间接ELISA检测奶牛乳房炎多联苗抗体方法的研究
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
选和优 化
测
,
血
清样 品
工
作浓度 封 闭
、
.
,
初 步建 立 了 间 接 E L IS A 法 检 测 奶 牛 乳 房 该 3
、
结 果表明
种抗 原反 应体 系
、
一
致
,
3
种抗 原 最
。
方 法具 有快速
简 单 特 异性 和 重 复 性 好 等优 点
间 接 E L IS A
:
关键词
:
奶 ;
牛 乳 房 炎 多联 苗
,
。
再在
,
650
定各可 溶性抗 原 的吸 光 度 根 据 回归 方 程 分别计 算 出金 黄
,
O25
.
色葡 萄球 菌 无 乳 链 球 菌 停 乳 链 球 菌 可 溶 性 抗 原 的 蛋 白浓
、
、
0 20
.
度
1
.
。
篓
.
0 15
.
2
2
多联苗免疫及 血 清 的制备
24
选 择饲 养管理 条件相
2
斟
0 10
.
重庆维普
灞 褥鳓 獭
200 8
年第
4
期
间接
E L IS A
冯万 新
(
1
.
检测 奶 牛乳
,
k 。
李宏 胜
,
。
,
罗金 印
。
:
甘肃农业 大学 甘肃兰州
7 300 7
摘
要
:
利 用 超 声波 破 碎 法 制 备 无 乳 链 球 菌
、
、
最 佳 包被 浓 度 及 包 被 条 件
、
1
:
80
1
:
10 0
、
1
:
16 0
、
滴定测
OD
值 结果表 明
,
种可溶性抗原稀释
,
l
:
20 0
,
其
1 :3 2 0 1 :5 0
、
1 :4 0 0
1
:
稀 释 包 被 作 用 ;待 测 血 清 用 样 品 稀 释 液
、
包被浓度为
4
.
0
—
6
.
0
p g /m L
~
血 清稀 释 1
:
200
为最佳工
究
分别作
用
1
.
。
1 4
.
实验动 物
方 法
兰 州某奶牛 场健 康泌 乳奶 牛 24 头
。
1 2
.
培养基
。
普通 牛 肉汤
,
7%
羊 血 琼脂 斜 面 由本 课 题
,
1 2
.
组 自制
1
.
1
.
2
.
1
可 溶 性 抗 原 的 制 备 与 蛋 白含 量 测 定
、
、
将血斜面保存
I
.
3
主要 仪 器 与试 剂
超 声 波 细 胞 破 碎仪 ( 宁 波 新 芝 生 物
涤
3
次 每次
,
in
每孔 加 入 的体 积 均 为
1 0 0 斗L
。
OD
值以
间
2
.
中可 溶 性 抗 原 的 蛋 白 含 量 在
。
1 2 0 0
Ix g /m L
之
【
调
P /N
值在
2 0 以上
.
并 呈 现 最 大 者 的反 应 条 件 作 为 确 定 E L IS A
。
最 佳反 应 条件 的判定依据
1 2
.
、
10 0
1
:
200
、
1
:
400
、
1
:
800
、
1
:
1 600
倍稀释作
作浓度
2
.
。
。
4
抗 原 最 佳 包被 条 件 的 测 定 结 果
1 2
.
5
,
抗原最 佳包被条件 的确定
37 ℃4 h
、
以 抗原 最佳包 被浓度进
测定 3 种 条件下 的 大
2
.
OD
值 其 中在
,
4 ℃ 24 h
,
P /N
值最
行包被 按 被
、
奶样检测
一
菌进 行 溶 菌 酶 裂 解 法 和 超 声 波 破 碎 法 比 较
法破 碎 率 低 于
3
50 %
,
溶菌酶裂
%
,
无 细菌感染 的健康泌 乳奶 牛 血 液
分离血 清
”
“
2 0
℃
保
超声 波 破 碎法 破 碎率 高 于 85
,
存
.
