37ħ㊁220r/m i n振荡培养1h㊂离心弃部分上清液,取100μL混匀的细菌溶液涂布于含氨苄青霉素的L B平板37ħ过夜培养㊂挑取单菌落于含氨苄青霉素的L B液体培养基中,37ħ㊁220r/m i n振荡培养过夜,菌液于-80ħ保存㊂按1ʒ100比例将空载体菌液和重组蛋白菌液接种于含氨苄青霉素的L B液体培养基中,37ħ㊁220r/m i n振荡培养至D600n m值为0.6~0.8,每管加入终浓度为1m m o l/L的I P T G,16ħ㊁220r/m i n诱导表达9h㊂同时设立对照㊂诱导结束后4ħ㊁12000r/m i n 离心15m i n,分别收集菌体,加入适量P B S重悬菌体,分别取10μL与4ˑS D S-P A G E上样缓冲液混合均匀,煮沸10m i n,进行S D S-P A G E㊂1.2.3 V P1重组蛋白诱导表达条件优化将空载体菌液和V P1重组菌37ħ㊁220r/m i n振荡培养至D600n m值为0.6~0.8㊂V P1重组菌分别加入终浓度为0.4㊁0.6㊁0.8㊁1.0㊁1.2和1.5m m o l/L的I P T G,空载体菌液加入终浓度为1m m o l/L的I P T G,同时设立对照,诱导12h后,收集菌液,处理样品并进行S D S-P A G E,分析最佳I P T G诱导浓度[10-12]㊂将空载体菌液和重组蛋白菌液37ħ㊁220r/m i n 振荡培养至D600n m值为0.6~0.8㊂每管加入终浓度为1.2m m o l/L的I P T G进行诱导,同时设立对照㊂重组蛋白菌液分别于诱导后3㊁6㊁9㊁12㊁22和24h取等量的菌液,处理样品并进行S D S-P A G E,分析最佳的诱导时间[9-10]㊂1.2.4 V P1重组蛋白可溶性分析使用优化的诱导条件培养重组菌体,分别收集菌体加入适量P B S重悬后冰浴超声破碎㊂超声结束后,4ħ㊁12000r/m i n离心15m i n,分别收集上清液和菌体沉淀进行S D S-P A G E[11-12]㊂1.2.5 V P1重组蛋白纯化及S D S-P A G E鉴定在优化的诱导条件下大量扩增重组菌液,如1.2.4所述制备菌液上清㊂用B r a d f o r d法测定蛋白浓度[11]㊂参照H i s标签蛋白纯化试剂盒说明书纯化V P1重组蛋白,收集洗脱峰并进行S D S-P A G E鉴定分析㊂1.2.6 V P1重组蛋白W e s t e r nb l o t t i n g分析将纯化的V P1重组蛋白转移至P V D F膜上5%脱脂奶粉4ħ封闭过夜㊂以抗H i s单克隆抗体作为一抗室温孵育2h,以山羊抗小鼠I g G作为二抗室温室温孵育2h㊂用H R P-D A B显色试剂盒进行显色,用凝胶扫描成像系统进行检测[11-12]㊂1.2.7微球活化和蛋白偶联参照B i o-P l e x胺偶联试剂盒说明书进行两步酰胺反应㊂取100μL 微球(1.25ˑ106珠)转移到偶联反应管中,注意避光㊂旋涡混匀后瞬时离心,于磁力架上沉降1m i n 并弃掉上清,加入100μL清洗缓冲液清洗微球,于磁力架上沉降1m i n并弃掉上清,将微球重新悬浮在80μL微球活化缓冲液中,加入10μL50m g/m L E D C,随后立即加入10μL50m g/m LS-N H S漩涡混匀㊂用铝箔覆盖偶联反应管,在室温下振荡孵育20m i n㊂用P B S清洗并重悬微球㊂加入适量S V A V P1蛋白,用P B S定容至500μL,漩涡混匀后,于4ħ避光过夜偶联㊂将偶联的微球离心并用P B S 清洗,加入250μL的微球封闭缓冲液,在室温下避光振荡孵育30m i n㊂P B S清洗微球后,悬浮在150μL的微球储存缓冲液中㊂1.2.8偶联效率的验证取2个偶联反应管并做好标记,1个作为阴性对照,1个作为测试管㊂每管分别加入10000个偶联的微球㊂测试管加入01727期杜文琪等:A型塞内卡病毒V P1蛋白的原核表达及纯化50μL稀释的生物素抗体,对照管中加入50μL分析缓冲液㊂室温避光反应30m i n㊂并于磁力架上沉降1m i n,缓慢除去上清液㊂将50μL稀释的藻红蛋白(P-p h y c o e r y t h r i n,P E)标记的链霉亲和素(s t r e p t a v i d i n-P E,S A-P E)加入测试管中,在对照管中加入50μL分析缓冲液,室温避光孵育10m i n㊂磁力架上沉降1m i n,缓慢除去上清液㊂将微球重悬于125μL微球贮存缓冲液中,并转移到96孔板中,上机检测㊂结果判定标准:阴性对照(背景)的中值荧光强度(m e d i a n f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y,M F I)<100,偶联微球的荧光值>2000M F I可认为偶联成功㊂1.2.9最佳结合蛋白浓度的确定将不同含量(6㊁9㊁12和15μg/1.25ˑ106珠)的S V A-V P1蛋白与1.25ˑ106珠微球偶联,确定最佳结合的蛋白浓度㊂1.2.10S V A抗体单重液相芯片检测方法的建立偶联好的微球稀释至5000个/孔,96孔平板中每孔加入50μL稀释好的微球,于磁力架静置1m i n,使微球完全沉淀后甩去上清㊂微球清洗缓冲液清洗微球2次,样本孔对应加入50μLS V A阴㊁阳性血清,对照孔中加入50μL分析缓冲液㊂避光贴封板,室温震荡孵育1h㊂结束后,清洗微球,每孔加入50μL稀释好的生物素化的抗H i s单克隆抗体,避光贴封板,室温振荡孵育45m i n,完成后清洗微球,每孔加入50μL稀释好的S A-P E,避光贴封板,室温振荡孵育10m i n,完成后清洗微球,每孔加入125μL储存缓冲液充分重悬微球,上机检测㊂1.3统计分析数据用G r a p h P a dP r i s m6.0软件分析,采用A N O V A分析㊂P<0.01表示差异极显著㊂2结果2.1重组质粒的构建及鉴定重组质粒p C o l dT F-V P1经N e dⅠ㊁P s tⅠ双酶切鉴定,载体片段大小为5769b p,目的片段大小为822b p(图1),与预期大小一致,测序结果与目的基因序列一致,结果证明重组质粒构建成功㊂2.2V P1重组蛋白的诱导表达重组蛋白经I P T G诱导后,对诱导前㊁后菌液及空载体诱导前㊁后菌液进行S D S-P A G E分析,结果显示,在约82k u处有一条目的条带(含标签蛋白52k u)(图2),与预期大小相符,表明V P1重组蛋白初步表达成功㊂M,D L10000D N A M a r k e r;1~5,重组质粒p C o l dT F-V P1 M,D L10000D N A M a r k e r;1-5,R e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l d T F-V P1图1重组质粒p C o l dT F-V P1的双酶切鉴定结果F i g.1R e s t r i c t i o nd i g e s t i o no fr e c o m b i n a n t p l a s m i d p C o l d T F-V P11,未诱导的空载体;2,诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白; 4,诱导的重组蛋白;M,蛋白质分子质量标准1,U n i n d u c e d e m p t y v e c t o r;2,I n d u c e d e m p t y v e c t o r; 