β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备
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为研制有较强特异性 Aβ1 - 42 单克隆抗体，本实验以具 有强免疫原性的乙肝核心抗原与 Aβ1 - 42 基因的融合
收稿日期：2004-02-24 修回日期：2004-03-25 基金项目：国家自然科学基金资助（ No：30300395） 作者简介：董炜疆（1975-），男（ 汉族），讲师，博士研究生. 研究方向：
第25 卷 第5 期 2004 年10 月
西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ） Journal of Xi'an Jiaotong University（ Medical Sciences）
7ol8 25 9o8 5 :ct8 2004
β 淀粉样肽 1 ～ 42 单克隆抗体的制备
董炜疆1 ，胡海涛1 ，冯改丰1 ，杨广笑2 ，王全颖2
ABSTRACT：Objective ;o <re<are a =y>rido?a secreting sta>le ?onoclonal anti>odies against β @a?yloid <e<tide （ Aβ 1 -42 ）Bit= =ig= titer8 Methods Cy genetic engineering tec=nology，Aβ gene Bas reco?>ined Bit= t=e MDE of
关键词：β-淀粉样肽；单克隆抗体；融合蛋白；细胞融合
中图分类号：R392. 12
文献标识码：A
文章编号：1671-8259（2004）05-0517-03
Preparation of monoclonal antibodies against β -amyloid peptide1 -42
Dong Weijiang，Hu Haitao，Feng Gaifeng，Yang Guangxiao，Wang Quanying （ Department of Anatomy，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）
液，1 周后用 HT 培养基取代 HAT 培养液，连续培养 3 d 后，即可用含 10%（ 体积分数）胎牛血清的 1640 培 养基培养。 1. 5. 5 抗体阳性孔的检测 于培养后的 7 ～ 20 d，选 择有克隆 生 长 的 培 养 孔，吸 取 其 上 清 液 检 测 有 无 抗 体，寻找分泌抗体的阳性克隆。融合孔细胞长至 1 / 2 视野时，通过间接 ELISA 筛选出阳性杂交瘤细胞株。 1. 5. 6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 采用有限稀释法 进行。本试验连续克隆 3 次，每次均采用间接 ELISA 方 法，选取与 Aβ1 -42 肽反应阳性的克隆，共得到两株杂 交瘤细胞 1H7 和 1F3。 1. 5. 7 杂交瘤细胞的扩大培养 当杂交瘤细胞生长 达 90% ～ 95% 单层密度时加培养液至瓶颈，置 37 ℃ 培养箱孵育 10 ～ 14 d 后，收集杂交瘤细胞。细胞悬 液以 1500 r·min - 1 离心 10 min，计数，调整细胞浓度 为 106 个细胞·mL - 1 。 1. 5. 8 单克隆抗体的大量制备和纯化 选用 6 ～ 8 周龄 的 健 康 BALB / c 小 鼠 12 只，腹 腔 注 射 植 烷 （ pristane），每只 0. 5 mL。2 ～ 7 d 后，收集杂交瘤细 胞，离心，取上清。加入不含血清的培养基，调节细胞 密度至 106 个细胞·mL - 1 ，每只小鼠注射 1 mL。7 ～ 12 d，小鼠腹部增大，收集腹水，以 1 000 ～ 2 000 r · min - 1 离心 5 min，吸取上清，以 0. 45 µm 的小滤器过 滤除菌，分装后，- 20 ℃ 储存。经纯化（ 辛酸法），酶 标后用 HBcAg 和标准 Aβ1 - 42 肽测定特异性并用间接 ELISA 法测定抗体效价。
