植物组织中过氧化物酶活性的测定
植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
实验七植物组织内过氧化物酶(POD)活性的测定
一、实验目的
掌握植物组织内过氧化物酶活性测定的原理和方法。
二、实验原理
过氧化物酶广泛存在于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶可以使愈创木酚氧化，产生茶褐色物质，在470nm处有最大吸收峰，可根据单位时间内A470的变化值，计算POD活性大小。
三、实验材料与设备
1．实验设备与仪器
电子天平、冰冻高速离心机、可见光分光光度计、电动玻璃匀浆剂等。
2．实验材料与试剂
20mM KH2PO4，
100mM PBS：取0.2M Na2HPO4，87.7ml与0.2MNaH2PO4，12.3ml混合。
反应液：取100mM PBS 50ml，加入愈创木酚28μl，搅拌溶解，待溶液冷却后加入30%的H2O219μl，混合均匀保存于冰箱中备用。
四、实验步骤
1．酶液制备
取1.0g植物叶片剪碎，置入玻璃匀浆杯中，加入预冷的20mM KH2PO45ml进行冰浴研磨提取。匀浆液低温离心8500rpm 15min，上清液为酶粗提液，定容到50ml供测定。
2．酶活性测定
取光程为1cm的玻璃比色杯2只，一只加入反应液3ml，20mMKH2PO41ml作为调零管。另一只加入反应液3ml，提取的酶液1ml，立即开始计时，在470nm波长处进行比色，开始记录数据，然后每隔一分钟记录一次吸光度值，共测3min。3．计算
以每分钟A470的化变值0.01为一个相对酶活单位，计算植物组织内过氧化物酶酶活力的大小（单位：U/g鲜重）。
过氧化物酶活性的测定实验报告
过氧化物酶活性的测定实验报告实验名称：过氧化物酶活性的测定实验
实验目的：
1. 了解过氧化物酶（CAT）的性质及其在生物体内的作用；
2. 学习如何测定CAT活性。
实验原理：
CAT是一种重要的氧化酶，在生物体内主要负责清除细胞内的
过氧化氢（H2O2）。CAT能够将H2O2分解为水和氧，从而减少
H2O2引起的细胞损伤。因此，CAT的活性是衡量生物体抵抗氧
化损伤能力的重要指标。该实验通过比色法对CAT活性进行测定，其原理是：CAT能够快速分解H2O2，导致溶液中H2O2浓度的降低，从而使紫外吸收波长为240nm处的吸光度降低。
实验步骤：
1.制备1mg/ml的CAT标准溶液；
2.制备一定浓度的H2O2溶液；
3.将CAT标准溶液和H2O2溶液分别稀释为不同浓度；
4.将待测样品（如动物组织、血清等）加入混合液中，使得
CAT参与H2O2的分解反应；
5.反应10min后，加入硫酸铨（K2Cr2O7）溶液并混匀，其中
硫酸铨是一种催化剂，能够加速反应速度；
6.反应后，在240nm处测定溶液的吸光度；
7.根据不同CAT标准溶液的吸光度值，绘制标准曲线；
8.根据待测样品的吸光度值，利用标准曲线计算出CAT的活性。
实验结果：
利用如上实验步骤，我们测得样品A的吸光度为0.56，样品B
的吸光度为0.36，样品C的吸光度为0.22。依据标准曲线的测定
结果，我们可分别计算出样品A、B、C的CAT活性分别为12.3、8.4、5.2 U/g。
实验结论：
本实验采用比色法测定了不同样品中CAT的活性。结果表明，样品A的CAT活性最高，样品C的CAT活性最低。通过该实验，我们可以了解CAT的性质及其在生物体内的作用，同时也掌握CAT活性的测定方法。
植物组织SOD活性测定
植物组织SOD 活性测定
一、实验目的
1、了解还原法测定抗氧化酶活性的原理与方法。
2、熟悉植物叶片ROS 清除机制。 二、实验原理
植物在受到光、温度、干旱、盐、碱等胁迫时会产生活性氧和自由基，而活性氧和自由基会抑制植物生长、损伤细胞结构和功能、使膜脂过氧化、破坏生物大分子的结构功能等。植物本身也会抵抗这种逆境，其自身的酶系统和非酶系统会产生相应的物质以清除活性氧和自由基，酶系统：超氧化物歧化酶（SOD ），超氧化物酶（POD ），过氧化氢酶（CAT ），抗坏血酸过氧化物酶（APX ）；非酶系统：维生素系列（Vce ），谷胱甘肽（GSH ）。
核黄素在照光条件下会将氧气还原为超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT 作用会产生蓝色的甲䐶，而SOD 会抑制超氧阴离子自由基与NBT 的反应。
三、材料
未处理的小麦叶片；0℃处理小麦叶片3-5min 。 四、试验步骤
1、酶液提取：称量小麦叶片（ck 、0℃）各0.5g ，预冷研钵，加2ml 预冷提取介质（磷酸缓冲液），冰态研匀浆，介质冲洗研钵2-3次，定容10ml 。取5ml ，两管平衡（0.01g ），对角线放置，4℃离心10min ，取上清液（粗酶液）。
2、显色反应
取4支专用试管，按下表加入
试剂 1（As1） 2（As2） 3（照光） 4（不照光，调零）
buffer
1.5
1.5
1.5
1.5
O
H O H O O H O H O H OH O H O O POD CAT SOD
2222
2222
2222−−→←+−−→−→→→•−−−→−•-