3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n;4,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n;M,P r o t e i n M a r k e r图2V P1重组蛋白的诱导表达结果F i g.2I n d u c e d e x p r e s s i o no fV P1r e c o m b i n a n t p r o t e i n2.3V P1重组蛋白诱导条件优化由图3可知,当I P T G终浓度为1.2m m o l/L 时,蛋白表达量最高㊂由图4可知,诱导3h后的蛋白表达量最高㊂说明16ħ㊁220r/m i n㊁1.2m m o l/L I P T G诱导3h时表达结果最佳㊂1172中国畜牧兽医49卷M ,蛋白质分子质量标准;1,诱导的空载体;2,未诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4~9,I P T G 浓度分别为0.4㊁0.6㊁0.8㊁1.0㊁1.2和1.5m m o l /LM ,P r o t e i n M a r k e r ;1,I n d u c e de m p t y ve c t o r ;2,U n i n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4-9,I P T G c o n c e n t r a t i o n sw e r e 0.4,0.6,0.8,1.0,1.2a n d1.5m m o l /L ,r e s p e c t i v e l y图3 诱导剂I P T G 浓度的优化F i g .3 O pi t i m i z a t i o no f I P T Gc o n c e n t r a t i on M ,蛋白质分子质量标准;1,诱导的空载体;2,未诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4~9,诱导时间分别为3㊁6㊁9㊁12㊁22和24hM ,P r o t e i n M a r k e r ;1,I n d u c e de m p t y ve c t o r ;2,U n i n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4-9,T h e i n d u c t i o n t i m ew e r e 3,6,9,12,22a n d24h ,r e s p e c t i v e l y 图4 诱导时间的优化F i g .4 O p i t i m i z a t i o no f i n d u c i n gt i m e 2.4 V P 1重组蛋白可溶性鉴定V P 1重组蛋白可溶性分析结果显示,在约82k u 处有目的条带,上清和沉淀中均有表达,且上清中表达量较高(图5),说明该蛋白具有可溶性㊂2.5 V P 1重组蛋白的纯化根据最佳诱导条件诱导V P 1重组蛋白大量表达并用蛋白纯化试剂盒进行纯化,分别收集洗脱峰进行S D S -P A G E 分析,结果显示在约82k u 处有目的条带(图6),表明成功纯化V P 1重组蛋白㊂M ,蛋白质分子质量标准;1,诱导的空载体;2,未诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白全菌液;4,未诱导的重组蛋白上清;5,未诱导的重组蛋白沉淀;6,诱导的重组蛋白全菌液;7,诱导的重组蛋白上清;8,诱导的重组蛋白沉淀M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,I n d u c e d e m p t y ve c t o r ;2,U n i n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i nw h o l eb a c t e r i a l s o l u t i o n ;4,U n i n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u p e r n a t a n t ;5,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n p r e c i pi t a t i o n ;6,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n w h o l e b a c t e r i a ls o l u t i o n ;7,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u p e r n a t a n t ;8,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n p r e c i pi t a t i o n 图5 V P 1重组蛋白可溶性分析F i g .5 S o l u b l e a n a l ys i s o fV P 1r e c o m b i n a n t p r o t e in M ,蛋白质分子质量标准;1,未诱导的空载体;2,诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4,诱导的重组蛋白上清;5,流穿液;6,洗涤液;7~9,分别为洗脱液1㊁2和3M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,U n i n d u c e de m p t y ve c t o r ;2,I n d u c e d e m p t y ve c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n s u p e r n a t a n t ;5,F l o w -t h r o u g h ;6,W a s h i n g s o l u t i o n ;7-9,E l u e n t 1,2a n d3,r e s p e c t i v e l y 图6 V P 1重组蛋白的纯化F i g.6 P u r i f i c a t i o no fV P 1r e c o m b i n a n t p r o t e i n 2.6 V P 1重组蛋白W e s t e r nb l o t t i n g 分析W e s t e r nb l o t t i n g 检测结果显示,纯化后重组V P 1蛋白能被H i s 单克隆抗体识别,在约82k u 处有目的条带(图7),与S D S -P A G E 中重组V P 1蛋白大小一致㊂2.7 偶联效率验证偶联效率验证结果显示,阴性对照(背景)的平均M F I 为17(<100);测试孔的平均M F I 为2339.5(>2000),证明S V A V P 1蛋白与微球偶联成功㊂21727期杜文琪等:A 型塞内卡病毒V P 1蛋白的原核表达及纯化M ,蛋白质分子质量标准;1,未诱导的空载体;2,诱导的空载体;3,未诱导的重组蛋白;4,诱导的重组蛋白M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,U n i n d u c e de m p t y v e c