基因芯片用于组分中药新双龙方的配伍机制研究

Vol.33高等学校化学学报No.112012年11月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 2397~2404基因芯片用于组分中药新双龙方的配伍机制研究吕琳星1,范雪梅2,梁琼麟2,王文凯1,王义明1,2,罗国安1,2(1.江西中医学院药学院,南昌330004;2.清华大学化学系,北京100084)摘要　采用基因芯片技术研究了中药新双龙方及其有效组分人参总皂苷和丹参总酚酸治疗急性心肌梗塞(AMI)大鼠的作用机制.以结扎大鼠冠脉左前降支的方法制备急性心梗模型,采用大鼠全基因组表达谱芯片分别筛选出AMI 大鼠给药前及新双龙方与组分给药后的差异表达基因(Ratio>2或<0.5),通过对4组差异基因的综合分析,比较了新双龙方与组分作用方式的异同,从分子调控水平上探讨复方配伍后的增效作用,同时对与药效作用机理直接相关的钙离子转运相关的Cacna 1d 基因和血管修复相关的Flnb 基因进行了实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT⁃PCR)定量.结果表明,新双龙方与2种有效组分对心梗大鼠基因表达的影响不同.对差异基因的聚类分析以及药物的调控作用比较结果均表明复方比组分的疗效更好;通路分析结果表明,新双龙方与组分均主要通过调控钙信号转导通路㊁丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(MAPK)信号等通路发挥药效作用,且复方涉及更多通路;筛选出了复方与组分共同调控的靶点基因,其在3组中具有不完全相同的表达趋势,但复方具有更积极的调控作用.本研究结果从分子调控角度证实了复方新双龙方的配伍优势.关键词　基因表达谱;实时荧光定量聚合酶链式反应;复方配伍;新双龙方;急性心肌梗塞中图分类号　O652 文献标识码　A doi :10.7503/cjcu20120347收稿日期:2012⁃04⁃13.基金项目:国家自然科学基金重点项目(批准号:81130066)和科技部国际合作项目(批准号:2010DFA32420)资助.联系人简介:罗国安,男,教授,博士生导师,主要从事生命分析化学相关研究.E⁃mail:luoga@ 中药复方双龙方由人参和丹参两味药材配伍而成,主治冠心病气虚血瘀证.具有 益气养血㊁活血通脉”的功能.复方中以甘温的人参为君,补充人体不足之气;臣以味苦㊁微寒的丹参,活血通脉㊁祛瘀止痛[1].现代药理研究采用大鼠心梗模型证实双龙方对心肌梗塞有明确的治疗作用[2].本课题组[3]采用化学物质组学研究证明人参总皂苷和丹参总酚酸是双龙方治疗心肌缺血的药效物质基础,其配伍后组成的组分中药新双龙方在大鼠急性心肌梗死发生时能够减小心肌梗死范围,减轻心肌损伤程度,增加心肌小血管密度,增加心肌供血,改善心血管功能,但其作用机制尚不清楚.基于AMI 是一个多环节共同参与的病理过程,而中药复方正是在整体观㊁系统论和中医药理论指导下的,考虑 系统⁃系统”相互作用的 由繁到简”,即从药材配伍到组分配伍到成分群的过程[4].本研究从分子生物学角度对复方及其有效组分的药理作用作了进一步探讨,旨在阐释组分中药新双龙方的药效和配伍作用.前文[5〛已将基因芯片技术应用于中药作用和复方配伍减毒[6]等机制研究,本文通过构建新双龙方及其有效组分人参总皂苷和丹参总酚酸分别干预心梗模型大鼠的全基因组表达谱,采用比较基因组学的模式探讨了3组药物作用方式的异同,从分子调控角度阐释组分中药新双龙方的药效机制及复方配伍优势.1　实验部分1.1　试剂与仪器晶芯®大鼠全基因组表达谱芯片㊁晶芯®cRNA 扩增标记试剂盒(北京博奥生物有限公司);荧光染料Cy3⁃dCTP /Cy5⁃dCTP(瑞典Amersham 公司);Nucleospin ®RNA Clean⁃up 和Nucleospin ®ExtractⅡ8932高等学校化学学报 Vol.33　(美国MN公司);Trizol Reagent(美国Invitrogen公司);First Strand cDNA Synthesis Kit(美国Fermentas 公司);RealMasterMix(SYBR Green)荧光定量试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司];RNase free water(美国Quagen公司);无水乙醇㊁氯仿㊁异丙醇均为国产分析纯(北方化工厂).丹参总酚酸(批号:20080604,自制),人参总皂苷(批号:20080603,自制),新双龙方由2种组分按药效试验筛出的最佳比例配伍组成.BioMixerTMⅡ芯片杂交仪㊁LuxScan10KA双通道激光扫描仪(北京博奥生物有限公司)㊁紫外交联仪(宁波新芝生物科技股份有限公司);超小型真空浓缩仪(日本Taipec公司);GS482双模块基因扩增仪(英国Gene Technologies公司);ABI7300Real Time PCR System(美国ABI公司);台式冷冻离心机(德国Hettich公司);Biophotometer核酸紫外分析仪(德国Eppendorf公司).1.2　大鼠急性心梗模型的建立及给药方法清洁级雄性SD大鼠,体重(250±20)g,购自清华大学动物实验中心.