1 材料与方法
1. 1 材料 BALB / c 小鼠由第四军医大学实验动物 中心提供，SP2 / 0 小鼠骨髓瘤细胞由西安华广生物工 程公司提供。 1. 2 主要试剂 Aβ1 - 42 肽购自北京美联生物公司， 培养基 RPMI1640、胎牛血清、HAT、HT 培养基、PEG （MW = 4000）、兔抗小鼠 IgG 均购自华美生物工程公 司，细胞培养板及酶标板为 Nunclon 产品，其他试剂 均为国产分析纯。 1. 3 Aβ 和 HBcAg 的融合蛋白的制备 以质粒 pYTA1 为模板，分别扩增出乙肝核心抗原 MIR 区（ 主要 免疫优 势 区 ）之 前 的 HBc 基 因 片 段（ HBc1-71 ）和 MIR 区之后的 HBc 片段（ HBc88-144）。通过 PCR，从 质粒 pGEM-7Z / Aβ 中扩增得到的 Aβ1 - 42 基因序列， 经过酶切、连接等步骤，将 Aβ1 - 42 基因插入于删除了 72 ～ 88 位氨基酸序列的 HBcAg 中，得到融合基因 c-
2结 果
经多次间接 ELISA 法检测筛选，得到两株能稳
定分泌 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 1H7 和 1F3。 其染色体平均数分别为 84（1H7）和 75（1F3）。免疫
双扩鉴定，Aβ1 - 42 单克隆抗体的 Ig 亚类为 IgG3 。将 融合蛋白（ c-Aβ-c）1 : 500 倍稀释，Aβ1 - 42 肽用包被 缓冲液 CBS 按 2 mg·L - 1 配制，HBcAg 包被的酶标板
老年性痴呆的预防和治疗. Tel：（ 029 ）88596754；E-mail： dongweijiang@ sohu. com
蛋白 c-Aβ-c 为抗原，免疫 BALB / c 小鼠，制备得到两 株能稳定产生 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞（1H7 和 1F3 ），其分泌的抗体特异性强，效价高。
FCcAg to get t=e Aβ and FCcAg fusion <rotein8 S<leen cells fro? CAGC H c ?ice i??uniIed Bit= Aβ and FCcAg fusion
<rotein Bere fused Bit= ?ouse ?yelo?a cells SJ2 H 08 ResuIts ;Bo strains of =y>rido?as（ 1F7 and 1K3 ）secreting
sta>le ?onoclonal anti>odies raised against Aβ 1 - 42 Bere o>tained8 ;=e su>ty<es of Aβ 1 - 42 anti>odies Bere DgL3 8
ConcIusion ;=e Aβ 1 -42 ?onoclonal anti>odies o>tained =ave =ig= titers and s<ecificity8 KEY WORDS：Aβ 1 -42 ；?onoclonal anti>ody（ ?A>）；fusion <rotein；cell fusion
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西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ）
第 25 卷
Aβ-c。融合基因 c-Aβ-c 亚克隆于表达质粒 PHGhis， 得到表达质粒 pHGhis / c-Aβ-c。该质粒转化大肠杆 菌 DH5，温度诱导表达，超声裂解细菌，收集沉淀，将 包含体进行溶解、复性，得到融合蛋白［5］。 1. 4 小鼠的免疫 以融合蛋白 c-Aβ-c 免疫 6 ～ 8 周 的雌性 BALB / c 小鼠（ 体质量 15 ～ 20 g）免疫前 1 d 剪 鼠尾采血，收集血清作为对照。初次免疫时，将表达蛋 白与完全福氏佐剂（CFA）各 0. 5 mL，经充分乳化后，腹 腔注射免疫小鼠，0. 1 mL·只 -1。2 周后用相同的剂量 和注射方法加强免疫。