t o r ;2,I n d u c e d e m p t y v e c t o r ;3,U n i n d u c e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n ;4,I n d u c e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n图7 V P 1重组蛋白的W e s t e r nb l o t t i n g 分析F i g .7 W e s t e r nb l o t t i n g a n a l y s i s o fV P 1r e c o m b i n a n t p r o t e i n 2.8 最佳结合蛋白浓度的确定将不同含量(6㊁9㊁12和15μg/1.25ˑ106珠)的S V A -V P 1蛋白与1.25ˑ106珠微球偶联,结果显示当蛋白浓度<12μg/1.25ˑ106珠时,样品中的M F I 随着V P 1蛋白浓度增加而逐渐升高,当蛋白浓度为12μg/1.25ˑ106珠时,平均M F I 达到2689.0,进一步升高蛋白浓度并不能增加M F I㊂不同蛋白浓度下,背景对照的平均M F I 均<100,由此确定出最佳结合的蛋白浓度为12μg/1.25ˑ106珠微球(表1)㊂2.9 S V A 抗体单重液相芯片检测方法的建立由图8可知,背景对照M F I 的平均值为23.5,S V A 阳性血清M F I 的平均值为10172,极显著高于阴性血清M F I 的平均值162.5(P <0.01),说明V P 1蛋白偶联的荧光微球可用于S V A 抗体的检测㊂表1 不同浓度蛋白M F IT a b l e 1 M F I o f p r o t e i nw i t hd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s 蛋白浓度P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n /(μg /1.25ˑ106珠)背景对照1B a c k g r o u n d c o n t r o l 1背景对照2B a c k gr o u n d c o n t r o l 2样品1S a m p l e 1样品2S a m p l e 2629.027.0 807.0810.0918.016.01849.01859.51217.017.02580.52797.51528.028.51635.51701.0①B C ,背景对照;N C ,阴性血清;S V A -4ˑ,4倍稀释阳性血清㊂②与B C 相比,**,差异极显著(P <0.01)①B C ,B a c k g r o u n dc o n t r o l ;N C ,N e ga t i v es e r u m ;S V A -4ˑ,4-f o l d d i l u t e d p o s i t i v e s e r u m.②C o m p a r e d w i t h B C ,**,E x t r e m e l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.01)图8 S V A 阳性血清及阴性血清M F I 检测F i g .8 T h eM F I o f S V A p o s i t i v e a n dn e ga t i v e s e r a 3 讨论猪塞内卡病毒病被认为是一种新兴的家畜传染病,近年来持续引发关注[13]㊂作为猪水疱病的新病原体,S V A 在不同地区㊁国家迅速进化和传播,但早期的塞内卡病毒分离株对猪没有明显致病性,而近年来从巴西㊁美国㊁中国㊁加拿大㊁哥伦比亚和泰国等国家的相关病例报道可发现其致病性显著增强[14-19],表明塞内卡病毒正朝着更强毒力的表型进化,应引发高度关注㊂为了更好地防控和检测塞内卡病毒病,开展塞内卡病毒病检测技术的相关研究十分必要[20]㊂对于S V A 的防控有赖于对其准确快速的检测,血清学方法因操作简单㊁成本较低,常用于流行病学研究或监测㊂然而传统的E L I S A ㊁I F A 和V N检测方法耗时久㊁所需样本量大㊁且在单个反应中很难同时将S V A 感染与其他类似疾病区分开来,因此亟需建立一种灵敏㊁快速且高通量的抗体检测技术㊂新型液相芯片技术的主要优势在于在简单检测3172中国畜牧兽医49卷的基础上增加了另一个维度,致力于多重分析技术㊂近年来,研究者致力于液相芯片检测技术在动物疫病检测方面的研究和应用,肖丽等[21]建立同步检测伪狂犬病病毒(P R V)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(P R R S V)抗体的双重液相芯片检测方法,与E L I S A法相比P R V和P R R S V抗体的最高血清检出稀释倍数分别提高66和32倍㊂本研究在检测抗原的选择上,S V A V P1蛋白具有高度保守性,且最具抗原性,可刺激机体产生中和抗体[22-23],可作为首选㊂在表达系统的选择上,大肠杆菌作为最常用的原核表达系统,广泛用于同源和异源蛋白质的表达㊂重组蛋白在大肠杆菌中包含可溶性和包涵体两种表达形式㊂由于包涵体难溶且不具天然生物活性,在纯化过程中操作繁琐且成本较高㊂因此本研究采用冷休克表达载体p C o l dT F对于V P1蛋白进行表达,以期增加蛋白产量㊁纯度及可溶性㊂本研究利用原核表达载体对S V A V P1蛋白进行了表达,并探索研究了诱导表达过程中诱导时间㊁I P T G浓度几个重要诱导条件,利用优化后的最佳诱导表达条件,可在短时间内对V P1蛋白大量表达,提高了V P1重组蛋白的表达效率㊂本试验借助重组载体多克隆位点携带的H i s标签对重组V P1蛋白成功进行了纯化㊂为了提高V P1蛋白的纯化效率,在蛋白纯化试验中将B i n g d i n g B u f f e r的咪唑浓度由10m m o l/L降至5m m o l/L,洗脱液中的咪唑浓度为500m m o l/L,获得了纯化效率较高的V P1重组蛋白㊂纯化后S V A V P1蛋白与微球偶联成功,本研究探讨了V P1蛋白与荧光微球偶联的最佳蛋白浓度,应用偶联成功的荧光微球,通过液相芯片检测技术可对塞内卡病毒阳性血清进行检测,初步建立了S V A抗体液相芯片检测技术㊂本试验结果为实现区分塞内卡病毒病与其他类似症状的疾病及血清学检测方法的建立奠定了基础㊂4结论本研究利用p C o l d T F原核表达载体对S V A V P1蛋白进行了高效可溶性表达与纯化,纯化后的V P1重组蛋白与荧光微球偶联后,结合液相芯片技术可用于猪血清中塞内卡病毒抗体的检测㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] Z HA N G X,Z HUZ,Y A N GF,e t a l.R e v i e wo f S e n e c av a l l e y v i r u s:A c a l lf o ri n c r e a s e d s u r v e i l l a n c e a n dr e s e a r c h[J].F r o n t i e r s i n M i c r o b i o l o g y,2018,9:8.[2] S E G A L E 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xiap原核重组蛋白的表达和纯化