。
种菌用超声波破碎 后
,
1 00 0
r
/r i n a
一
离
2 0
、
心 10
℃
a r
in
,
除去
。
1 2
.
3
间接
E L IS A E L IS A 5
m
操作程序
,
按 照 参文献
’
介绍 的方 法
的细 菌碎 片
w r
即 为 可 溶 性 抗 原
、
,
保存备用
设计并优化
L 程序 每个 步骤之 间均用 洗涤液满孑 洗
,
y
法测得无 乳链球菌 停乳链球菌 金黄色葡萄球 菌
80 0
—
同的健康 泌 乳奶 牛
头
。
头
,
随机分为
组
,
其 中免疫组
18
0 05
.
对照组 6 头
。
免疫 组 每头 牛 每 次肩 胛 部 肌 肉注 射奶
-
夕f
0
。
牛 乳房 炎 多联 苗
于 免疫前 和
二
5
.
0
m
L
,
间隔
30
、
14
、
d 60
,
加强 免疫Biblioteka 7 51次,
。
分别
0 05
0 2
.
0 4
.
0 6
.
0 8
.
1 0
.
1 2
的制 苗 菌株 无 乳链 球 菌 停 乳 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄球 菌 分 别
接 种 肉汤 培 养基
,
37 ℃ ,
培养
,
18
—
2 0 h ,5 0 0 0
r
/m i n
离 心 弃上
,
清 菌泥用生理盐水混悬 洗 涤离心
7
.
3
次 最后 加
。
0 1
.
m o
l /L p H
制成 细菌悬 液 分 别 采 用 溶 菌 酶 裂 解 法 和 超 声 波 破 二 仪 碎 法 制 备管 溶 性 抗 原 仪 州 可 福 , 产 释 配
6 PBS
,
。
蛋 白含 量 测 定 采 用
L
o w r
y
法
¨ ’
。
分 别测 定
3
种 菌可溶
重庆维普
。 。
。
性 抗 原 蛋 白含 量 首 先 根 据 标 准 牛 血 清 白蛋 白 (
,
B SA
n m
)溶液
处测
0 30
.
绘 制 标 准 曲线 ( 见 图
1
) 求出回归方程
. .
3
最 佳 抗 原 包被 浓 度 及 血 清 稀 释 度 测 定 结 果
4
,
抗 原 待测 血 清最 佳 稀释 浓 度 的确定
、
采 用 方 阵滴
、
不 同包 被 浓 度 的
3
种抗 原 与不 同稀 释度血 清作方 阵
3
查
研
定 法 各抗 原 用 包 被 稀 释 液 分 别 作
1 :2 0 0
、
1 :5 0
文献标识码
;血 :
:
中 图分 类号
$852
.
6
A
多年来 中 国农业 科学 院兰 州 畜 牧 与兽 药研 究 所 研 制
,
奶 牛 乳 房 炎 多 联 苗 在 全 国多个 奶 牛 场 应 用 对 降低 奶 牛 乳
,
炎发 病 率 具 有 明显 的效 果 为 了进
,
一
步 客观 的评 价该 奶 牛
F I Tq A
I
房炎 多联 苗免疫 效果 笔者 等对 奶 牛 免疫 后 血 清 抗 体 水 平
,
泪 tl h 壮 ; 符 址
-
"
7
珥 密
加 典 樯 古
了 问 垃
冲
舱 洲 机 出 吲
球 菌 停 乳 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄球 菌 灭 活 后 与 铝 胶 佐 剂 配 合 制
、 、
制方法参考文献
1
.
”
’
“
。
成 的 多联 苗
.
免后第
。
15
、
4 5
和
天采血
分离血
图
1
蛋 白浓度 , g u
m
L-’
清 清
一
,
20 20
℃ ℃
保存 保存
对照组 与免疫组 相 同时间采血 分离血
牛 血 清 白 蛋 白标 准 曲线
、
一
,
。
通 过对无 乳链 球菌
LMT
,
停乳链 球 菌和 金 黄色 葡萄球菌
,
3
阴性 血 清 系采集 免疫前经
检测 阴性
,
测
,
血
清样 品
工
作浓度 封 闭
、
.
