1,2改良CTAB法提取番石榴叶片总DNA

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CTAB法提取植物总DNA改良版

CTAB法提取植物基因组DNA这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。

CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

一、材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料二、试剂1、2×CTAB溶液：CTAB (W/V) 2%,Tris-HCl 100 mM（pH8.0）EDTA 20 mM（pH8.0）NaCl 1.4MPVP 1%巯基乙醇 0.2%配制时先不加巯基乙醇，将其它五种加热搅拌混匀灭菌后再加入巯基乙醇。

2、乙醇 70%3、酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）或氯仿-异戊醇（24:1）体积比4、RNaseA 10mg/ml5、乙醇或异丙醇三、方法步骤：1、取适量CTAB于60℃预热30min.2、取0.2g新鲜叶片蒸馏水洗净用吸水纸吸干至于液氮遇冷的灭菌研钵，液氮迅速研磨成粉末;3、取一预冷灭菌1.5ml EP管，将粉末装入后加入0.7ml CTAB，迅速振荡混匀后置60℃水浴30 min ;4、加入0.7 ml 酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），颠倒摇匀（10次以下）;5、室温下（>15℃）12000 rpm 离心10 min;6、上清移至新EP管中，加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），颠倒摇匀（10次以下）；7、室温下（>15℃）12000 rpm 离心10 min;8、移上清至一预先加入0.8倍体积异丙醇的新1.5 ml EP管中，平放旋转混匀（动作要轻柔，防止DNA断链），冰浴20 min；9、12000 rpm 4℃离心10 min10、弃上清，用滤纸吸干壁上水，不能碰到沉淀；11、加1ml 70%乙醇洗沉淀12000 rpm 4℃离心3 min,尽弃乙醇，再12000rpm 4℃离心1 min,尽弃残余乙醇，超净台吹干;12、用30~50 ul dd H2O溶解-20℃存贮。