• 能够高度选择性地切割某些蛋白质，这种切割只发生在少数（通常只有1个）位点上，主要是在结构域间的位点上，切割的结果或是活化某种蛋白，或使某种蛋白失活，但从不完全降解一种蛋白质。
Caspases
• 现已确定至少存在11种caspase：
这些caspases中，caspase 1和caspase 11，以及可能还有caspase 4被认为不直接参与凋亡信号的转导，它们主要参与白介素前体的活化；而caspase 2，caspase 8， caspase 9和caspase 10参与细胞凋亡的起始；参与细胞凋亡执行的则是caspase 3， caspase 6和caspase 7，其中caspase 3和7具有相近的底物和抑制剂特异性，它们降解 PARP，DFF-45（DNA fragmentation factor-45
Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测（增加了两个PH）
M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH 5.4、4.9洗脱液pH
总结：在增加两个不同pH洗脱液后，发现在洗脱液pH为4.9、4.5时洗脱下来的目的蛋白较标准方法多。但是纯化后的蛋白依然有两条杂带，这有一条可能是His标签蛋白，另外有可能是由于与目的蛋白等电点很接近，没法用不同梯度的pH将其分离。
二、蛋白纯化条件优化
Ni-NTA柱标准方法洗脱跑胶检测 M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH
Ni-NTA柱改进方法洗脱后SDS-PAGE胶检测
M：Marker A：蛋白原液 B：穿透液 W：清洗液 5.9：洗脱液ⅠpH 4.5:洗脱液ⅡpH
• 蛋白纯化条件优化