,
初 步建 立 了 间 接 E L IS A 法 检 测 奶 牛 乳 房 该 3
、
结 果表明
种抗 原反 应体 系
、
一
致
,
3
种抗 原 最
。
方 法具 有快速
简 单 特 异性 和 重 复 性 好 等优 点
间 接 E L IS A
:
关键词
:
奶 ;
牛 乳 房 炎 多联 苗
,
。
再在
,
650
定各可 溶性抗 原 的吸 光 度 根 据 回归 方 程 分别计 算 出金 黄
,
O25
.
色葡 萄球 菌 无 乳 链 球 菌 停 乳 链 球 菌 可 溶 性 抗 原 的 蛋 白浓
、
、
0 20
.
度
1
.
。
篓
.
0 15
.
2
2
多联苗免疫及 血 清 的制备
24
选 择饲 养管理 条件相
2
斟
0 10
.
重庆维普
灞 褥鳓 獭
200 8
年第
4
期
间接
E L IS A
冯万 新
(
1
.
检测 奶 牛乳
,
k 。
李宏 胜
,
。
,
罗金 印
。
:
甘肃农业 大学 甘肃兰州
7 300 7
摘
要
:
利 用 超 声波 破 碎 法 制 备 无 乳 链 球 菌
、
、
最 佳 包被 浓 度 及 包 被 条 件
、
1
:
80
1
:
10 0
、
1
:
16 0
、
滴定测
OD
值 结果表 明
,
种可溶性抗原稀释
,
l
:
20 0
,
其
1 :3 2 0 1 :5 0
、
1 :4 0 0
1
:
稀 释 包 被 作 用 ;待 测 血 清 用 样 品 稀 释 液
、
包被浓度为
4
.
0
—
6
.
0
p g /m L
~
血 清稀 释 1
:
200
为最佳工
究
分别作
用
1
.
。
1 4
.
实验动 物
方 法
兰 州某奶牛 场健 康泌 乳奶 牛 24 头
。
1 2
.
培养基
。
普通 牛 肉汤
,
7%
羊 血 琼脂 斜 面 由本 课 题
,
1 2
.
组 自制
1
.
1
.
2
.
1
可 溶 性 抗 原 的 制 备 与 蛋 白含 量 测 定
、
、
将血斜面保存
I
.
3
主要 仪 器 与试 剂
超 声 波 细 胞 破 碎仪 ( 宁 波 新 芝 生 物
涤
3
次 每次
,
in
每孔 加 入 的体 积 均 为
1 0 0 斗L
。
OD
值以
间
2
.
中可 溶 性 抗 原 的 蛋 白 含 量 在
。
1 2 0 0
Ix g /m L
之
【
调
P /N
值在
2 0 以上
.
并 呈 现 最 大 者 的反 应 条 件 作 为 确 定 E L IS A
。
最 佳反 应 条件 的判定依据
1 2
.
、
10 0
1
:
200
、
1
:
400
、
1
:
800
、
1
:
1 600
倍稀释作
作浓度
2
.
。
。
4
抗 原 最 佳 包被 条 件 的 测 定 结 果
1 2
.
5
,
抗原最 佳包被条件 的确定
37 ℃4 h
、
以 抗原 最佳包 被浓度进
测定 3 种 条件下 的 大
2
.
OD
值 其 中在
,
4 ℃ 24 h
,
P /N
值最
行包被 按 被
、
奶样检测
一
菌进 行 溶 菌 酶 裂 解 法 和 超 声 波 破 碎 法 比 较
法破 碎 率 低 于
3
50 %
,
溶菌酶裂
%
,
无 细菌感染 的健康泌 乳奶 牛 血 液
分离血 清
”
“
2 0
℃
保
超声 波 破 碎法 破 碎率 高 于 85
,
存
.
。
种菌用超声波破碎 后
,
1 00 0
r
/r i n a
一
离
2 0
、
心 10
℃
a r
in
,
除去
。
1 2
.