改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验

改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验摘要:由于大戟属(Euphorbia Linn)植物叶片中含大量的多糖､酚类等次生代谢物质,严重影响总DNA的提取,因此,以大戟属药用植物叶片为材料,对常用的CTAB(Hexadecyltrimethy ammonium bromide)法进行了改良,并通过琼脂凝胶电泳法对所提DNA样品进行了检测｡结果表明,改良CTAB法提取的植物总DNA纯度很高,较适合提取大戟属植物的总DNA｡关键词:大戟属;药用植物;CTAB法;总DNA提取A Modified CTAB Method for Total DNA Extraction from the Medicinal Herb Leaves of Euphorbia LinnAbstract: The cells in Euphorbia Linn leaves were rich in amylose and hydroxybenzene. These substances provided some seriously adverse effects on extraction of DNA from Euphorbia. Using the leaves of Euphorbia as material, the DNA were extracted by a modified CTAB(Hexadecyltrimethy ammonium bromide) method and detected by means of agarose gel electrophoresis. The results showed that the modified CTAB method was suitable for extraction of its’ DNA and it was a goodmethod for total DNA extraction from Euphorbia.Key words: Euphorbia Linn; medicinal herb; hexadecyltrimethy ammonium bromide(CTAB) method; total DNA extractionDNA的提取与纯化是进行分子标记试验最关键的一步,获得高质量的DNA样品是进行PCR扩增的首要步骤[1]｡从植物材料中提取基因组DNA的质量受到多种因素的影响,在不同植物或同种植物不同时期组织中存在着不同数量的多糖､色素以及种类繁多的次生物质,特别是多糖､酚类在提取过程中可与DNA产生沉淀,形成包裹DNA的黏稠胶状物,其难以溶解或产生褐变,使得DNA提取质量较低,获得的DNA溶液常常黏度大乃至呈胶状,这些物质如果清除不净则会影响后续的试验研究[2-4]｡大戟属(Euphorbia Linn)为大戟科(Euphorbiaceaec)植物中最大的一属,全世界有2 000余种[5],其中不少种具有很高的药用价值,李忠国[6]调查发现,安徽省琅琊山药用植物资源中有22种大戟科药用植物;李惠等[7]通过研究华东地区大戟属药用植物资源后,整理出了26种大戟属药用植物,并且药用部位明确,疗效确切,具有较高的药用价值｡大戟属药用植物的医药价值使得其研究开发成为了热点,尤其是对大戟属药用植物在分子水平上的探讨方兴未艾｡目前在大戟属药用植物进行分子标记试验中,由于本属植物具有白色或黄白色乳汁,含酚类､黄酮类等次生物质较多,若提取方法不当,不仅提取出来的DNA容易降解,而且会影响PCR扩增反应的稳定性和重复性｡因此,如何高效简便地去除多糖､多酚等次生物质,对提取纯化大戟属植物DNA至关重要｡目前,大戟属药用植物总DNA提取方法的研究在国内外尚未见报道,所以在前期研究的基础上[8,9],结合本属植物特点,以经典提取植物DNA的CTAB(十六烷基三乙基溴化铵,Hexadecyltrimethy ammonium bromide)法为基础[10],并加以改进,筛选出一种比较适合大戟属植物DNA提取的方法,为大戟属药用植物进一步开发利用提供技术支持｡1材料与方法1.1材料1.1.1供试材料试验所用植物材料为采自安徽省琅琊山的大戟(E. pekinensis Rupr.)､月腺大戟(E. ebracteolata Hayata);采自芜湖市的乳浆大戟(E. esula L.)､斑地锦(E. supina Rafin)､地锦(E. humifusa Willd.)､一品红(E. pulcherrima Willd. et Klotzsch.),原植物均经安徽师范大学周守标教授鉴定｡用于提取DNA的材料为各供试植物的新鲜叶片,采后迅速置于冰盒中,带回实验室后,除去主叶脉,在电子天平上精确称取0.5 g,于-20 ℃冰箱保存3 d｡1.1.2主要试剂①DNA抽提缓冲液,NaCl 500 mmol/L,Tris-HCl 100 mmol/L､pH 值8.0和EDTA 20 mmol/L､pH值8.0｡②DNA裂解缓冲液,NaCl 700 mmol/L, Tris-HCl 50 mmol/L､pH值8.0和EDTA 20 mmol/L､pH值8.0,CTAB 5%(m/V),β-巯基乙醇1%(用前加)[11]｡③TE 缓冲液,Tris-HCl 10 mmol/L､pH值8.0和EDTA 1 mmol/L､pH值8.0｡④50×TAE缓冲液,Tris 242 g,冰乙酸57.1 mL,EDTA(0.5 mol/L､pH值8.0)100 mL｡⑤氯仿-异戊醇混合液(体积比为24∶1,下同)｡配制药品用的水均为双蒸馏水｡将以上缓冲液分装后,密封､灭菌,置于冰箱4℃保存｡1.1.3主要仪器试验中的主要仪器有凝胶成像仪､微波炉､离心机､超低温冰箱､电泳槽､电泳仪､手掌型离心机､恒温水浴锅､电热恒温鼓风干燥箱､超净工作台等｡1.2方法1.2.1改良CTAB法提取植物总DNA①提取前将裂解缓冲液放至65 ℃水浴中｡②称取0.5 g植物材料,用液氮速冻后,迅速研磨成细粉,分装于1.5 mL的Eppendorf 管中｡③在Eppendorf管中加入1 mL DNA提取缓冲液,用力摇动使其充分混匀后,于15 ℃､8 000 g离心5 min｡④静止后弃上清,再加入1 mL DNA提取缓冲液,充分混匀,于15 ℃､8 000 g离心5 min｡⑤静止后弃上清,加入1 mL 65 ℃预热的DNA提取缓冲液,悬浮沉淀,充分混匀,放入65 ℃水浴30 min｡⑥于15 ℃､12 000 g离心5 min,取上清,加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,轻轻颠倒混匀,静置10 min｡⑦于15 ℃､12 000 g 离心5 min,取上清,加入等体积的异丙醇,充分混匀,4 ℃静置30 min ｡⑧于15 ℃､12 000 g离心10 min,静止后弃上清,加入75 %(V/V)乙醇洗数次｡⑨于15 ℃､12 000 g离心3 min,静止后弃上清,自然风干直至无酒精味｡⑩加入100 μL TE缓冲液,放入4 ℃环境待用,或-20 ℃储存｡1.2.2电泳检测对所提取的DNA取3~5 μL于0.8%的琼脂糖凝胶上,以5 V/cm电泳1 h左右,EB染色20~25 min,在凝胶成像系统(AlphaImager)中观察和拍照｡2结果与分析2.1DNA电泳结果将叶片各部位提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,检测结果见图1｡DNA电泳结果显示,改良CTAB法所提取的大戟属植物叶片的DNA为一条清晰完整的条带,DNA片段大小较一致,条带后面没有明显的拖尾,证明所提叶片的总DNA含杂质较少｡2.2总DNA纯化加入等体积的氯仿-异戊醇混合液,轻缓颠倒混匀,室温静置10~15 min;于12 000 g离心10 min;重复前面步骤｡取上清液,加入终浓度0. 2~0. 4 mol/L的NaAc､12倍体积的无水乙醇,放置1 h｡12 000 g离心10 min,弃上清液｡用70 %乙醇洗涤沉淀2~3次,自然干燥后,溶于50~100 μL TE中,-20 ℃保存备用｡3讨论虽然植物DNA的提取是一项常规的分子生物学实验技术,但由于大戟属植物组织细胞中含有大量的酚类､多糖及其他次生代谢产物,使得用传统的CTAB方法难以分离出高质量的DNA,如果提取方法选择不当,会干扰后续的操作｡作者对大戟属植物叶片总DNA的提取过程经过反复的改进,最后提取出了质量较高的总DNA,并在提取中总结出以下操作事项,以期为大戟属药用植物的分子生物学研究提供技术支撑｡1)首先,用于DNA提取的植物材料是从远离实验室的野外采集获得,新鲜材料在旅途中容易枯萎､腐烂,特别是一些离体材料极易受到DNA酶的作用,导致DNA的降解｡因此采集后必须迅速置于冰盒中,带回实验室｡2)植物材料在研磨时,一定要使材料处于低温状态,而且所用研钵应该是预先在-20 ℃冰箱冷冻过夜､待其彻底冷却后再放入植物材料｡在研磨过程中,确保不要让液氮挥发干净,以防止植物材料回温,否则会造成DNA的严重降解;研磨叶片时,粉末研得越细越好,研磨好的材料非常容易变褐,宜迅速转入Eppendorf管中,不要使之融化,以免造成DNA的降解｡3)在提取DNA的过程中,所有的操作均需要动作轻柔,避免剧烈振动,以免DNA 断裂降解｡4)在用氯仿-异戊醇混合液抽提时,离心温度应保持不低于15 ℃;若温度太低,可能导致CTAB沉淀,从而损失DNA;在离心前增加氯仿-异戊醇混合液和提取缓冲液的接触时间,让杂质更好地被分离,减少用氯仿-异戊醇混合液的抽提次数,避免操作过程中DNA的污染｡5)CTAB是一种阳离子去污剂,既能有效裂解植物的细胞壁,又能去除多糖类物质,还可以溶解细胞膜,较好去除多糖的干扰｡在加入CTAB缓冲液进行温浴时,将时间延长至2 h能更好地处理多糖､酚类及其他杂质,所获得的DNA质量也将较高｡6)在提取过程中,采用常规CTAB法常出现多酚类物质的褐化现象,使DNA溶液颜色产生浑浊｡β-巯基乙醇具有抗氧化作用,在改良CTAB法中,提取液中加入1% β-巯基乙醇可以有效地去除植物组织内的多糖物质和多酚类物质,防止酚类物质造成褐化现象｡7)PCR技术对DNA样品量和纯度的要求均不高,但因PCR具有很高的灵敏度,为防止试剂交叉污染,应尽量减少提取步骤;采用改良的CTAB法提取大戟属植物DNA,能够获得高质量的DNA样品｡8)在DNA提取过程中,用异丙醇沉淀时,若异丙醇未挥发尽,会直接影响Taq DNA聚合酶的活性,试验中应该让异丙醇沉淀离心后充分挥发｡9)在DNA提取过程中,氯仿是蛋白的有效沉淀剂,对Taq DNA聚合酶有变性作用｡10)DNA沉淀出现后,絮状沉淀不一定全是DNA沉淀,判断絮状沉淀的标准是看其是否易溶于TE,若易溶则说明其杂质含量较少,若难溶则说明其杂质含量较高,纯度较差｡而TE溶解是一个比较缓慢的过程,为了充分溶解,通常在4℃条件下溶解1 d｡参考文献:[1] 刘塔斯,林丽美,龚力民,等. 分子标记中植物DNA提取方法的研究进展[J]. 中南药学,2005,3(6):370-373.[2] 黄晓丹,张云贵,应铁进. 高质量植物基因组DNA的提取[J]. 植物生理学通讯,2006,4(2):311-314.[3] 周凤,张东旭,吕洪飞. 4种金丝桃属植物基因组DNA提取及RAPD分析[J]. 山西大同大学学报(自然科学版),2001,26(4):64-67.[4] 桂腾琴,乔爱民,孙敏. 果梅基因组DNA提取方法的比较及ISSR分析[J]. 北方园艺, 2008(4):212-215.[5] 钱啸虎. 安徽植物志(第三卷)[M]. 北京:中国展望出版社,1988.256-257.[6] 李国忠. 安徽琅琊山药用植物资源调查[J]. 中草药,1997,28(8):495-499.[7] 李惠,赵志礼,倪梁红. 华东地区大戟属药用植物资源调查研究[J]. 时珍国医国药, 2010,21(4):990-991.[8] 蒋继宏, 孟娜, 曹小迎. 苏皖产大戟属药用植物rDNA的ITS序列分析[J]. 中草药, 2005,36(6):900-902.[9] 孟娜,周守标,蒋继宏. 五种大戟属植物nrDNA的ITS序列分析及其叶的比较解剖学研究[J]. 广西植物,2006,26(1):18-21.[10] AUSUBEL F M,BRENT R, KINGSTON R E, et al. 精编分子生物学实验指南[M]. 颜子颖,王海林,译. 北京:科学出版社, 2002. 37-38.[11] 黄小英,刘瑛,赖小萍. 用CTAB法提取苎麻总DNA试验[J]. 江西农业学报,2001,13(4):40-42.。