塞尼卡病毒VP1蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

中国病原生物学杂志2020年11月第15卷第11期Journal o f Pathogen Biology Nov. 2020. Vol. 15, No. 11• 1299•D()I：10. 13350/j. cjpb. 201112•论著•塞尼卡病毒VP1蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体制备<孟媛m，张金勇2,姜宇航％于成东王政w，于桐L，李亭玉u，高旭1…，鲁会军> •，金宁一=…(1.延边大学农学院，吉林延吉133002;2.军事科学院军事医学研究院军事兽彪研究所，僉林长春130122)【摘要】目的利川原核表达系统表达塞尼卡病#(Seneca Valley vims，SVV)V P l蛋并用纯化的蛋白免疫小鼠，制备V P1多克隆抗体。

方法P C R扩增S W V P1蛋d基因，并将其克隆至pET-28a( +)载体，构建P E T-28a-V P l重组质粒。

将重组质粒转化至B L21(D E3)p L y S s大肠埃希菌•使用I P T G诱导表达目的蛋白并优化表达条件，利用H i s标签镍离子蛋白纯化柱纯化蛋d。

用纯化后的蛋白免疫小鼠•制备多克隆抗体，并用接毒后的B H K-21细胞进行Western blot验证。

结果P C R扩增S V V V P1目的基因片段为792 b p，与预期相符。

成功构建p E T-28a-V P l重组质粒，转化至D E3后经I P T G诱导表达相对分子质量单位约为35X10:<的目的蛋白•以37 C、0.8 m m o l/L诱导剂诱导4 h表达量最高，且重组蛋白以包涵体形式表达。