met 0.3 0.3 0.3 0.3 NBT 0.3 0.3 0.3 0.3 EDTA-Na 2 0.3 0.3 0.3 0.3 20uml 核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 ddH 2O
实验五_过氧化物酶酶活性的测定
实验五_过氧化物酶酶活性的测定
一、实验原理
1. 过氧化物酶（POD）在植物生长过程中发挥重要作用。在压力、紫外线辐射、微生物侵入和病原体感染等外界刺激下，植物组织中的过氧化物酶活性会显著增加，以保护植物免遭伤害。
2. 过氧化物酶是一种氧化酶，催化产生氧气的反应（如下）：
ROOR′+ 酶———> R′OH + O2
3. 过氧化物酶活性的测定实验基于上述反应，利用巴尔的显色方法测定过氧化物酶催化下的氧化反应速率。
二、实验步骤
1. 将100mL的3% H2O2（v/v）制成浓度为60mmol/L的过氧化氢溶液。
2. 按0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL 5个等份，取出浓度分别为6、12、18、24、30mmol/L的H2O2溶液，放入5个试管中。
4. 将1mL的20mg/mL酶溶液加入中等浓度（12mmol/L）的H2O2溶液中，混合均匀。缓慢倾斜试管，使溶液彻底混合。
5. 取出一根手指，将其浸泡于硫酸铁铵溶液中。将试管倾斜，瓶口与硫酸铁铵溶液接触，放入深100°C的水浴中加热2min。将溶液混合均匀。
6. 将试管移出水浴，冷却到室温后，再加入1mL的硼酸缓冲液，混合均匀。
7. 测定吸收值（深紫色的铁化合物阴离子形成）。利用光度计在546nm处测量。
8. 按照如上步骤分别测定不同浓度下的H2O2溶液。
三、结果分析
1. 计算各试管中产生的氧气量，并绘制曲线（以5mmol/L，10mmol/L，15mmol/L，20mmol/L，25mmol/L的浓度为横坐标）。
2. 计算过氧化物酶活性（OD/min/mg）。
实验过氧化物酶活性的测定
试剂应存放在阴凉、干燥的地 方，避免阳光直射和污染。
实验器具的清洗与消毒
01
使用前，将实验器具清洗干净， 确保无残留物。
02
采用高压蒸汽灭菌法或干热法对 实验器具进行消毒，确保无菌操 作。
04
实验操作过程与结果分析
实验操作步骤与注意事项
准备实验材料
过氧化物酶溶液、底物 溶液、缓冲液等。
设置对照组
实验结果的分析与解释
结果分析
根据实验数据，分析过氧化物酶的活性变化，判断酶活性的 高低。
结果解释
结合实验结果，解释过氧化物酶活性变化的原因，分析可能 的影响因素。
05
实验误差来源与控制措施
实验误差来源的分析
操作误差
环境误差
实验过程中，由于操作不当或技能不 熟练导致的误差。
实验环境温度、湿度、光照等因素对 实验结果的影响。
实验结果的解释与应用
解释
过氧化物酶是一种重要的生物催化剂，在许多生物化学反应中发挥着关键作用。实验结果表明，该酶具有较高的 活性，这为其在生物医学、农业和工业等领域的应用提供了重要依据。
应用
过氧化物酶可用于治疗某些疾病、催化有机合成反应以及作为生物传感器等。此外，在农业方面，过氧化物酶还 可用于提高作物的抗逆性和产量。
过氧化物酶通过催化过氧化氢等氧化 剂与底物的氧化反应，发挥其生物催 化作用。
POD 测定方法
植物体POD的测定
※<原理>
了解过氧化氢酶活性测定的几种方法，掌握用愈创木酚法分别测定过氧化氢酶和过氧化物酶的活性。
过氧化物酶广泛颁布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。
※<实验材料、试剂与仪器设备>
1、实验仪器722型分光光度计、离心机、秒表、电子天平、研钵
2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液［100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，加入愈创木酚28uL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存于冰箱中］
3、实验材料任何植物材料
※<实验步骤>
1、粗酶液的提取称取植物(小麦叶片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO4 5mL，于研钵中研磨成匀浆，以10000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并两次上清液。
2、酶活性的测定取比色皿2只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另一只中加入反应混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性过高可适当稀释)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔30s读数一次。以每分钟表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白质表示，蛋白质含量测定按Folin法进行。
※<结果计算>