采用文献[7]方法建立心梗模型,即在大鼠自主呼吸条件下,迅速开胸挤出心脏进行冠状动脉结扎,通过心电图㊁心梗面积变化和血清酶学指标检测等证实结扎成功.将大鼠分为模型组(M)㊁双龙方给药组(NSLF)㊁丹参总酚酸给药组(TSA)和人参总皂苷给药组(TGS);另设假手术组(SHAM),只进行开胸穿线,但不结扎,每组6只.给药量为5g生药/kg,将NSLF,TSA和TGS组用生理盐水配制成此剂量浓度的混悬液,采用灌胃方式连续给药7d,每天1次;SHAM组和M组灌胃等量生理盐水.7d后将大鼠处死,取其心脏梗死区与正常组织之间的病变区域,剪碎后立即放入冻存管并置于液氮中保存.1.3　总RNA样本的提取按照Trizol试剂盒操作方法,提取大鼠心脏组织中的总RNA,用RNase free water溶解.用核酸紫外分析仪检测纯度,OD260nm/280nm值(吸光度)为1.8~2.1;用甲醛变性凝胶电泳检测完整性,28S和18S2个条带清晰可见,无拖尾现象;总RNA质量符合芯片实验要求.1.4　基因芯片杂交及数据分析27K Rat Genome Array为双通道芯片,杂交实验分为4组:SHAM/M,记为SHAM组;NSLF/M,记为NSLF组;TGS/M,记为TGS组;TSA/M,记为TSA组.按照晶芯®cRNA扩增标记过程,其中假手术组及给药组作为实验组,荧光标记为Cy5;模型组为共同对照组,荧光标记为Cy3.每组芯片进行3次生物学重复.将点样后的芯片于42℃恒温杂交12~14h,采用LuxScan10KA双通道激光扫描仪扫描芯片,结果用BoaoAnalyzer系列软件进行归一化等处理后提取数据.根据Cy5/Cy3的荧光信号变化倍数(Ratio值)筛选差异基因,Ratio值大于2为显著上调表达基因;小于0.5为显著下调表达基因. 1.5　Real⁃time PCR对芯片差异表达基因的验证取1μg总RNA逆转录合成cDNA,采用SYBR GreenⅠ法对待测基因进行实时荧光定量PCR扩增,反应过程:95℃,10min;95℃,15s;62℃,30s;72℃,30s;40cycles.PCR引物采用Primer5.0软件设计,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(见表1).采用绝对定量分析法,将标准品级别稀释后与待测样本同时进行反应,通过构建标准曲线获得未知样本的量.以管家基因GAPDH为校准基因,模型组为校准样本,分别计算待测基因Cacna1d和Flnb在SHAM组㊁NSLF组㊁TSA组和TGS组中相对于M组的表达水平.Table1　Sequence information of the primersGene Forward Primer Reverse Primer Amplification size GAPDH GCATCCTCGGCTACAGTGAG TCCACCACCATGTTGCTGTA125Cacna1d TCCCTTCAGCAGACCAATACCA GCATTTGTGGAGGTGGGAACTT163Flnb AGCCACCGTCCACGACAATAA CGATAAGGAGAAAGTGGGATGTTG1192　结果与讨论2.1　复方与组分基因表达谱的聚类分析分别对4组芯片数据分析后筛选出SHAM组778个,NSLF组941个,TSA组334个及TGS组971个差异基因.采用Cluster3.0软件及其相匹配的TreeView 可视化软件,对差异基因进行层次聚类分析(图1).结果表明,NSLF 组㊁TSA 组和TGS 组各自聚为一类,表明三者对心肌梗塞具有不同的作用机制.值得注意的是,给药后NSLF 组的聚类距离接近SHAM 组,表明复方作用后的基因表达与假手术组有最相似的表达趋势,这从调控水平上体现出组分配伍后对基因的调节恢复更接近于假手术组,能使心梗大鼠得到更好的治疗.并且这些基因在复方组的表达并不是单一组分简单相加之和,而是有其特定的调节作用.Fig.1　Hierarchical clustering of differentially expressed genes of 4groupsEach group included 3samples which were marked 1,2and 3as the biology repeat.The model group served as the common control in hybridization experiments.The dendrogram shows the clustering of samples.2.2　复方与组分对病理分子的直接调控作用比较找出NSLF 组,TGS 组,TSA 组与SHAM 组差异基因的交集:NSLF∩SHAM =246,TGS∩SHAM =144,TSA∩SHAM =79(见图2),然后从每个交集中分别筛选出2组Ratio 值相近的基因,即为3个给药组分别使大鼠造模后发生变化的基因表达逆转向正常水平的基因.