用H i s标签Ni2’ -N T A金厲螯合蛋白质纯化柱纯化蛋白并免疫小鼠，制备的抗血清能与接毒后的B H K-21细胞裂解产生及纯化的V P1蛋白反应。

结论原核表达了塞尼卡病毒V P1蛋白，制备f抗小鼠多克隆抗体，该抗体具有免疫反应性。

【关键词】塞尼卡病毒；V P1蛋白；纯化；多克隆抗体【中图分类号】■【文献标i只码】【文章编号】1673-5234(2020)1卜1299-05[^Journal o f Pathogen B io lo g y.2020 N o v；15(11)：1299 —1303» 1309.]Expression, purification, and preparation of a polyclonal antiliody for the VP1 protein of the Seneca Valley virus MENG Yuan1.2，ZHANG Jin-yong2，JIANG Yu-hang、YU Cheng-dong1.」，WANG Zheng1.2，YU Tong1.2，LI Ting-yu' " »C j A O Xu1?LU Hui-jun .JIN Ning-yi' (1. Yanbian U niversity^ Y a n ji •J ilin ^China133002；2.Institute o f M ilita ry Veterinary M edicine ^A cadem y o f M ilita ry Sciences)(Alistracl]Objective T o optimize conditions for expression of the V P1protein of the Seneca Valley virus (S V V)in a prokaryotic expression system and to immunize mice with the purified protein in order to prepare V P1 polyclonal antibodies. M e t hods T h e V P1 gene of the S V V w as amplified and transfected into a pET-28a( )vector，and the recombinant plasmid p E T-28a-VP1 w a s constructed and transformed into B L21(D E3)pLyS>s Escherichia coli.Expression of the recombinant V P1protein w a s induced with I P TG. T h e V P1protein w a s purified on a His-tag nickel ion protein purification column. T h e purified protein w a s used to immunize mice to prepare polyclonal antibodies. Inoculated B H K-21 cells were tested for the antibodies using W e s tern blotting. Results T h e target gene, V P1of the S W,w a s successfully amplified. T h e V P1gene w a s 792 bp in length.which agreed with expectations. T h e recombinant plavsmid p E T-28a-V P l w a s successfully constructed. Expression of the r e c o mbinant protein w a s induced, and the M r of the target protein about 35 X 10'. T h e level of recombinant protein expression w a s highest at 37’C with 0. 8 mmol/1- I P T G after 4 h. In addition, the recombinant protein w a s expressed in the form of inclusion bodies. T h e protein w a s purified on a His tag Ni -N T A metal chelating protein purification column. Western blotting w a s used to detect the response of inoculated B H K-21cells to the purified target proteia A band of interest wa s detected at around 35 kDa. Conclusion T h e V P1protein of the S V V was expressed in a prokaryotic expression s y s t e m» and polyclonal antibodies a- gainst the V P1protein were prepared in mice.Seneca Valley virus；V P1protein；purification；polyclonal antibody塞尼卡病毒（Seneca Valley virus，SVV)是一种具有二十面体结构，直径27〜30 n m的单链正链无褒膜RNA病毒1。

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶原核表达、表位分析及其抗体制备的开题报告

人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶原核表达、表位分析及其
抗体制备的开题报告
一、研究目的
人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶（hAST1）是一种重要的酶类，能够催化丙氨酸和α-酮戊二酸之间的转化。

它在人体内的代谢过程中起着重要的作用，是人体氨基酸代谢的主要酶之一。

因此，本研究旨在进行hAST1原核表达、表位分析和抗体制备，为后续的研究提供基础数据和工具支持。

二、研究内容
1. hAST1原核表达
利用原核表达系统，构建hAST1表达载体，转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。

对表达培养体进行诱导、收获和裂解，进行纯化和鉴定。

以Western blotting等技术进行表达的鉴定。

2. hAST1表位分析
利用生物信息学和分子生物学技术，对hAST1的结构、功能和性质进行分析，获取hAST1可能存在的表位信息，并通过筛选、克隆、纯化和鉴定等步骤，获得hAST1单克隆抗体。

3. hAST1抗体制备
通过筛选和鉴定获得hAST1单克隆抗体，进行相关实验和验证，对其性能和效用进行评价，为后续研究提供强有力的实验工具支持。

三、研究意义
人Ⅰ型丙氨酸氨基转移酶在人体内有着广泛的作用，与许多疾病的发病和发展有着密切关系。

如肝功能异常、疾病等。

本研究通过对hAST1原核表达、表位分析及抗体制备的研究，有助于深入了解hAST1
的结构、功能和性质，为相关疾病的临床诊断和治疗提供了强有力的基础数据和工具支持。