实验植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
实验40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测
定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性及植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
一、过氧化氢含量的测定
【原理】
H2O2及硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅及H2O2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸
馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料及提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol 硫酸5ml，待完全溶解后，及标准曲线同样的方法定容并比色。
实验五 植物组织中SOD活性测定
实验五SOD活性的测定
一、实验目的
学习并掌握氮蓝四唑（NBT）法测定植物体内超氧化物歧化酶（SOD）活性的基本原理和操作方法。
二、实验原理
超氧物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。测定SOD活性的方法很多，简便且常用的是NBT(氮蓝四唑)光还原法。该方法的原理是超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。当反应体系中有可被氧化的物质存在时，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生氧气，氧气被单电子还原产生氧自由基，氧自由基则可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除氧自由基，当反应体系中有SOD存在时可抑制NBT的还原，于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。因此可通过测定A560来计算SOD的活性，以抑制NBT 光还原反应50%所需的酶量为一个酶活性单位。
三、实验材料、试剂与仪器
1.实验材料：小白菜叶片。
2.实验试剂：
（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；
（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml；
（3）750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；
（4）100μmol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；
（5）20μmol/L核黄素溶液：100μmol/L核黄素溶液稀释5倍即实验所需的20μmol/L核黄素溶液；
植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法)说明书
检测试剂盒(愈创木酚比色法)说明书
4ml预冷的PODLysisBuffer研磨或匀浆，4 POD粗提液，-20℃冻存，用于过氧化物酶的
A测定0=加入PODAssaybuffer工作液后立即测定的测定孔吸光度值t=反应时间(min)=3
注意事项：
1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、POD酶液提取时注意低温操作，防止酶活性。
3、以煮沸的酶液为对照时，酶要充分失活。
4、POD氧化剂和POD终止液具有一定腐蚀性，请小心操作。
5、POD氧化剂易挥发，请密闭保存，否则检测效率下降。
6、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定，每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
实验：POD
• 比耳定律： • T=I/I0 ；LogI0 /I=KCL；A=KCL
• 其中：T透射比； I0 入射光强度；I透射比 强度；A吸收比；K吸收系数；C溶液的浓 度；L 溶液的光径长度。
• 安装使用： • 1、使用仪器前，使用者应该首先了解本仪 器的结构和工作原理；以及各个操作旋钮 的功能。在未接通电源前，应该对仪器进 行检查，电源线接线应牢固。通地要良好， 各个调节旋钮的起始位置应正确，然后再 接通电源开关。 • 仪器经过运输和搬运等原因，会影响波 长精度，吸收比精度，请根据仪器调校步 骤进行调整，然后投入使用。
• 注意事项： • 1、如果大幅度改变测试波长时，在调整 “0”和“100%”后稍等片刻，当稳定后，再 重新调整。 • 2、每台仪器所配套的比色皿，不能与其他 仪器上的比色皿单个调换。 • 3、禁止光路中无测试样品，而直接透视； 避免开盖时打开光路。 • 4、比色皿的类型要与波长相一致。
分光光度计
=
.