结果表明,复方可逆转的基因数远远大于2个组分组(见图3),反映出对病理分子更好的疗效,充分体现出了中药配伍的优势.Fig.2　Intersection of 4groups Fig.3　Comparison of gene number inversedby NSLF ,TGS and TSA2.3　复方与组分差异表达基因的通路分析采用MAS3.0(博奥分子注释系统)软件对3组差异基因分别进行通路(Pathway)分析,按照软件计算出的P <0.005为节点,发现NSLF 组涉及42条,TGS 组涉及37条,TSA 组涉及13条通路.本文选取基因数≥7个的通路(图4)进行讨论.NSLF,TGS 和TSA 可使大鼠心肌细胞内产生应答的共同通路有:(1)嗅觉传导(Olfactory transduc⁃tion),由于嗅觉感受通过复杂的传导路线可调控/影响脑功能,而大脑的许多部位受到刺激会引起心血管活动和呼吸的变化,所以新双龙方可能通过嗅觉系统对大鼠内脏活动造成影响;(2)钙信号转导通路(Calcium signaling pathway),由于心梗后心室重塑和心力衰竭会导致心肌细胞收缩/舒张等功能异9932　No.11　吕琳星等:基因芯片用于组分中药新双龙方的配伍机制研究Fig.4　Pathways closely related with NSLF ,TGS ,TSA group a.Olfactory transduction;b.calcium signaling pathway;c.MAPK signaling pathway;d.alzheimer′s disease;e.cytokine⁃cytokine receptor interaction;f.neuroactive ligand⁃receptor interaction;g.leukocyte transendothelial migra⁃tion;h.PPAR signaling pathway;i.glycolysis /gluconeogenesis;j.parkinson’s disease;plement and coagulation cascades;l.Jak⁃STAT signaling path⁃way;m.cell cycle;n.prostate cancer;o.small cell lung cancer;p.insulinsignaling pathway;q.valine,leucine and isoleucine degradation;r.cell adhe⁃sion molecules (CAMs);s.antigen processing and presentation;t.systemic lupus erythematosus;u.regulation of actin cytoskeleton;v.citrate cycle(TCA cycle);w.oxidative phosphorylation.常,而细胞内Ca 2+转运障碍是心肌功能异常的主要原因,心肌缺血及胞内Ca 2+超载可直接导致心肌细胞凋亡[8],心肌的收缩/舒张也受到心肌细胞内Ca 2+浓度的控制[9],所以新双龙方可通过对钙稳态的调节影响心脏功能;(3)丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(MAPK signaling pathway)也是心肌细胞对损伤和胞外刺激产生反应的主要通路,参与介导细胞增殖分化㊁凋亡和迁移等一系列病理生理过程,表明新双龙方可能通过激活MAPK 通路调节机制对细胞状态产生影响,改善心肌损伤部位的细胞功能;(4)阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,即AD),由于心㊁脑血管2种疾病往往并存,心脏供血不足同时会导致脑部供血不足,所以新双龙方的药效作用机制涉及到了AD 相关通路.NSLF 与TGS 均涉及的通路有:(1)激活受体信号通路(PPAR signaling pathway),PPARs 可通过转录调控与编码脂肪酸代谢和葡糖糖利用的关键酶相关基因控制心肌代谢,心肌代谢可直接影响心脏结构及功能,因此PPAR 的激活/失活与心肌重塑密切相关[10];(2)细胞因子⁃受体相互作用(Cytokine⁃cytokine receptor interaction),由于心梗发生时会引起机体免疫功能下降,AMI 