同时，这些研究成果对于相关的生物医学研究和开发也具有重要的意义，有望为生物医学领域的开发和创新提供新的思路和方法。

SUA41蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备

SUA41蛋白表达和纯化及其多克隆抗体制备黄国文;韩玉珍;傅永福【摘要】旨在制备特异性SUA41多克隆抗体,为深入研究其在植物生长发育中的功能提供有力的分子生物学和生物化学的工具.PCR扩增拟南芥SUA41基因中编码280个氨基酸(401-680位氨基酸)的特异片段,经过GATEWAY的DNA重组技术构建了原核表达载体pDEST17-SUA41,用热休克法转化到E.coliBL21(DE3)star感受态细胞,以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出6×His-SUA41融合蛋白,用8 mol/L尿素缓冲液溶解包涵体并且经过水运级去除尿素获得提纯的融合蛋白,并利用Western blotting鉴定确认.融合蛋白经Ni金属螯合柱亲和层析得以纯化,用SDS-PAGE进一步纯化.纯化的融合蛋白经过SDS-PAGE后切胶回收,免疫小白兔,制备多抗血清,然后用Western blotting进行检测,鉴定血清特异性和效价.结果显示,融合蛋白6×His-SUA41免疫兔,产生特异性的SUA41兔抗血清,可以检测到细菌和拟南芥组织中SUA41蛋白.用水提纯变性剂尿素溶解的包涵体蛋白具有可行性.制备的特异性SUA41兔抗血清效价高,能够有效地识别大肠杆菌表达的和拟南芥的SUA41蛋白.在有合适的对照情况下,该兔抗血清可以用于分析植物中SUA41蛋白的功能.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2012(000)003【总页数】7页(P153-158,165)【关键词】SUA41;融合蛋白;蛋白纯化;兔抗血清【作者】黄国文;韩玉珍;傅永福【作者单位】湖南科技学院生命科学和化学工程学院,永州425100;中国农业大学生物学院,北京100081;中国农业科学院作物科学研究所农作物基因资源与遗传改良国家重大科学工程,北京100081【正文语种】中文SUA41是一种核孔蛋白，在拟南芥的生长发育过程中起重要作用。

花生AhAO1蛋白的原核表达、纯化及抗体制备

摘要：采用Ｒ－ＣＴＰＲ方法，以花生叶片ＲＮＡ逆转录得到的ｃＮＡ为模板，扩增出ＡＡ１基因片段，其插入原ＤｈＯ将
核表达载体ｐＲＥＨａ中，构建ＡＡ１因片段原核表达载体Ｈａｈ１ＰＯＸＴｈＯ基ＴＡＡＯ，经ＰＲ和测序确证后，以ＩＴＣＰＧ诱
ｎｉＨｉ— ａｔ— ＳＡｈＡＯ１ｐｌｃｏａｔｏｙｌｙｏｎａｏｏｕｔｒｒｓａｃｎＡｌＡｏ１ｏｙｌｎａｉｄａｓｆｕｄｔｎｆｒｆｒｈｅｅｅｒｈｏｌｌｎｂｉ．ＫｅｗｏｄＡｒｈｉｙｇｅ；ＡＯ；ＲＯＥＸＨＴａｐｏａｙｔｃｅｐｅｓｏａｔｏｙｒｓ：ａｃｓｈｐｏａａＡｈ１ｐＰ；ｒｋｒｏｉｘｒｓｉｎ；ｉｄｙｎｂ
Ｄｏ：０３６￣ｉｓ．０９７９．０００．２ｉ１．９．ｎ１０ —７１１．０９ｓ２４０中图分类号：Ｑ９３４．２文献标识码：Ａ文章编号：１０．７１２１）．０４００９７９（０００００ —３４
Ｐｒｋｒｏｉｐｒｓｉｎ，ｏａｙｔｃＥｘｅｓｏＰｕｒｆｃｔｏｎＰｏｙｃｏａｉａｉｎａｄｌｌｎｌｉＡｎｔｂｏｙＰｒｐａａｉｎｆｉｄｅｒｔｏｏＰｅｎｕｔＡＯ１ＰｒｔｉａＡｈ０ｅｎ
ＬａｆＢｉｔｃｎｌｇｒＰａｔｖｌｐｎ，ｌｇｆＬｆｃｅｃ，ｏｔｉａＮｏｍａｉｅｓｙＧｕｎｚｏ１６１ｂｏｏｅｈｏｏｙｆｌｎｏＤｅｅｏｍｅｔＣｏｌｅｏｉＳｉｎｅＳｕｈＣｈｎｒｌＵｎｖｒｉ，ａｇｈｕ５０３，ｅｅｔ