改良CTAB法用于提取红麻成熟叶片高质量DNA的研究

１５８中国麻业科学ＰＬＡＮＴＦＩＢＥＲＳＣＩＥＮＣＥＳＩＮＣＨＩＮＡ２００７年第２９卷第３期文章编号：１６７３－７６３６（２００７）０３－０１５８－０５改良ＣＴＡＢ法用于提取红麻成熟叶片高质量ＤＮＡ的研究白凤虎，谢晓美，李德芳，陈安国，唐慧娟，李辉（中国农业科学院麻类研究所，湖南长沙４１０２０５）摘要：红麻处于光合高峰期的成熟叶片中的次生物质含量很高，给ＤＮＡ的提取造成很大的困难。

ＣＴＡＢ法能有效去除多糖杂质，但普通ＣＴＡＢ法用于红麻的ＤＮＡ提取效果很不理想，为使ＣＴＡＢ法能更好地用于红麻的ＤＮＡ提取，我们对此方法进行了改进，通过前处理除去大部分的杂质，减小了后续操作的难度。

为了验证前处理是否会损失ＤＮＡ，研究了液氮研磨对材料细胞的破碎程度问题，还讨论了ＤＮＡ提取中的其它一些相关问题。

关键词：改良ＣＴＡＢ法；去除多糖杂质中图分类号：Ｓ５６３．５文献标志码：Ａ随着分子生物学的发展，ＤＮＡ的提取与纯化成为基因克隆、分子标记等分子生物学研究的重要工作，因此，可以说ＤＮＡ的提取与纯化是分子生物学研究中非常重要也是非常基本的实验操作，ＤＮＡ提取的质量是分子生物学实验成败的关键因素之一。

ＤＮＡ的提取方法有多种（如ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、高盐低ｐＨ法等），实验材料的选取也有多种，我们可以选择更适合的方法，也可以选择更容易成功的实验材料，从实验材料的选取方面入手降低实验的难度，但有时由于实验的需要必须使用那些富含杂质的材料，所以找到一种能够从“困难”植物中获取高质量ＤＮＡ的方法还是必须的。

由于相关实验的需要，必须提取红麻扦插苗的叶片ＤＮＡ，由于其处于光合高峰期，叶片组织细胞中含有大量的多糖、多酚、果胶、单宁等杂质，给基因组ＤＮＡ提取带来了很大的困难，用普通方法很难将这些杂质去除干净，用普通ＣＴＡＢ法提取红麻成熟叶片ＤＮＡ时会有如下现象：６５℃温浴时有褐变现象；氯仿／异戊醇抽提２－３次后所得上清液依然非常粘；所得ＤＮＡ很难用ＴＥ溶解且降解较严重。

CTAB法提取DNA简要步骤

1，取超低温保存的叶片样本，研钵磨碎后加入2.0ml离心管中(加入的叶片粉末量没过2.0ml 离心管的底部的尖端即可)。

2，迅速加入65℃预热过的CTAB 800μl（2%CTAB，使用前加入0.5-1% β-巯基乙醇），混合均匀后放入65℃水浴一小时。

每十分钟摇动一次，使CTAB与叶片样本充分混匀。

3，取出离心管至常温，放置2分钟后加入800μl氯仿/异戊醇（24:1）混合液，将混合液与CTAB混匀后缓缓摇动1-2分钟，使CTAB与氯仿充分接触。

4，12000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清液至新的2.0ml离心管中，再次加入700μl氯仿/异戊醇混合液，缓缓混匀1-2分钟后，再次离心，吸取上清液至1.5ml离心管中。

5，迅速向1.5ml离心管中加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，混匀，-20℃放置2小时左右。