斑块的局部炎症反应,心肌损伤等,而多个细胞分泌的细胞因子通过与相应受体的结合,可调节细胞生长和分化,参与免疫㊁炎症反应及创伤愈合;(3)白细胞跨内皮迁移(Leukocyte transendothelial migration),白细胞与血管内皮CAM(细胞黏附分子)结合后跨内皮迁移在组织损伤和炎症反应过程中至关重要,可能的机制为通过减少白细胞内皮细胞黏附,从而起到抑制炎症反应,减少缺血心肌损伤的作用.NSLF 与TSA 均涉及到糖酵解/糖异生(Glycol⁃ysis /Gluconeogenesis),在心肌缺血发生的早期,由于缺血组织内的氧合血红蛋白被消耗,心肌能量代谢从线粒体的有氧氧化转变为以糖酵解为主,产生的三磷酸腺苷(ATP)便成为维持心肌细胞存活的唯一能量来源[11].NSLF 还涉及到细胞周期(Cell cycle),由于气血是维持人体生命活动的基本物质,益气养血类中药通常具有促进细胞周期进行的作用,新双龙方可能通过推动细胞周期向前进展从而促进心肌坏死部位新生细胞的增殖;胰岛素信号通路(Insulin signaling pathway)参与调控细胞生长,糖稳态等多个细胞功能,胰岛素通过控制耦合营养物质的有效性调节生物体的营养状况,与心脏生长有密切的联系[12];JAK⁃STAT 信号通路能够在AMI 大鼠心肌细胞中被激活,并且在细胞保护机制中起到了关键作用[13];另外,心梗造成的血管损伤会产生补体和凝血级联(Complement and coagulation cascades)反应,NSLF 可能调节此通路对血管通透性产生影响.TSA 还涉及氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)即合成ATP 为心肌提供能量及三羧酸循环(TCA cycle).TGS 还涉及到调节肌动蛋白骨架(Regulation of actin cytoskeleton)和细胞黏附分子(CAMs)等.由于AMI 是一个心肌缺血损伤与机体产生应答的整体过程,是一个综合的调控网络,以上通路分析表明,新双龙方可干预多条通路对心梗大鼠整体机能进行调节的作用,并且具有比组分更广泛的疗效.2.4　复方与组分共同调控的差异基因分析NSLF 与TSA 共同调控了73个基因,NSLF 与TGS 共同调控了160个基因(见图2).新双龙方与人参总皂苷的作用靶点具有较多的相似性,人参在复方中可能发挥着主要药效作用,这与本课题组[14]0042高等学校化学学报 Vol.33　采用心肌细胞模型研究双龙方的保护作用机制所得结论一致.复方与2个组分共同调控的靶点基因有35个,提示与新双龙方药效机制密切相关.其中18个基因在3个给药组及SHAM 组均有显著差异,表明新双龙方可直接调控这些靶点基因的表达,部分基因在TGS 组与TSA 组中的表达趋势与SHAM 组不一致(见表2),但NSLF 组却使这18个基因均有回转向正常水平的趋势.另外17个基因只在给药组中存在显著性差异,推测其对病理分子起到间接的调控作用.采用MAS3.0软件对这些差异基因进行GO(Gene Ontology)分析发现,所涉及的生物学功能中生理过程方面富集最多,所以主要根据这些基因参与的生理过程进行功能注释(表2中列出已有明确功能注释的部分基因).Table 2　List of selected differentially expressed genes in NSLF ,TSA and TGS group * Gene symbol Ratio NSLF TSA TGS SHAM Gene ontology annotation(Biological process) Flnb 0.312.084.060.45Repair vascular injuries Np 42.602.500.424.50Xenobiotic metabolism,defense Fhl 10.370.430.440.37Development,cell differentiation Gpr 1800.420.460.140.44Regulation of vascular remodeling Lif 0.400.420.370.37Positive regulation of cell proliferation Wdr 780.460.410.180.47Proteolysis Ndrg 20.400.320.280.22Development,nervous system development,cell differentiation Olr 8060.190.370.160.21G⁃protein coupled receptor protein signaling pathway Ppef 10.082.420.170.27Detection of stimulus during sensory perception Got 10.480.460.330.39Oxaloacetate /amino acid metabolism,glycerol biosynthesis RGD 15652380.060.130.440.23Glucose metabolism,metabolism Sdhc 0.470.310.440.35Tricarboxylic acid cycle Gpr 560.100.490.280.23Neuropeptide signaling pathway Cacna 1b 0.460.460.220.14Ion transport,calcium ion transport Cacna 1d 2.880.282.14Ion transport,calcium ion transport Slc 39a 43.633.082.01Ion transport,zinc ion transport Car 70.460.160.39One⁃carbon compound metabolism Maml 10.450.230.26Notch signaling pathway Slc 3a 10.450.440.25Glucose metabolism,transport,amino acid transport Cyp 2e 10.310.430.33Oxidation reduction Cpxm 22.122.133.86Proteolysis,cell adhesion *Denote no significantly differences.2.5　复方与组分共同调控基因的功能分析结合表2中的注释分析差异基因的功能作用,以确定与新双龙方药效机制最为相关的调控分子.Cacna 1d 和Cacna 1b 基因均与钙离子转运(Calcium ion transport)相关.Cacna 1d 基因编码L 型Ca 2+通道亚基Ca v 1.3,L 型钙通道是细胞兴奋过程中Ca 2+内流的主要途径,在收缩与骨骼肌㊁心肌及平滑肌的激活中起主导作用,负责动脉平滑肌的肌肉收缩,是临床上治疗高血压及心绞痛的药用靶点[15].Cacna 1d 基因可能参与到缺血心肌细胞钙离子通道的Ca 2+内流的调节机制中,提示与药效机制密切相关.Cacna 1b 基因编码N 型Ca 2+通道亚基Ca v 2.2,N 型钙通道也可调节系统心血管功能.Slc 39a 4基因与锌离子转运相关,锌作为人体近百种酶的辅酶,可影响多种酶的活性,促进核酸代谢和蛋白质合成等过程.Flnb 和Gpr 180基因分别主要在血管内皮细胞(ECs)和血管平滑肌细胞(VSMCs)中表达.ECs 和VSMCs 是血管的主要组成细胞,其损伤会导致血管无法正常扩张,它们的迁移与增殖异常是心血管病血管重建的主要特征之一.Flnb 参与修复血管损伤过程,且在心室和室下区高表达,与药效机制直接相关.Got 1,RGD 1565238,Car 7和Slc 3a 1基因分别与草酰乙酸㊁葡萄糖㊁一碳化合物和氨基酸代谢等相关;Wdr 78和Cpxm 2基因与蛋白质水解(Proteolysis)相关;Sdhc 基因与三羧酸(TCA)循环相关.这些基1042　No.11　吕琳星等:基因芯片用于组分中药新双龙方的配伍机制研究2042高等学校化学学报 Vol.33　因功能还涉及细胞分化(Cell differentiation)㊁发育(Development)㊁氧化还原(Oxidation reduction)㊁免疫应答(Immune response)和防御(Defense)等.2.6　实时荧光定量PCR结果分析结合通路分析及重点基因的功能分析,选取与新双龙方药效作用机制直接相关的Cacna1d基因(Ca2+转运)和Flnb基因(血管修复),表2中Ratio值显示这2个基因在复方及组分中有不同的表达趋势,采用荧光定量PCR进行验证.图5纵坐标Ratio值表示假手术组与给药组相对于模型组的表达水平.由图5(A)可见,与SHAM 组相比,大鼠心脏组织中Cacna1d基因表达在造模后(M组)显著下降,而在NSLF组中显著升高,其次是TGS组,表达量有回升趋势,而在TSA组无明显变化;由图5(B)可见,Flnb基因表达在造模后显著升高,在NSLF给药组中显著降低,而在TSA及TGS组中均无回转趋势.