从第 2 次免疫开始，分别于免疫 后 1 周剪鼠尾采血，收集血清，用间接 ELISA 法，检测血 清中 Aβ 抗体滴度可达到 1: 4 000，免疫后血清中抗HBc 的抗体滴度很低，几乎检测不到。再过 2 周用不含 佐剂的纯化抗原直接尾静脉注射进行最后 1 次加强免 疫，末次免疫后 3 d 取脾脏。 1. 5 阳性杂交瘤细胞株的建立 1. 5. 1 骨髓瘤细胞的制备 在杂交瘤细胞融合前 10 d，将骨髓瘤细胞以 8-杂氮鸟嘌呤（8-AG，15 ～ 20 mg·L - 1 培养基）处理，连续培养 7 d，除去含次黄嘌 呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT）的骨髓瘤细胞。 然后用含 15%（ 体积分数）胎牛血清的RPMI1640 培 养液将供融合的骨髓瘤进行增殖培养，使细胞浓度在 融合当天达到对数生长期时 105 个细胞·mL - 1 ，细胞 悬液以 1 500 r·min - 1 离心 5 min，弃上清，置室温待 用。 1. 5. 2 免疫小鼠脾细胞的制备 冲击免疫后 3 d，摘 除小鼠眼球放血。血清留作阳性对照。按无菌操作 规程取出脾脏，在小平皿上压碎研磨，加入一些不含 血清的培养基，用 100 目的不锈钢网过滤。收集过滤 后的细胞悬液于离心管中，计数，取 1 × 108 个细胞， 离心，弃上清，至室温待用。 1. 5. 3 滋养细胞的制备 取 1 只 6 ～ 8 周龄健康的 BALB / c 小鼠，拉颈处死，无菌操作下，剪开皮肤，吸取 5 mL不含血清的培养基，注入小鼠腹腔，再将液体抽回 离心后，弃上清，沉淀于管底的细胞置室温备用。 1. 5. 4 细胞融合 将上述制备的脾细胞和骨髓瘤细 胞按 5 : 1 混合，经 1 500 r·min - 1 离心 5 min，弃上 清，将离心管置于 37 ℃ 水浴中，用 1 min 时间边振摇 边加 1 g·mL - 1 的聚乙二醇（ PEG-4 000）溶液 1 mL。 静置 1 min 后，吸取 10 mL 无血清的培养基，缓慢加 入，再次离心，弃上清。再加入含有 15%（体积分数） 胎牛血清的 RPMI 1 640 培养基，混匀后将融合后的细胞 和滋养细胞移置培养瓶，加 HAT 培养基 50 mL，混匀后， 接种至两块 96 孔培养板，每孔加 250 µL，放入 5%（ 体 积分数）CO2 培养箱中 37 ℃ 培养观察。3 d 后半量换
由西安华广生物公司提供，间接 ELISA 测定，结果显 示：腹水效价均为 1 × 10 - 5 ，特异性试验表明，Aβ1 - 42 单克隆抗体与 HBcAg 无交叉反应（ 见表 1）。
（1. 西安交通大学医学院人体解剖学教研室，陕西西安 710061；2. 西安华广生物工程公司，陕西西安 710005）
摘要：目的 制备稳定分泌 β - 淀粉样肽 1 ～ 42（ Aβ1 - 42 ）单克隆抗体的杂交瘤细胞，产生高效价抗体。方法 通过基 因工程技术，将 Aβ1 - 42 基因融合于乙肝核心抗原（ HBcAg）的主要免疫优势区（ MIR脾细胞与 SP2 / 0 细胞融合，筛选能稳定分泌 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果 得到两株 能稳定分泌 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞，Aβ1 - 42 单克隆抗体的 Ig 亚类为 IgG3 。结论 制备得到的 Aβ1 - 42 单克隆 抗体特异性强，效价高。
老年性痴呆（ senile dementia）是一类老年人群中 常见的中枢神经退行性疾病，其中发病率最高、危害
最大的是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），临 床主要表现为进行性的记忆减退和认知障碍。老年