6，将-20℃保存的离心管取出，12000rpm离心5-10分钟，弃去液体，DNA应沉淀在离心管底部。

7，加入1ml 70%乙醇洗涤DNA沉淀（甩一下离心管让DNA沉淀飘起来就行），洗涤两次。

8，将乙醇洗涤过的DNA风干（超净工作台吹一下或者真空浓缩仪）。

9，风干后用50-80μl ddH2O溶解，待用。

本步骤一定不要多加水，SNP需要较高浓度DNA。

改进的CTAB提取植物DNA方法

ｗｈｅａｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００６，１５１：２５１－２６１．
Ｒ，ｅｔａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｔｌａｓ６６・ｌｉｎｅｓｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｉｎ
【８］Ｇｕｏ
Ｐ，Ｂａｉ
Ｇ，ｕ
ｄｅｒｉｖｅｄ
ｗｈｅａｔｎｅａｒ－ｉｓｏｇｅｎｉｃ
ａｌｕｍｉｎｕｍ（ＡＩ）ｔｏｌ・
第９期
李荣华，等：改进这一技术逐步改进，如Ｓａｇｈａｉ—Ｍａｒｏｏｆ等研发出十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法用于提取植物ＤＮＡ”１等，使得ＤＮＡ的提取相对较为快捷，提取的质量提高。近几年来随着我校对实验设备大量投入，一批适合于现代生命科学教学和研究需要的仪器和设备能够满足要求。在众多的ＤＮＡ提取方法中，发现ＣＴＡＢ法是一种较为理想的提取植物ＤＮＡ的方法¨１。根据我院实验室仪器设备的具体情况，我们多次使用ＣＴＡＢ法后发现，这种方法还可以进一步的改进和完善。在多次指导学生开展教学和研究活动过程中，总结出一种适合于我院学生学习和开展研究活动的、操作简便且效果好的ＤＮＡ提取方法，该方法可以使学生在较短时间获得理想的实验效果，除了能直接观察到ＤＮＡ的丝状沉淀外，在琼脂糖电泳中还可确定出所提取ＤＮＡ分子的大小。
离心５ｒａｉｎ，继续提取ＤＮＡ。
０００
ＤＮＡ提取缓冲液
根据ＣＴＡＢ提取ＤＮＡ的原理，配制如表１所示的ＤＮＡ提取缓冲液。需要注意的是，ＣＴＡＢ和Ｂ一巯基乙醇不能进行高温灭菌，因此，在配制提取缓冲液之前应将其他成分进行高温灭菌，之后加入这２项试剂。
表１ＤＮＡ提取缓冲液（１００ｍＬ）的配制成分表
ＤＮＡ。
（１１）此步用于要求较高的科研中。一般来讲，ＲＮＡ不影响ＤＮＡ特性的分析，如想获得不含ＲＮＡ的

CTAB法分离总基因组DNA

实验一CTAB法分离植物总基因组DNA 本方法适用于从一系列的单子叶和双子叶植物中提取总DNA，产率一般为100－200μg/g鲜重组织。

药品试剂――液氮――2×CTAB缓冲液：100mmol/L Tris-HCL pH8.0,1.4mol/L NaCl,20mmol/L EDTA pH8.0, 2%CTAB, 0.7%(v/v) β－巯基乙醇（用前加入）――氯仿／异戊醇（24：1）――RNaseA：取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5),15mmol/L NaCl的溶液中，配成10mg/ml的浓度，100℃热处理15min除去残留的DNase 活性，分装成小份-20℃保存。

――异丙醇Ac――76％乙醇＋10mMNH4――70％乙醇――TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA pH8.0仪器设备――天平――研钵和杵子――离心管――37℃、65℃、水浴――液氮――离心机（转速至少可达5000r）操作程序1、向装有700－800mg磨碎的干燥植物组织（最好是经去淀粉处理）的50ml聚丙烯离心管中加入20ml 65℃预热的1×CTAB提取缓冲液。

轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65℃温育90min，并不时轻轻转动离心管。

或者，将10g经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，在研钵中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至一50ml聚丙烯离心管中，然后加入20－40ml预热至90℃的2×CTAB提取缓冲液。

轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置60－90min。

2、混合物冷至室温后加入等体积的氯仿／异戊醇。

温和摇动15－40min使之充分混合。

室温下5000g离心10－15min分相。

3、将上清（水相）转移至一干净离心管中，加入1／100体积RNase贮液，颠倒混匀，37℃保温30min。

多种.植物总DNA提取方法及详细步骤

植物总DNA提取一、常用方法改良CTAB法（改良自精编分子生物学实验指南，原蓝猪耳实验方案，拟采用）植物基因工程，王关林，2002 SDS法（植物基因工程，王关林，2002）高盐低pH值法（邹喻萍，植物学报，1994）材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。

材料预处理：从野外采集的新鲜叶片若比较衰老，运回后可放在4℃的黑暗中饥饿1～2d，以消耗淀粉和其他多糖。

试剂：(1)2-巯基乙醇（2-ME）(2)CTAB抽提液(3)CTAB/ NaCl溶液(4)24：1（V/V）氯仿/异戊醇(5)CTAB沉淀液(6)高盐TE缓冲液(7)70％乙醇(8)TE缓冲液试剂：(1)2×CTAB提取缓冲液试剂：(1)提取缓冲液：100mmol/LTris·Cl（pH8.0）、50mmol/LEDTA（pH8.0）、500 mmol/LNaCl、10 mmol/L 2-巯基乙醇（2-ME）(2)10% SDS(3)5mol/L KAC试剂：(3)提取缓冲液：100mmol/LNaAC（pH 4.8）、50 mmol/LEDTA（pH 8.0）、500 mmol/LNaCl、1.4％SDS，此种介质刚好为pH 5.5。

(4) 2.5mol/L KAc（pH 4.8）操作：(1)称取样品0.2g，去除表面的DNA污染，置于研钵中与液氮共研成细粉。

(2)将冻粉转入2ml离心管中，立即加入1000µl（980＋20）预热至65℃的CTAB抽提操作：(1)2ml离心管中加入1ml提取缓冲液，65℃预热。

(2)取0.2g新鲜幼嫩叶片，于液氮中迅速研磨成粉。

一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810678971.X(22)申请日 2018.06.27(71)申请人中南大学湘雅二医院地址 410000 湖南省长沙市芙蓉区人民中路139号申请人中南大学(72)发明人申丽　谢志国　曾伟民　周智广　吴学玲　李交昆　余润兰　刘元东　胡芳　王俊俊　邱冠周　(74)专利代理机构长沙朕扬知识产权代理事务所(普通合伙) 43213代理人钱朝辉(51)Int.Cl.C12N 15/10(2006.01)(54)发明名称一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法(57)摘要一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，震荡后超声处理，离心得到含叶际微生物的混合液；(2)向含叶际微生物的混合液再加TENP 溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)向上清液a中加入氯仿与异戊醇，离心得到沉淀b与上清液b；(4)向上清液b 中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。