这2个基因在不同组中表达变化的趋势与芯片结果基本一致,表明芯片数据可信.Fig.5　Verificantion of Cacna1d(A)and Flnb(B)gene through quantitative real time RT⁃PCR The vertical axis represents the ratio of gene expression level in SHAM,NSLF,TSA and TGS group samples to those in M group after nor⁃malization with the housekeeping gene GAPDH.Differences between the groups were analyzed by one⁃way ANOVA using T⁃test(n=6).A val⁃ue of P<0.05was considered statistically significant. *”denote significantly differences.The results confirmed the consisitency between mi⁃croarray and real time RT⁃PCR.2.7　组分中药新双龙方的药效机制讨论对新双龙方与组分共同调控基因的初步分析结果表明,其可通过多个途径干预心梗疾病,而对于阐释新双龙方的作用机制,有必要进一步探讨这些靶点基因的调控作用.Cacna1d基因与新双龙方药效机制密切相关,研究发现,缺失Cacna1d基因会引起心动过缓,房室传导阻滞[16],而心脏中钙电流的主要作用是引起心脏收缩,并产生自律性及房室传导,Cacna1d基因可能通过阻滞缺血心肌细胞钙离子通道Ca2+内流,降低胞浆内的Ca2+浓度,从而影响心肌收缩,降低心肌细胞耗氧过程,减少能量消耗,起到保护心脏的作用.另外,血管修复相关基因Flnb也是新双龙方治疗心肌梗塞的重要靶点.研究发现,在人脐静脉内皮细胞中敲除基因Flnb后,内皮细胞的迁移能力降低,抑制了血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管新生过程[17],因此Flnb可能促进内皮细胞释放VEGF,从而有利于梗死后大鼠缺血心肌部分的血管新生[18].人Gpr180基因编码1个内膜厚度相关的受体,最初被发现作为重要因素是因为对血管损伤的兔模型主动脉进行导管插入后其表达上调, Gpr180缺乏的小鼠对实验性内膜增厚有抑制作用,证实此基因的产物在血管重建调节中起到重要作用[19].Gpr56基因在癌症发展中可以介导VEGF信号通路和血管新生,其过表达会抑制新陈代谢[20],推测其对梗死区的细胞新生起到了一定的调节作用.Sdhc基因编码琥珀酸脱氢酶线粒体酶(SDH),是三羧酸循环和线粒体有氧呼吸链中的重要酶复合物,O2-的产生是SDH引起的[21],主要负责内源性氧化应激过程.Sdhc可能通过对线粒体内有氧呼吸的调节来影响细胞的氧传感通路,对细胞活性产生一定作用.Ndrg2基因在心脏组织中高度表达,其在急性缺血再灌注(I/R)损伤后的心梗组织中发生显著变化,Ndrg2被c⁃Myc抑制,可能参与了I/R损伤后心肌梗塞大鼠的细胞凋亡机制[22].研究发现,Lif 基因即白血病抑制因子,可诱导一些具有心肌细胞特异性的靶基因表达,Lif与BMP⁃2能促进急性心梗后的左心室功能,并且增强微血管密度[23].FHL家族在肥厚型心肌病小鼠模型对心血管系统及横纹肌的发育㊁维护中有重要作用,研究发现,Fhl1基因在房颤病人中显著上调,在心脏重塑机制中起到重要的调节作用[24].Maml 1与Notch 信号通路相关,Notch 是细胞间相互通讯,调控细胞发育的重要通路,与心脏发育有密切的关系,激活/阻断Notch 信号通路都会导致房室管的发育异常[25].Got 1,RGD 1565238,Car 7和Slc 3a 1基因与代谢相关,由于大鼠心肌缺血时造成缺氧,使心肌细胞有氧代谢减弱,产能减小,导致心脏活动所需能量缺乏,引起复杂的物质代谢紊乱,同时代谢废物也不能被及时有效清除,新双龙方可通过调节大鼠体内物质代谢改善缺血区心肌细胞内的能量供应,从而改善缺血冠脉侧支循环,对心脏起到保护作用.参　考　文　献[1]　LUO Guo⁃An(罗国安),WANG Yi⁃Ming(王义明),LIANG Qiong⁃Lin(梁琼麟),LIU Qing⁃Fei(刘清飞).Systems Biology for Tradi⁃tional Chinese Medicine(中医药系统生物学)[M],Beijing:Science Press,2010:469[2]　LI Lian⁃Da(李连达),ZHANG Rong⁃Li(张荣利),LIU Cheng⁃Yuan(刘成源),WU Li⁃Mao(吴理茂),NING Ke⁃Yong(宁可永),LIYi⁃Kui(李贻奎).Traditional Chinese Drug Research &Clinical Pharmacology(中药新药与临床药理)[J],2004,15(3):149 151[3]　GAO Rong(高荣),LIU Qing⁃Fei(刘清飞),LI Yi⁃Kui(李贻奎),SHI Jun(史俊),WANG Yi⁃Ming(王义明),LUO Guo⁃An(罗国安).Chinese Traditional Patent Medicine(中成药)[J],2010,32(5):746 749[4]　LUO Guo⁃An(罗国安),WANG Yi⁃Ming(王义明),LIANG 