间接ELISA检测奶牛乳房炎多联苗抗体方法的研究

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选和优 化



清样 品

作浓度 封 闭



初 步建 立 了 间 接 E L IS A 法 检 测 奶 牛 乳 房 该 3

结 果表明
种抗 原反 应体 系




3
种抗 原 最

方 法具 有快速
简 单 特 异性 和 重 复 性 好 等优 点
间 接 E L IS A

关键词

奶 ;
牛 乳 房 炎 多联 苗


再在

650
定各可 溶性抗 原 的吸 光 度 根 据 回归 方 程 分别计 算 出金 黄

O25

色葡 萄球 菌 无 乳 链 球 菌 停 乳 链 球 菌 可 溶 性 抗 原 的 蛋 白浓


0 20


1




0 15

2
2
多联苗免疫及 血 清 的制备
24
选 择饲 养管理 条件相
2

0 10

重庆维普
灞 褥鳓 獭
200 8
年第
4

间接
E L IS A
冯万 新
(
1

检测 奶 牛乳

k 。
李宏 胜



罗金 印


甘肃农业 大学 甘肃兰州
7 300 7



利 用 超 声波 破 碎 法 制 备 无 乳 链 球 菌


最 佳 包被 浓 度 及 包 被 条 件

1

80
1

10 0

1

16 0

滴定测
OD
值 结果表 明

种可溶性抗原稀释

l

20 0


1 :3 2 0 1 :5 0

1 :4 0 0
1

稀 释 包 被 作 用 ;待 测 血 清 用 样 品 稀 释 液

包被浓度为
4

0

6

0
p g /m L
~
血 清稀 释 1

200
为最佳工

分别作

1


1 4

实验动 物
方 法
兰 州某奶牛 场健 康泌 乳奶 牛 24 头

1 2

培养基

普通 牛 肉汤

7%
羊 血 琼脂 斜 面 由本 课 题

1 2

组 自制
1

1

2

1
可 溶 性 抗 原 的 制 备 与 蛋 白含 量 测 定


将血斜面保存
I

3
主要 仪 器 与试 剂
超 声 波 细 胞 破 碎仪 ( 宁 波 新 芝 生 物

3
次 每次

in
每孔 加 入 的体 积 均 为
1 0 0 斗L

OD
值以

2

中可 溶 性 抗 原 的 蛋 白 含 量 在

1 2 0 0
Ix g /m L



P /N
值在
2 0 以上

并 呈 现 最 大 者 的反 应 条 件 作 为 确 定 E L IS A

最 佳反 应 条件 的判定依据
1 2


10 0
1

200

1

400

1

800

1

1 600
倍稀释作
作浓度
2



4
抗 原 最 佳 包被 条 件 的 测 定 结 果
1 2

5

抗原最 佳包被条件 的确定
37 ℃4 h

以 抗原 最佳包 被浓度进
测定 3 种 条件下 的 大
2

OD
值 其 中在

4 ℃ 24 h

P /N
值最
行包被 按 被

奶样检测

菌进 行 溶 菌 酶 裂 解 法 和 超 声 波 破 碎 法 比 较
法破 碎 率 低 于
3
50 %

溶菌酶裂


无 细菌感染 的健康泌 乳奶 牛 血 液
分离血 清


2 0


超声 波 破 碎法 破 碎率 高 于 85




种菌用超声波破碎 后

1 00 0
r
/r i n a


2 0

心 10

a r
in

除去

1 2

3
间接
E L IS A E L IS A 5
m
操作程序

按 照 参文献

介绍 的方 法
的细 菌碎 片
w r
即 为 可 溶 性 抗 原


保存备用
设计并优化
L 程序 每个 步骤之 间均用 洗涤液满孑 洗

y
法测得无 乳链球菌 停乳链球菌 金黄色葡萄球 菌
80 0

同的健康 泌 乳奶 牛




随机分为


其 中免疫组
18
0 05

对照组 6 头

免疫 组 每头 牛 每 次肩 胛 部 肌 肉注 射奶
-
夕f
0

牛 乳房 炎 多联 苗
于 免疫前 和

5

0
m
L

间隔
30

14

d 60

加强 免疫Biblioteka 7 51次,

分别
0 05
0 2

0 4

0 6

0 8

1 0

1 2
的制 苗 菌株 无 乳链 球 菌 停 乳 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄球 菌 分 别
接 种 肉汤 培 养基

37 ℃ ,
培养

18

2 0 h ,5 0 0 0
r
/m i n
离 心 弃上

清 菌泥用生理盐水混悬 洗 涤离心
7

3
次 最后 加

0 1

m o
l /L p H
制成 细菌悬 液 分 别 采 用 溶 菌 酶 裂 解 法 和 超 声 波 破 二 仪 碎 法 制 备管 溶 性 抗 原 仪 州 可 福 , 产 释 配
6 PBS


蛋 白含 量 测 定 采 用
L
o w r
y

¨ ’

分 别测 定
3
种 菌可溶
重庆维普
。 。

性 抗 原 蛋 白含 量 首 先 根 据 标 准 牛 血 清 白蛋 白 (

B SA
n m
)溶液
处测
0 30

绘 制 标 准 曲线 ( 见 图
1
) 求出回归方程
. .
3
最 佳 抗 原 包被 浓 度 及 血 清 稀 释 度 测 定 结 果
4

抗 原 待测 血 清最 佳 稀释 浓 度 的确定

采 用 方 阵滴

不 同包 被 浓 度 的
3
种抗 原 与不 同稀 释度血 清作方 阵
3


定 法 各抗 原 用 包 被 稀 释 液 分 别 作
1 :2 0 0

1 :5 0
文献标识码
;血 :

中 图分 类号
$852

6
A
多年来 中 国农业 科学 院兰 州 畜 牧 与兽 药研 究 所 研 制

奶 牛 乳 房 炎 多 联 苗 在 全 国多个 奶 牛 场 应 用 对 降低 奶 牛 乳

炎发 病 率 具 有 明显 的效 果 为 了进


步 客观 的评 价该 奶 牛
F I Tq A
I
房炎 多联 苗免疫 效果 笔者 等对 奶 牛 免疫 后 血 清 抗 体 水 平

泪 tl h 壮 ; 符 址
-
"
7
珥 密
加 典 樯 古
了 问 垃

舱 洲 机 出 吲
球 菌 停 乳 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄球 菌 灭 活 后 与 铝 胶 佐 剂 配 合 制
、 、
制方法参考文献
1





成 的 多联 苗

免后第

15

4 5

天采血
分离血

1
蛋 白浓度 , g u
m
L-’
清 清


20 20
℃ ℃
保存 保存
对照组 与免疫组 相 同时间采血 分离血
牛 血 清 白 蛋 白标 准 曲线




通 过对无 乳链 球菌
LMT

停乳链 球 菌和 金 黄色 葡萄球菌

3
阴性 血 清 系采集 免疫前经
检测 阴性

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