本发明方法简单、提取率高，具有广阔的市场应用前景。

权利要求书1页说明书7页CN 108866041 A 2018.11.23C N 108866041A1.一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。

实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc

实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc
CTAB法是一种提取植物基因组DNA的标准技术，它是将植物组织或细胞固定剂与有机溶剂混合溶解后，利用高通量PCR技术显微镜适用的植物DNA提取方法，将病毒与细菌遗
传学上的DNA提取技术应用到植物DNA提取上来。

CTAB法的提取策略主要是先收缩细胞壁，然后分解细胞质，使DNA与蛋白质、核酸等其他物质分离。

有两种方法可以用于收缩细胞壁，一种是使用脱水剂，另一种是使用温和
的柱状体破碎物质，这两种方法可以使细胞壁被开裂。

随后，有机溶剂被用来分离DNA，
有机溶剂会与蛋白质和核酸结合，然后消除组织成份，使DNA易于收集。

在有机溶剂洗涤后，用CTAB溶液在冰上半小时沉淀DNA，紧接着用脱盐水冲洗，最后用70%的乙醇对DNA
进行沉淀。

最后，DNA可以被收集，净化，脱水或冻存，随时可用。

此外，为了获得精确的结果，在使用CTAB法提取植物基因组DNA时也有一些需要考
虑的因素，其中包括样本所处的第一步，样品消毒，采取合适的收缩细胞壁和有机溶剂剂量，CTAB溶液沉淀时间，脱盐水洗涤次数，乙醇沉淀次数，DNA注射缓冲液等，如果这些
步骤都能得到恰当的处理，则可以保证获得的 DNA 极为纯净。

为了提高植物DNA提取效率，CTAB法在提取植物基因组DNA时也可以使用DNA限制酶，例如酸性磷酸酶和热胡萝卜素变性酶之类的酶，这种方法可以使细胞壁更易被分解，从而
使DNA更容易被收集。

总而言之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种比较有效的方法，能够获得更高质量的DNA，但是在使用这种技术提取植物DNA时，需要注意一些关键的步骤及酶的使用，以确
保获得的DNA有较高的纯度。