人高迁移率族B1蛋白原核表达、纯化及抗体制备和初步应用

高迁移率族蛋白（ＨＭＧ蛋白）因其相对分子质量５一ＡＧＣＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＣＡＧ３（ＣＡＣＴＧＣＡＧＡＡＣＴＡ一划小（＜３０）在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁线处为Ｅｏ酶切位点）５一ｃｃｃＴＧＧｃＴｃＴＡ — Ｍ０００，ｃＲＩＧＴＡｃｃＡＧｒＡｃＴＩｆ
ｔｉ。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。ｏｅｒｓ
１２方法．
１２ｉ引物设计及目的片段的扩增根据ＮＢ基因库中．．ＣＩ
［中图分类号］Ｒ９．１３２１
［文献标识码］Ｂ
ＨＢ编码区序列以及原核表达载体ｐｓｔ：ＭＧ１Ｒｅ上的多克隆位Ａ点，过Ｐｉｒｒｍｅ．通ｒｅｉｒ０软件设计上下游特异性引物如下：ｍｅＰ５
布，根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细鉴定。
胞核ＨＧ１ＭＢ参与构建核小体，维持其稳定性，同时在ＤＡ重组、复制、修复和基因转录中起重要的辅Ｎ助作用。细胞外ＨＭＧＩ有细胞因子特性，与细Ｂ具它胞分化、移、殖、凋亡以及炎症反应的诱导等密迁增
氧化物酶（Ｒ）ＨＰ标记的羊抗兔ＩＧ购自赛尔生物科技有限公ｇ
司；ｉＮＡＳｐｒｏＮ “一Ｔｕｅｗ层析纯化树脂购自Ｑａｅ；异硫氰酸ｌｆｉｎｇ（ＩＣ）记的驴抗兔ＩＧ购自ＪｃｓｎＩｍｕｏｅｅｒｈＬｂｒ— ＦＴ标ｇａｋｏａｖｎｒｓａｃａｏａ

乙肝疫苗制备

乙肝疫苗的制造工艺
1.目的基因的获取 2.工程菌的构建 3.目的基因的表达 4. 蛋白质的分离纯化

目的基因的获取
编码乙型肝炎表面抗原的基因的获取一般目的基因的获取方法有: cDNA法, 化学合成法 ,反转录法
ห้องสมุดไป่ตู้
工程菌的选择

CHO细胞的特点
①具有准确的转录后修饰功能 ,表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子 ②具有产物胞外分泌功能 ,便于下游产物分离纯化; ③具有重组基因的高效扩增和表达能力; ④具有贴壁生长特性 ,且有较高的耐受剪切力和渗透压能力 ,可以进行悬浮培养 ,表达水平较高; ⑤CHO 细胞属于成纤维细胞 (fibrob2last) ,很少分泌自身的内源蛋白 ,利于外源蛋白的后分离
乙肝疫苗的制备
乙肝疫苗的概念

乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。
3、阴离子交换柱层析介质：DEAE Sepharose FF HBsAg活性蛋白经Sephadex G-25柱脱盐换液，使缓冲盐系统的PH、离子强度和 IEC平衡液一致按照平衡柱床、丄样吸附、氯化钠浓度梯度分段洗脱、清柱再生程序层析
4、凝胶过滤柱层析介质：Sepharose 4 FF 超滤浓缩到适当体积按照平衡柱床、丄样、洗脱程序层析 5、除菌收取到的HBsAg除菌过滤，即为纯品

基因工程乙肝疫苗是采用基因工程技术生产的，即构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，然后转染相应的宿主细胞，如酵母、 CHO细胞，生产乙肝表面抗原蛋白。利用重组酵母生产的叫重组酵母乙肝疫苗，利用CHO细胞生产的叫重组CHO乙肝疫苗，剂量为每支5微克。它们都可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感，都可以放心选用。

蛋白亚细胞定位方法

蛋白亚细胞定位方法
蛋白质的亚细胞定位是指确定蛋白质在细胞内的具体位置。

这对于理解蛋白质的功能和细胞生物学过程至关重要。

以下是一些常用的蛋白质亚细胞定位方法：
1. 免疫荧光技术：这是一种基于抗体特异性结合的方法。

通过使用针对目标蛋白质的特异性抗体，将其标记上荧光染料，然后观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞定位。

2. 荧光蛋白标记：将目标蛋白质与荧光蛋白（如GFP、RFP 等）融合表达，使其在细胞内发出特定颜色的荧光。

通过观察荧光的分布，可以确定蛋白质的亚细胞定位。

3. 细胞器特异性染料：使用细胞器特异性染料对细胞进行染色，然后观察目标蛋白质与这些染料的共定位情况。

例如，使用线粒体染料可以确定蛋白质是否定位于线粒体。

4. 免疫组织化学技术：该方法用于检测组织切片中的蛋白质定位。

通过使用针对目标蛋白质的抗体，将其标记上可见的染料，然后观察染料在组织切片中的分布。

5. 蛋白质相互作用分析：通过研究蛋白质与其他已知亚细胞定位的蛋白质之间的相互作用，可以间接推断目标蛋白质的亚细胞定位。

这些方法可以单独使用，也可以结合使用，以提高蛋白质亚细胞定位的准确性。

在进行蛋白质亚细胞定位研究时，需要选择合适的方法，并结合其他实验手段进行综合分析。