△OD值 · V1
.
• 0.01· W· t· V2 • 式中： 为反应时间内吸光度的变化；W为马铃薯 鲜重g；t为反应时间min； V1 为提取酶液总体积 ml；V2 为测定时取用酶液体积ml。
六、结果分析
722型分光光度计
• 分光光度计广泛应用于医药卫生、临床检验、 生物化学、石油化工、环境保护、质量控制等部 门，可在不同光谱区内对物质作定性和定量的分 析，是理化实验室常用分析仪器之一。 • 分光光度计的工作原理是溶液中的物质在光 的照射激发下，产生了对光吸收的效应，物质对 光的吸收是具有选择性的。各种不同的物质都具 有其各自的吸收光谱，因此当某种单色光通过溶 液时，其能量就会被吸收而减弱，光能减弱的程 度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于 比色原理------比耳定律
（完整版）逆境生理指标的测定
（完整版）逆境生理指标的测定
逆境生理指标的测定
要求：选三个指标
一、植物组织中超氧物歧化酶活性的测定
催化下列反应：2 +2H + → H 2O 2 + O 2 反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
原理
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计
算出酶活性大小。
试剂
0.05mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）；
130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称1.9399g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml ；
750μmol/L 氮蓝四唑溶液：称取0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；100μmol/L EDTA-Na 2溶液：取0.03721g EDTA -Na 2用磷酸缓冲液定容至100ml ；
20μmol/L 核黄素溶液：取0.00753g 核黄素用磷酸缓冲液定容至1000ml 避光保存(当天配制)。
方法
1、酶液提取取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加1ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml 。取2~3ml 于10000rpm 下离心10分钟，上清液即
植物生理指标测定
(3)冰醋酸。
(4)甲苯。
三、实验步骤
1.标准曲线的绘制
(1)在分析天平上精确称取25 mg脯氨酸，倒人小烧杯内,用少量蒸馏水溶解，然后倒人250 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。
(2)系列脯氨酸浓度的配制。取6个50mL容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5 mL、1.0mL、1.5 mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1 ug/mL、2 ug/mL、3 ug/mL、4 ug/mL、5 ug/mL及6ug/mL。
二、材料、仪器设备及试剂
(一)材料
新鲜的植物叶片。
(二)仪器设备
分光光度计，水浴锅，刻度试管，刻度吸管。
(三)试剂
(1) 90%苯酚溶液：取90g苯酚(AR),加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。
(2) 9%苯酚溶液。取3 ml 90%苯酚溶液，加蒸馏水至30 ml,现配现用。
(3)浓硫酸(比重1.84)。
实验22过氧化物酶活性的测定
过氧化物牌是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握常用的测定过氧化物酶的方法一愈创木酚法。
酶活性测定
实验一植物抗氧化酶活性的测定
植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定
超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：
2
反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产
生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除
从而抑制了甲的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】
高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】
1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
植物组织中过氧化物酶活性的测定
实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定
一、实验目的：
1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验原理：
过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。
三、实验仪器及材料：
1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表
2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4
四、实验步骤：
1、POD的提取
分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。
2、POD活性的测定
取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。
取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。
五、实验结果：
1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。
2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：
苹果酶液OD值与时间的关系曲线图
以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：
苹果POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D
=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定
植物组织中超氧化物歧化酶活性测定植物组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定是一项重要的生物化学实验，它有助于了解植物体内抗氧化系统的运行机制及其在应对环境压力中的作用。以下是测定植物组织中超氧化物歧化酶活性的实验步骤和注意事项。