不同方法对石榴叶片DNA提取效果的影响

第39卷　第2期河南农业大学学报V ol.39　N o.22005年 6月Journal of Henan Agricultural UniversityJun. 2005文章编号:1000-2340(2005)02-0182-05收稿日期:2005-03-08基金项目:河南省科技攻关项目(0422050013)作者简介:陈延惠(1963-),女,河南南阳人,副教授,硕士,主要从事果树遗传育种和教学工作1通讯作者:朱道圩.不同方法对石榴叶片D NA 提取效果的影响陈延惠1,张四普1,胡青霞1,栗　燕1,阿依古丽・喀斯木2,朱道圩1(11河南农业大学林学园艺学院,河南郑州,450002;21新疆阿克苏职业技术学院,新疆阿克苏843000)摘要:以4个石榴(Punica granatum L 1)品种为实验材料,用S DS Ⅰ,S DS Ⅱ,CT AB Ⅰ,CT AB Ⅱ4种方法提取石榴叶片DNA 1结果表明,S DS 法提取得率为500～600μg ・g -1,但OD 值偏低,为1150～1170;RAPD 分析无扩增;CT AB 法所得DNA 得率为200～500μg ・g -1,OD 值为1180～1190;RAPD 分析扩增带清晰1CT AB Ⅰ和CT AB Ⅱ相比,操作简单、省时,得率高,综合考虑CT AB Ⅰ是石榴叶片DNA 提取的最佳方法1关键词:石榴;DNA ;CT AB ;S DS中图分类号:S 66514 文献标识码:AStudy on the E ffects of Different Methods on Punica granatum L 1DNA Extraction from LeavesCHE N Y an 2hui 1,ZH ANG Si 2pu 1,H U Qing 2xia 1,LI Y an 1,Ayiguli K asimu 2,ZH U Dao 2yu 1(11C ollege of F orestry and H oticulture ,Henan Agricultural University ,Zhengzhou 450002,China ;21Akesu V oca 2tional and T echnical C ollege ,Akesu 843000,China )Abstract :4methods were tested to extract Punica granatum DNA from leaves using 4cultivars as material 1The resultsshowed that S DS methods had a higher extraction rate of 500～600μg ・g -1,but a lower OD value of 1150～1170with 2out am plifying bands for RAPD analysis.The extraction rate was 200～500μg ・g -1of CT AB methods higher ,OD valuewas 1180～1190with clear am plifying bands for RAPD analysis 1C om pared with CT AB Ⅱ,CT AB Ⅰwas sim pler ,time saving and had higher extraction rate.All things considered CT AB Ⅰwas the best method for extracting Punica grana 2tum L.DNA from leaves 1K ey w ords :punica granatum L.;DNA ;CT AB ;S DS 石榴(Punica granatum L 1)为石榴科石榴属植物,作为栽培的只有一个种,即石榴1目前石榴的科研工作还比较薄弱,各地品种混杂,同物异名、同名异物现象十分严重[1],给生产和科研带来极大的不便,所以对各地品种进行系统分类鉴定有很大的生产和科研价值1传统的鉴定方法如形态鉴定、花粉鉴定、同工酶鉴定等都有一定的局限性[2],随着分子生物学的发展,从DNA 水平上进行分子鉴定显示出巨大的优越性1石榴是多年生果树,育种周期较长,从DNA 水平上进行遗传标记的分析研究,可以对遗传性状进行预先选择,缩短育种年限1而这些工作的前提是提取高质量的DNA 1DNA 的提取方法[3～16]在苹果和梨、桃等方面研究较多,石榴DNA 的提取方法研究目前还少见报道,作者对此进行了初步的探讨研究11　材料和方法111　材料试验材料分别来源于四川攀枝花市农科所、云南会理、山东果树研究所、陕西石榴研究所等,选择‘青皮软籽’、‘甜绿子’、‘泰山红’、‘净皮甜’石榴品种为试验材料1第2期陈延惠等:不同方法对石榴叶片DNA提取效果的影响183 112　仪器与设备 Hettich D278532低温高速离心机,Bekaman核酸蛋白分析仪,DYY28B型电泳仪等,由河南省农科院分子生物学重点试验室提供1113　试剂 (1)2×CT A B缓冲液:100mm ol・L-1T ris2HCl(pH810),114m ol・L-1NaCl,80mm ol・L-1E DT A,质量分数为2%CT A B,体积分数为2%BME;(2)CT A B沉淀缓冲液:50mm ol・L-1T ris2HCl(pH810),10mm ol・L-1E DT A(pH 810),质量分数为1%CT A B(3)质量分数为10%CT A B/NaCl:质量分数为10%CT A B,017m ol・L-1NaCl;(4)高盐TE缓冲液:10mm ol・L-1T ris2HCl(pH810),011mm ol・L-1E DT A(pH810),1m ol・L-1NaCl;(5)TE缓冲液:10 mm ol・L-1T ris2HCl(pH810),011mm ol・L-1E DT A;(6)S DS提取缓冲液:10mm ol・L-1T ris2HCl(pH810),100 mm ol・L-1NaCl,50mm ol・L-1E DT A(pH810),质量分数为2%S DS,体积分数为2%BME;(7)RnaseA贮液:10 mg・m L-1;(购于上海生工生物工程公司)(8)5m ol・L-1K AC;(9)液氮;(10)V(氯仿):V(异戊醇)=24:1;(11) 3m ol・L-1NaAC(pH512);(12)异丙醇;(13)V(苯酚):V(氯仿)=1:1;(14)琼脂糖、T aq酶及引物S473 (GG AG TG CCT C)(购于上海生物工程公司)(15)体积分数为70%乙醇;(16)无水乙醇1114　DNA的提取方法11411　DNA的提取和纯化　取2g石榴叶片放入预冷的研钵中,加入适量石英砂,液氮快速研磨成粉末1在粉末融化之前分装于4支115m L离心管中,立即分别加入65℃预热的4种提取缓冲液1其中2管分别加入500μL2×CT AB提取缓冲液,管上分别标记CT ABⅠ,CT ABⅡ1另2管分别加入500μL S DS提取缓冲液,管上分别标记S DSⅠ,S DSⅡ,轻轻震荡几下,使粉末均匀分布在提取液中,放入水浴锅65℃水浴1CT AB 法保温1h,S DS法保温30min,其间混匀几次1然后按以下方法分别提取、纯化11141111　S DSⅠ法　(1)加入等体积V(氯仿):V(异戊醇)=24:1,12000r・min-1,4℃条件下,离心10min,抽提两次1(2)取上清,加入2/3体积冷异丙醇(-20℃),室温沉淀30min1(3)10000r・min-1,4℃条件下离心10min,沉淀分别用体积分数为70%乙醇和无水乙醇各清洗1次,放在超净工作台上吹干1(4)沉淀溶于适量高盐TE中,如不能完全溶解,65℃水浴10min1(5)加入2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀30min1 (6)勾出DNA沉淀,放在超净工作台上吹干沉淀11141112　S DSⅡ法　(1)加入1/3体积冷K AC溶液,立即冰上放置30min1(2)12000r・min-1,4℃条件下,离心10min,取上清,加入等体积的V(氯仿):V(异戊醇)=24:1,12000r・min-1,4℃条件下,抽提2次1 (3)加入2/3体积(-20℃)冷异丙醇,室温沉淀30min,10000r・min-1,4℃条件下,离心10min,沉淀分别用体积分数为70%乙醇和无水乙醇各清洗1次,放在超净工作台上吹干11141113　CT ABⅠ法　(1)加入等体积V(氯仿):V(异戊醇)=24:1,12000r・min-1,4℃条件下,离心10 min,抽提2次1(2)取上清,加入2/3体积-20℃冷异丙醇,室温沉淀30min1(3)10000r・min-1,4℃条件下,离心10min,分别用体积分数为70%乙醇和无水乙醇清洗1次1(4)放在超净工作台上吹干沉淀1 1141114　CT ABⅡ　(1)加入等体积V(氯仿):V(异戊醇)=24:1,12000r・min-1,4℃条件下,离心10min 抽提2次1(2)取上清,加入1/10体积65℃预热的质量分数为10%CT