斑（senile plaque，SP）是阿尔茨海默病的主要病理特 征之一［1］。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分 β - 淀粉样肽（ β-amyloid peptide，Aβ）是 AD 发生的主 要原因，也是研究 AD 防治的主要焦点。近年来研究 发现，Aβ 的单克隆抗体可使体外聚集状的 Aβ 解聚， 从而降低其毒性作用［2］；用 Aβ 抗体免疫 AD 转基因 小鼠，不但能减少模型鼠脑内的老年斑的数量［3］，也 可以改善其学习记忆能力［4］。因此制备出针对 Aβ 及其不同肽段的多克隆和单克隆抗体显得尤为重要。
收稿日期：2004-02-24 修回日期：2004-03-25 基金项目：国家自然科学基金资助（ No：30300395） 作者简介：董炜疆（1975-），男（ 汉族），讲师，博士研究生. 研究方向：
第25 卷 第5 期 2004 年10 月
西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ） Journal of Xi'an Jiaotong University（ Medical Sciences）
7ol8 25 9o8 5 :ct8 2004
β 淀粉样肽 1 ～ 42 单克隆抗体的制备
董炜疆1 ，胡海涛1 ，冯改丰1 ，杨广笑2 ，王全颖2
ABSTRACT：Objective ;o <re<are a =y>rido?a secreting sta>le ?onoclonal anti>odies against β @a?yloid <e<tide （ Aβ 1 -42 ）Bit= =ig= titer8 Methods Cy genetic engineering tec=nology，Aβ gene Bas reco?>ined Bit= t=e MDE of
关键词：β-淀粉样肽；单克隆抗体；融合蛋白；细胞融合
中图分类号：R392. 12
文献标识码：A
文章编号：1671-8259（2004）05-0517-03
Preparation of monoclonal antibodies against β -amyloid peptide1 -42
Dong Weijiang，Hu Haitao，Feng Gaifeng，Yang Guangxiao，Wang Quanying （ Department of Anatomy，Medical School of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710061，China）
液，1 周后用 HT 培养基取代 HAT 培养液，连续培养 3 d 后，即可用含 10%（ 体积分数）胎牛血清的 1640 培 养基培养。 1. 5. 5 抗体阳性孔的检测 于培养后的 7 ～ 20 d，选 择有克隆 生 长 的 培 养 孔，吸 取 其 上 清 液 检 测 有 无 抗 体，寻找分泌抗体的阳性克隆。融合孔细胞长至 1 / 2 视野时，通过间接 ELISA 筛选出阳性杂交瘤细胞株。 1. 5. 6 阳性杂交瘤细胞的亚克隆 采用有限稀释法 进行。本试验连续克隆 3 次，每次均采用间接 ELISA 方 法，选取与 Aβ1 -42 肽反应阳性的克隆，共得到两株杂 交瘤细胞 1H7 和 1F3。 1. 5. 7 杂交瘤细胞的扩大培养 当杂交瘤细胞生长 达 90% ～ 95% 单层密度时加培养液至瓶颈，置 37 ℃ 培养箱孵育 10 ～ 14 d 后，收集杂交瘤细胞。细胞悬 液以 1500 r·min - 1 离心 10 min，计数，调整细胞浓度 为 106 个细胞·mL - 1 。 1. 5. 8 单克隆抗体的大量制备和纯化 选用 6 ～ 8 周龄 的 健 康 BALB / c 小 鼠 12 只，腹 腔 注 射 植 烷 （ pristane），每只 0. 5 mL。2 ～ 7 d 后，收集杂交瘤细 胞，离心，取上清。加入不含血清的培养基，调节细胞 密度至 106 个细胞·mL - 1 ，每只小鼠注射 1 mL。7 ～ 12 d，小鼠腹部增大，收集腹水，以 1 000 ～ 2 000 r · min - 1 离心 5 min，吸取上清，以 0. 45 µm 的小滤器过 滤除菌，分装后，- 20 ℃ 储存。经纯化（ 辛酸法），酶 标后用 HBcAg 和标准 Aβ1 - 42 肽测定特异性并用间接 ELISA 法测定抗体效价。
1 材料与方法