3
间接
E L IS A E L IS A 5
m
操作程序
,
按 照 参文献
’
介绍 的方 法
的细 菌碎 片
w r
即 为 可 溶 性 抗 原
、
,
保存备用
设计并优化
L 程序 每个 步骤之 间均用 洗涤液满孑 洗
,
y
法测得无 乳链球菌 停乳链球菌 金黄色葡萄球 菌
80 0
—
同的健康 泌 乳奶 牛
头
。
头
,
随机分为
组
,
其 中免疫组
18
0 05
.
对照组 6 头
。
免疫 组 每头 牛 每 次肩 胛 部 肌 肉注 射奶
-
夕f
0
。
牛 乳房 炎 多联 苗
于 免疫前 和
二
5
.
0
m
L
,
间隔
30
、
14
、
d 60
,
加强 免疫Biblioteka 7 51次,
。
分别
0 05
0 2
.
0 4
.
0 6
.
0 8
.
1 0
.
1 2
的制 苗 菌株 无 乳链 球 菌 停 乳 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄球 菌 分 别
接 种 肉汤 培 养基
,
37 ℃ ,
培养
,
18
—
2 0 h ,5 0 0 0
r
/m i n
离 心 弃上
,
清 菌泥用生理盐水混悬 洗 涤离心
7
.
3
次 最后 加
。
0 1
.
m o
l /L p H
制成 细菌悬 液 分 别 采 用 溶 菌 酶 裂 解 法 和 超 声 波 破 二 仪 碎 法 制 备管 溶 性 抗 原 仪 州 可 福 , 产 释 配
6 PBS
,
。
蛋 白含 量 测 定 采 用
L
o w r
y
法
¨ ’
。
分 别测 定
3
种 菌可溶
重庆维普
。 。
。
性 抗 原 蛋 白含 量 首 先 根 据 标 准 牛 血 清 白蛋 白 (
,
B SA
n m
)溶液
处测
0 30
.
绘 制 标 准 曲线 ( 见 图
1
) 求出回归方程
. .
3
最 佳 抗 原 包被 浓 度 及 血 清 稀 释 度 测 定 结 果
4
,
抗 原 待测 血 清最 佳 稀释 浓 度 的确定
、
采 用 方 阵滴
、
不 同包 被 浓 度 的
3
种抗 原 与不 同稀 释度血 清作方 阵
3
查
研
定 法 各抗 原 用 包 被 稀 释 液 分 别 作
1 :2 0 0
、
1 :5 0
文献标识码
;血 :
:
中 图分 类号
$852
.
6
A
多年来 中 国农业 科学 院兰 州 畜 牧 与兽 药研 究 所 研 制
,
奶 牛 乳 房 炎 多 联 苗 在 全 国多个 奶 牛 场 应 用 对 降低 奶 牛 乳
,
炎发 病 率 具 有 明显 的效 果 为 了进
,
一
步 客观 的评 价该 奶 牛
F I Tq A
I
房炎 多联 苗免疫 效果 笔者 等对 奶 牛 免疫 后 血 清 抗 体 水 平
,
泪 tl h 壮 ; 符 址
-
"
7
珥 密
加 典 樯 古
了 问 垃
冲
舱 洲 机 出 吲
球 菌 停 乳 链 球 菌 金 黄 色 葡 萄球 菌 灭 活 后 与 铝 胶 佐 剂 配 合 制
、 、
制方法参考文献
1
.
”
’
“
。
成 的 多联 苗
.
免后第
。
15
、
4 5
和
天采血
分离血
图
1
蛋 白浓度 , g u
m
L-’
清 清
一
,
20 20
℃ ℃
保存 保存
对照组 与免疫组 相 同时间采血 分离血
牛 血 清 白 蛋 白标 准 曲线
、
一
,
。
通 过对无 乳链 球菌
LMT
,
停乳链 球 菌和 金 黄色 葡萄球菌
,
3
阴性 血 清 系采集 免疫前经
检测 阴性
,