AB/NaCl溶液,加入等体积V(氯仿):V(异戊醇)=24:1抽提1次1(3)重复步骤(2),吸上清加入等体积CT AB沉淀液,65℃,水浴30min1 (4)用适量高盐TE溶解沉淀,65℃,水浴30min1(5)加入2/3体积-20℃冷异丙醇,混匀后10000r・min-1,4℃条件下,离心10min1(6)加入体积分数为70%乙醇和无水乙醇各清洗沉淀1次,在超净工作台上吹干1以上各方法所得4种D N A分别溶于100μL TE中,各加入3μL R NaseA,37℃保温30m in1加入200μL TE,加入等体积V(氯仿):V(异戊醇)=24:1,10000r・m in-1,4℃条件下,离心10m in1取上清,各加入1/10体积冷NaAc,再加入2倍体积无水乙醇,-20℃沉淀30m in,用枪头勾出沉淀,用体积分数为70%乙醇和无水乙醇各清洗1次,超净工作台吹干,溶于100μL TE中,-20℃长期保存1统计时取4次试验结果的平均值.11412　DNA的检测方法1141211　DNA的纯度和得率检测　4种方法所得DNA用核酸蛋白分析仪进行测定,取1μL DNA溶液,用TE稀释50倍,TE作为空白对照,测得相应的OD值,若OD值介于118～210,则DNA纯度较好,有DNA得率/(μg・g-1)=A260×50×稀释倍数/叶片质量1 184河　南　农　业　大　学　学　报第39卷1141212　DNA 的电泳检测　取3～5μL DNA 混合1/10loading bu ffer 点样,琼脂糖质量分数1%,电解缓冲液为lXT AE ,琼脂加热后冷却到50～60℃时加入3μL E B ,电压为96V ,电泳大约1h 后,在紫外凝胶成像系统下观察摄像,并检测其分子量11141213　RAPD 检测　RAPD 反应条件为:94℃预变性4min ;94℃变性1min ,37℃退火1min ,72℃延伸2min ,共45个循环,72℃总延伸7min ;RAPD 反应体系为:反应体系为25μL ,内含:模板DNA (60ng ・μL -1)1μL ,引物S 4731μL ,10×Reaction Bu ffer 215μL ,dNTP 混合液2μL ,T aq 酶012μL ,ddH 201813μL 111413　比较不同E DT A 浓度的提取效果　分别用20,30,50,80mm ol ・L -1E DT A 浓度比较提取效果,DNA 的点样量为2μL 111414　比较不同取材时期对DNA 的提取效果　用CT AB Ⅰ法对甜绿籽扦插幼叶和大田幼叶提取效果进行比较,以研究本试验是否受材料来源和生长季节的限制12　结果与分析211　不同方法对石榴叶片DNA 提取纯度与得率的影响 4种方法所得DNA 分别在核酸蛋白分析仪进行测定(表1).由表1可以看出,S DS Ⅰ和S DS Ⅱ法DNA 提取产率相对较高,但OD 值偏低,杂质太多1CT AB Ⅰ和CT AB Ⅱ提取DNA 及OD 值适中,但CT AB Ⅱ法得率较低,程序复杂,费时太长1相对CT AB Ⅱ法,CT AB Ⅰ操作简单省时,质量较高1表1　不同提取方法所得DNA 样品的测定结果T able 1　T esting results of DNAs extracted by different w ays品　种Caltivar方　法M ethodA 260A 280A 260/A 280得率/(μg ・g -1)Extraction rate 泰山红S DS Ⅰ214511551158611T aishanhongS DS Ⅱ210411251163510CT AB Ⅰ119811091182495CT AB Ⅱ019101491186225青皮软籽S DS Ⅰ213811491159595QingpiruanziS DS Ⅱ210611271162515CT AB Ⅰ118911031182472CT AB Ⅱ019201501184230甜绿籽S DS Ⅰ214111531157602T ianl üziS DS Ⅱ211011271165525CT AB Ⅰ119411061183485CT AB Ⅱ019701521186242净皮甜S DS Ⅰ213611471160570JingpitianS DS Ⅱ211211281165530CT AB Ⅰ119611081181490CT AB Ⅱ019401501184235212　DNA 的电泳图谱鉴定4种方法所得DNA 纯度与得率见表1,从表1可以看出CT AB Ⅰ和CT AB Ⅱ2种方法所得DNA 电泳条带清晰,S DS Ⅰ和S DS Ⅱ法所得DNA 电泳条带有拖尾现象,点样孔有少量DNA 不易跑出,可能是DNA 中接合太多多糖的缘故1电泳点样量为3μL 从电泳结果(图1)看出,石榴DNA 分子量大约为23kb 1213　PCR 2RAPD 电泳图谱 S DS Ⅰ和S DS Ⅱ方法所得DNA 无扩增带,CT AB Ⅰ和CT AB Ⅱ方法所得DNA 扩增带清晰,且重复性较强,能做进一步分析研究(图2)1214　不同浓度E DTA 对提取效果的影响采用CT AB Ⅰ方法,对不同E D 2T A 浓度的提取结果进行比较,点样量为2μL ,80mm ol ・L -1E DT A 得率最高(图3),可能是高浓度E DT A 螯合了大量游离的金属离子,抑制了DNA 酶活性,保护DNA 不被内源核酸酶降解1表2　甜绿子扦插与大田幼叶提取效果比较T able 2　Comp arison betw een DNAs extracted fromcutting and growing leaves 材　料M aterialsA 260A 280A 260/A 280得率/(μg ・g -1)Extraction rate扦插幼叶Cutting leares119811091181495大田幼叶G rowing leaves1151018431179375215　不同取材时期和大田幼叶提取DNA 效果比较表2可以看出扦插幼叶从纯度和得率两方面都比大田幼叶高,同时也可以看出,二者所提取DNA 基本都能满足实验的要求,所以本实验可以不受季节的限制1第2期陈延惠等:不同方法对石榴叶片DNA 提取效果的影响185M 为DNA 标准,1,2,3,4对应E DT A 浓度分别为20,30,50,80mm ol ・L -11M 为DNA M arker ,1,2,3,4were DNAs extracted with 20,30,50,80mm ol ・L -1E DT A 1图3　E DTA 浓度对净皮甜DNA 提取效果影响Fig 13　E lectrophoresis of Jingpitian DNAs with different E DTA concentration3　小结和讨论1)4种提取方法中,S DS 法DNA 得率较高,但OD 值太低,杂质太多,RAPD 分析无扩增带1CT AB 法提取DNA 且OD 值适中,RAPD 扩增带清晰1其中CT AB Ⅱ操作烦琐,费时较长,得率太低,相比而言,CT AB Ⅰ简单省时,得率较高,综合考虑,CT AB Ⅰ法是提取石榴叶片DNA 的最佳方法1通过进一步实验表明,当E DT A 浓度为80mm ol ・L -1时,DNA 得率最高,取材可以不受季节的限制12)石榴叶片中含有大量的多糖、色素、酚类物质,CT AB 和S DS 都可以破坏植物细胞核膜,以利于核DNA 的释放1用抗氧化剂β2巯基乙醇和PVP (聚乙烯吡咯烷酮)有明显地去除色素、防止褐变的作用,比单独使用其中一种效果明显1另外,PVP 还有一定去除多糖的作用1本实验在提取过程中应注意以下2方面的问题:1)研磨时加入适量的石英砂,能充分破坏细胞壁,提高得率1木本植物细胞壁较厚,如果研磨不充分,影响DNA 的得率;2)在DNA 提取过程中,尽可能简化操作步骤,中间步骤越多,对DNA 损失越大,得率就越小1参考文献:[1]　柏永耀,党贵霞1石榴栽培新技术[M]1北京:中国农业出版社,19971[2]　王万双,罗正荣,蔡礼鸿1柿品种鉴定及分类研究进展[J ]1园艺学报,1998,25(1):44-501[3]　马兵钢,赵宗胜,冯建荣,等1梨属DNA 提纯方法的比较研究[J ]1石河子大学学报(自然科学版),2000,2(4):277-2811[4]　陈万秋,李思光,罗玉萍,等1猕猴桃模板DNA 的提取及RAPD -PCR 最佳反应体系的建立[J ]1生物技术通报,2003(3):40-431[5]　WI LLI AM S J G,K UBE LIK A R ,LI VAK K K et al 1DNA polym orephism am plified by arbitary primers are useful genetic marks[J ]1Nucleic Acid Res ,1990,18:6531～65351 186河　南　农　业　大　学　学　报第39卷[6]　赵　华,王富德,张世苹1提取、纯化植物DNA方法的比较[J]1国外农学—杂粮作物,1998,18(2):35-381[7]　C 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CTAB法提取植物总DNA