1. 1 材料 BALB / c 小鼠由第四军医大学实验动物 中心提供，SP2 / 0 小鼠骨髓瘤细胞由西安华广生物工 程公司提供。 1. 2 主要试剂 Aβ1 - 42 肽购自北京美联生物公司， 培养基 RPMI1640、胎牛血清、HAT、HT 培养基、PEG （MW = 4000）、兔抗小鼠 IgG 均购自华美生物工程公 司，细胞培养板及酶标板为 Nunclon 产品，其他试剂 均为国产分析纯。 1. 3 Aβ 和 HBcAg 的融合蛋白的制备 以质粒 pYTA1 为模板，分别扩增出乙肝核心抗原 MIR 区（ 主要 免疫优 势 区 ）之 前 的 HBc 基 因 片 段（ HBc1-71 ）和 MIR 区之后的 HBc 片段（ HBc88-144）。通过 PCR，从 质粒 pGEM-7Z / Aβ 中扩增得到的 Aβ1 - 42 基因序列， 经过酶切、连接等步骤，将 Aβ1 - 42 基因插入于删除了 72 ～ 88 位氨基酸序列的 HBcAg 中，得到融合基因 c-
2结 果
经多次间接 ELISA 法检测筛选，得到两株能稳
定分泌 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 1H7 和 1F3。 其染色体平均数分别为 84（1H7）和 75（1F3）。免疫
双扩鉴定，Aβ1 - 42 单克隆抗体的 Ig 亚类为 IgG3 。将 融合蛋白（ c-Aβ-c）1 : 500 倍稀释，Aβ1 - 42 肽用包被 缓冲液 CBS 按 2 mg·L - 1 配制，HBcAg 包被的酶标板
老年性痴呆的预防和治疗. Tel：（ 029 ）88596754；E-mail： dongweijiang@ sohu. com
蛋白 c-Aβ-c 为抗原，免疫 BALB / c 小鼠，制备得到两 株能稳定产生 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞（1H7 和 1F3 ），其分泌的抗体特异性强，效价高。
FCcAg to get t=e Aβ and FCcAg fusion <rotein8 S<leen cells fro? CAGC H c ?ice i??uniIed Bit= Aβ and FCcAg fusion
<rotein Bere fused Bit= ?ouse ?yelo?a cells SJ2 H 08 ResuIts ;Bo strains of =y>rido?as（ 1F7 and 1K3 ）secreting
sta>le ?onoclonal anti>odies raised against Aβ 1 - 42 Bere o>tained8 ;=e su>ty<es of Aβ 1 - 42 anti>odies Bere DgL3 8
ConcIusion ;=e Aβ 1 -42 ?onoclonal anti>odies o>tained =ave =ig= titers and s<ecificity8 KEY WORDS：Aβ 1 -42 ；?onoclonal anti>ody（ ?A>）；fusion <rotein；cell fusion
518
西 安 交 通 大 学 学 报（ 医 学 版 ）
第 25 卷
Aβ-c。融合基因 c-Aβ-c 亚克隆于表达质粒 PHGhis， 得到表达质粒 pHGhis / c-Aβ-c。该质粒转化大肠杆 菌 DH5，温度诱导表达，超声裂解细菌，收集沉淀，将 包含体进行溶解、复性，得到融合蛋白［5］。 1. 4 小鼠的免疫 以融合蛋白 c-Aβ-c 免疫 6 ～ 8 周 的雌性 BALB / c 小鼠（ 体质量 15 ～ 20 g）免疫前 1 d 剪 鼠尾采血，收集血清作为对照。初次免疫时，将表达蛋 白与完全福氏佐剂（CFA）各 0. 5 mL，经充分乳化后，腹 腔注射免疫小鼠，0. 1 mL·只 -1。2 周后用相同的剂量 和注射方法加强免疫。从第 2 次免疫开始，分别于免疫 后 1 周剪鼠尾采血，收集血清，用间接 ELISA 法，检测血 清中 Aβ 抗体滴度可达到 1: 4 000，免疫后血清中抗HBc 的抗体滴度很低，几乎检测不到。