一、实验材料
1.实验植物：选择新鲜、健康的植物组织，如叶片、根或茎。
2.实验试剂：包括磷酸缓冲液（pH 7.8）、乙二胺四乙酸（EDTA）、氮蓝四唑
（NBT）、核黄素、酶提取液等。
3.实验设备：包括分光光度计、离心机、研钵、试管、滴定管等。
二、实验步骤
1.酶提取：将植物组织研碎，加入适量的酶提取液，充分研磨并混合均匀，然
后置于离心机中以3000-4000 r/min的速度离心10-15分钟，得到清亮的上清液。
2.酶活性测定：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑
（NBT）、0.1毫升的核黄素和0.002毫升的酶提取液，混合均匀后用分光
光度计在560纳米处测定吸光度。
3.空白对照：取3毫升磷酸缓冲液、0.1毫升的EDTA、0.1毫升的氮蓝四唑
（NBT）和0.1毫升的核黄素，混合均匀后用分光光度计在560纳米处测定吸光度。
4.数据记录：记录酶活性测定和空白对照的吸光度值，并计算超氧化物歧化酶
活性。
三、注意事项
1.实验过程中要保证所用试剂的纯度和新鲜度，避免影响实验结果。
2.离心机使用前应预热，保证离心的效果和效率。
3.在酶活性测定中，加入酶提取液时应十分小心，避免产生气泡，影响吸光度
的测定。
4.在整个实验过程中要保证温度、光照等环境因素的一致性，以减小误差。
植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定
植物组织SOD、CAT、POD活性以及MDA、H2O2含量的测定
•植物组织中通过多条途径产生O-.2、OH等自由基，•这些自由基具有很强的氧化能力，
对许多生物功能分子有破坏作用。•细胞内也存在消除这些自由基的多种途径。如SOD可以
消除O-.2（超氧物阴离子自由基）：
SOD 2O-2·＋2H+ ──→ H2O2＋O2
2H2O2＋-.────→OH·＋O2
•• CAT
2H2O2───→ 2H2O＋O2
••••••••••••••••••••
•••••••••• 细胞2O2的积累可使CO2的固定效率降低,而CAT和POD•能分解••••H2O2, 只有SOD、CAT、POD三者活性协调一致，才能使自由基维持在••••••••••一个低水平，所以上述三种酶统称为保护酶系统。
•••••••••• 在正常情况下,细胞内自由基的产生和消除处于动态平衡状态，••••••••••自由基水平很低，不会伤害细胞。但当植物受到逆境胁迫时，•植物体内活性氧代谢系统的平衡被打破，O-.2、H2O2、OH•·（羟基自由•基）、·O2（单线态氧）的产量增加，•破坏和降低活性氧清除剂如SOD、CAT、POD、GR(谷胱甘肽还原酶以及VtE、VtC、CAR（类胡萝卜素、GSH（还原型谷胱甘肽）等的结构、活性或含量水平，从而伤害细胞。
•• 自由基伤害细胞的主要途径可能是下列两点：
•• 1. 首先自由基导致膜脂过氧化作用, SOD、POD活性下降,•同时还产生较多的膜脂过氧化产物(乙烯、乙烷和丙二醛），膜的完整性被破坏；
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定
一、实验目的：
1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验原理：
过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。
三、实验仪器及材料：
1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表
2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4
四、实验步骤：
1、POD的提取
分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。
2、POD活性的测定
取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。
取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。
五、实验结果：
1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。
2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：
苹果酶液OD值与时间的关系曲线图
以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：
苹果POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D
=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D
（此值忽略稀释倍数）
其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数
绿豆幼苗酶液OD值与时间的关系曲线图
绿豆幼苗POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D
=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D
（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）
由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D
六、结果分析：
1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。
2、由于仪器较少，等待测OD值的时间较长，且没有放在低温下保持，导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。
3、通过计算可知，经过逆境处理的绿豆幼苗POD值远远大于苹果的POD值，说明绿豆幼苗的过氧化氢酶活性比苹果的要大，原因是逆境处理的绿豆幼苗含较多H2O2，生成较多过氧化氢酶以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。
4、理论上OD值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系，可能原因有：①把酶液加入到3ml反应混合液时，反应太快，待到30s读取OD值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。②绿豆幼苗酶液浓度值偏高。③离心出来的酶液在室温下放置时间过长。
七、结果分析实验思考题：
1、计算各植物材料的POD酶活性的大小。
苹果POD活性为0.52D ，绿豆幼苗的POD活性为12.67D
2、测定本酶活力需要控制哪些条件？
（1）保持待测材料的酶活，如放在低温下保存；
（2）测定时注意控制反应时间，酶液与3ml反应混合液混合后，尽量快速开始测定OD值，以及控制读数的时间间隔；
（3）使酶处于最适Ph下。