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mechanism of New Shuanglong Formula with its two effective components total ginsenoside(TGS)and total salvianolic acid(TSA)on acute myocardial infarction(AMI)rats was compared by cDNA microarray.The model was induced by ligation of the left anterior descending artery,and significant genes were screened(Ratio>2or<0.5)when AMI rats were treated before and after with New Shuanglong Formula and components by genome⁃wide expression profiles.Through comprehensive analysis of significant genes of four groups,the similarities and differences of effect between New Shuanglong Formula and compo⁃nents were analyzed and the synergy of compound compatibility at molecular control level was discussed; meanwhile,quantitative real time reverse transcription⁃polymerase chain reaction(RT⁃PCR)was used to ana⁃lyse Cacna1d gene(associated with Calcium ion transport)and Flnb gene(associated with Vascular repair) which both were directly related to the pharmacological effects.The analysis of significant genes showed the effect on gene expression of AMI rats was different from New Shuanglong Formula to components,the com⁃pound appeared to play a better effect than components.Through clustering analysis of different genes and the comparison of regulation effects by drugs,the compound appeared to play a better effect than componects. Pathway analysis indicates the affects of New Shuanglong Formula and components are mainly through regula⁃ting calcium signaling pathway,MAPK signaling pathway and so on,and the compound involved more path⁃ways;common target genes which are regulated by compound and components were screened,although their expression patterns are not exactly the same,but the compound appear to play a better effect.The results of this study have illuminated the advantage of New Shuanglong Formula from the perspective of molecular con⁃trol.Keywords　Gene expression profile;Real time reverse transcription⁃polymerase chain reaction(RT⁃PCR); Compatibility of Traditional Chinese Medicine(TCM);New Shuanglong Formula;Acute Myocardial infarction(Ed.:I,S,K)。