CTAB法提取植物总DNA
实验原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。

实验步骤
1. 取1-50g新鲜植物材料，于液氮中研成粉。

2. 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积(w/v) 2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。

3. 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min 离心10-20分钟。

4. 将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min 离心10分钟。

5. 将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。

6. 3500-4000r/min 离心5-10分钟，去上清液, 70%乙醇漂洗，沉淀吹干。

7. 风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

8. 取2ul溶液电泳检测。

注意事项
所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

一种适用于动物与植物总DNA提取的方法_改良CTAB法

p lant. [Method ] The genom ic DNA s were extracted from tender leaves of 24 peanut cultivars and from the liver, lung and kidney of white mouse through the specifically modified CTAB method. The DNA s were run on agarose gel, next detected by DNA / Protein analyzer. Finally PCR amp li2 fication was conducted to detect the quality of DNA s extracted using the modified CTAB method. [ Result] The clear and orderly bands were ob2 served in gel detection, and the values of OD260 /OD280 for DNA s extracted via modified CTAB method were between 1. 77 - 1. 83. The DNA s per2 formed well in PCR amp lification. [ Conclusion ] The DNA s extracted by modified CTAB method could satisfy the requirement of PCR amp lifica2
(21) : 6576 - 6582.
[ 6 ] DR IZO A, FROST C A, SM ITH K A, et al. Phosphate and ammonium re2

改良CTAB法提取番石榴叶片总DNA

改良CTAB法提取番石榴叶片总DNA王家保;杜中军;雷新涛;徐碧玉【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2006(017)005【摘要】目的:从番石榴叶片中快速提取高质量的总DNA.方法:改良CTAB法.主要改进之处在于不用液氮,而是直接研磨硅胶干燥样品;用高浓度CTAB、低浓度乙醇与NaCl盐析相结合等方法去除多糖.结果:应用改良后的方法可以快速提取番石榴叶片总DNA,有效去除组织中的多糖、蛋白质,抑制提取过程中的组织褐变.提取的DNA可用于限制性内切酶酶切和PCR扩增.结论:传统CTAB法经过改良,可用于快速提取番石榴高质量DNA.【总页数】3页(P757-759)【作者】王家保;杜中军;雷新涛;徐碧玉【作者单位】中国热带农业科学院,热带生物技术研究所,热带作物生物技术国家重点实验室,海南,海口,571101;中国热带农业科学院,热带生物技术研究所,热带作物生物技术国家重点实验室,海南,海口,571101;中国热带农业科学院,南亚热带作物研究所,广东,湛江,524091;中国热带农业科学院,热带生物技术研究所,热带作物生物技术国家重点实验室,海南,海口,571101【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.改良CTAB法提取油用向日葵成熟叶片的总RNA [J],2.改良CTAB法提取大戟属药用植物叶片总DNA试验 [J], 魏胜华;孟娜3.改良CTAB法提取柚总DNA及叶片保存方法的研究 [J], 潘一山;朱旸;黄秋金4.改良CTAB法提取番石榴总DNA的初步研究 [J], 赵志常;陈业渊;高爱平;罗石荣;黄建峰5.杜鹃花叶片总RNA的改良CTAB法提取 [J], 郭秀莲;张正银;田萍;罗绍银;白洁;庄平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

2×CTAB法植物总DNA提取

2×CTAB法植物总DNA提取1. 液氮研磨1g左右的植物组织，转移到离心管中。

改用研磨枪在冰上研磨，不加β-巯基乙醇研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。

若CTAB准备2-3天内用完，则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。

2. 加入500µl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h 小时,其间要上下颠倒混匀数次。

3.取出离心管，加入等体积的24：1（三氯甲烷：异戊醇），上下颠倒充分混合。

若量多，则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。

4.12000转速离心5-10min。

将离心管动作轻缓的取出转子，放置于离心管架上。

a.离心后溶液分三层：上层为水相；中层为碎片和蛋白相；底层为氯仿b.迅速进入下一步，以免各相混合5.用移液枪吸取管中上层水相，动作一定要轻缓，不可搅动其它两层。

a.此步骤要宁舍不贪多，尽量避免吸取到下层液体。

b.若上步骤中中间层较厚，则继续加入等体积24：1，再次抽提一次，直至中间层较薄。

6.在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇（4℃预冷），轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。

沉淀至少15分钟至过夜。

6-1 在抽提出的水相中加入1/10体积醋酸钠（pH5.2, 3M），混匀后，加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15min至过夜。

6-3. 在抽提出的水相中加入加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀15分钟至过夜。

a.时间越长，DNA的产量越多，污染也越多7. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，加入700µl 70%的酒精，上下颠倒数次，洗涤沉淀。

12000转离心5-10m，去上清，倒置于吸水纸上数分钟。

重复一遍。

8. 12000转速离心5-10min，去上清，倒置于吸水纸上数分钟，最后置于超净工作台中吹干。

9. 在离心管中加入30-50µl的灭菌去离子水或者TE溶液，4℃放置数小时，使其充分溶解。

CTAB法提取细菌Total_DNA原理

CTAB法提取细菌Total DNA原理CTAB法原理CTAB(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

阳离子表面活性剂，呈白色或浅黄色结晶体至粉末状。

易溶于异丙醇，可溶于水，熔于热水、乙醇、三氯甲烷，微溶于丙酮，不溶于醚和苯。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解于液相；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除；PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

1.用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点:有效变性蛋白质；抑制了DNase的降解作用。

缺点：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA；不能完全抑制RNase的活性。

2.氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡；降低表面张力，从而减少气泡产生；另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。