再过 2 周用不含 佐剂的纯化抗原直接尾静脉注射进行最后 1 次加强免 疫，末次免疫后 3 d 取脾脏。 1. 5 阳性杂交瘤细胞株的建立 1. 5. 1 骨髓瘤细胞的制备 在杂交瘤细胞融合前 10 d，将骨髓瘤细胞以 8-杂氮鸟嘌呤（8-AG，15 ～ 20 mg·L - 1 培养基）处理，连续培养 7 d，除去含次黄嘌 呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（ HGPRT）的骨髓瘤细胞。 然后用含 15%（ 体积分数）胎牛血清的RPMI1640 培 养液将供融合的骨髓瘤进行增殖培养，使细胞浓度在 融合当天达到对数生长期时 105 个细胞·mL - 1 ，细胞 悬液以 1 500 r·min - 1 离心 5 min，弃上清，置室温待 用。 1. 5. 2 免疫小鼠脾细胞的制备 冲击免疫后 3 d，摘 除小鼠眼球放血。血清留作阳性对照。按无菌操作 规程取出脾脏，在小平皿上压碎研磨，加入一些不含 血清的培养基，用 100 目的不锈钢网过滤。收集过滤 后的细胞悬液于离心管中，计数，取 1 × 108 个细胞， 离心，弃上清，至室温待用。 1. 5. 3 滋养细胞的制备 取 1 只 6 ～ 8 周龄健康的 BALB / c 小鼠，拉颈处死，无菌操作下，剪开皮肤，吸取 5 mL不含血清的培养基，注入小鼠腹腔，再将液体抽回 离心后，弃上清，沉淀于管底的细胞置室温备用。 1. 5. 4 细胞融合 将上述制备的脾细胞和骨髓瘤细 胞按 5 : 1 混合，经 1 500 r·min - 1 离心 5 min，弃上 清，将离心管置于 37 ℃ 水浴中，用 1 min 时间边振摇 边加 1 g·mL - 1 的聚乙二醇（ PEG-4 000）溶液 1 mL。 静置 1 min 后，吸取 10 mL 无血清的培养基，缓慢加 入，再次离心，弃上清。再加入含有 15%（体积分数） 胎牛血清的 RPMI 1 640 培养基，混匀后将融合后的细胞 和滋养细胞移置培养瓶，加 HAT 培养基 50 mL，混匀后， 接种至两块 96 孔培养板，每孔加 250 µL，放入 5%（ 体 积分数）CO2 培养箱中 37 ℃ 培养观察。3 d 后半量换
由西安华广生物公司提供，间接 ELISA 测定，结果显 示：腹水效价均为 1 × 10 - 5 ，特异性试验表明，Aβ1 - 42 单克隆抗体与 HBcAg 无交叉反应（ 见表 1）。
（1. 西安交通大学医学院人体解剖学教研室，陕西西安 710061；2. 西安华广生物工程公司，陕西西安 710005）
摘要：目的 制备稳定分泌 β - 淀粉样肽 1 ～ 42（ Aβ1 - 42 ）单克隆抗体的杂交瘤细胞，产生高效价抗体。方法 通过基 因工程技术，将 Aβ1 - 42 基因融合于乙肝核心抗原（ HBcAg）的主要免疫优势区（ MIR脾细胞与 SP2 / 0 细胞融合，筛选能稳定分泌 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果 得到两株 能稳定分泌 Aβ1 - 42 单克隆抗体的杂交瘤细胞，Aβ1 - 42 单克隆抗体的 Ig 亚类为 IgG3 。结论 制备得到的 Aβ1 - 42 单克隆 抗体特异性强，效价高。
老年性痴呆（ senile dementia）是一类老年人群中 常见的中枢神经退行性疾病，其中发病率最高、危害
最大的是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD），临 床主要表现为进行性的记忆减退和认知障碍。老年
斑（senile plaque，SP）是阿尔茨海默病的主要病理特 征之一［1］。淀粉级联学说认为老年斑的核心成分 β - 淀粉样肽（ β-amyloid peptide，Aβ）是 AD 发生的主 要原因，也是研究 AD 防治的主要焦点。近年来研究 发现，Aβ 的单克隆抗体可使体外聚集状的 Aβ 解聚， 从而降低其毒性作用［2］；用 Aβ 抗体免疫 AD 转基因 小鼠，不但能减少模型鼠脑内的老年斑的数量［3］，也 可以改善其学习记忆能力［4］。因此制备出针对 Aβ 及其不同肽段的多克隆和单克隆抗体显得尤为重要。