PAM14的细胞转染表达和定位
非小细胞肺癌间质上皮细胞转化因子14外显子跳跃突变的研究进展
非小细胞肺癌间质上皮细胞转化因子14外显子跳跃突变的研
究进展
刘艳萍;罗敏
【期刊名称】《临床医药实践》
【年(卷),期】2024(33)1
【摘要】近年来,随着肿瘤分子生物学研究的不断深入,以表皮生长因子受体为首的分子靶向治疗开启了晚期非小细胞肺癌(NSCLC)治疗的新篇章,患者总生存期(OS)得到显著延长。
间质上皮细胞转化因子(MET)14外显子跳跃突变作为非小细胞肺癌的潜在驱动基因引起人们的关注,MET 14外显子跳跃突变是NSCLC患者治疗的新靶点之一^([1])。
目前已有多种MET-络氨酸激酶抑制剂(TKIs)正在进行临床研究,包括克唑替尼、卡马替尼、替泊替尼、赛沃替尼和谷美替尼等。
本文讨论非小细胞肺癌的MET 14外显子跳跃突变的分子生物学、治疗方法及其发展中遇到的各种挑战。
【总页数】5页(P61-65)
【作者】刘艳萍;罗敏
【作者单位】南宁市第二人民医院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
【相关文献】
1.MET14外显子跳跃突变在非小细胞肺癌中的研究进展
2.间质上皮细胞转化因子扩增非小细胞肺癌患者的临床病理特征与预后分析
3.表皮生长因子受体20外显子插入突变的非小细胞肺癌靶向治疗研究进展
4.真实世界中MET14外显子跳跃突变晚期非小细胞肺癌的疗效分析
5.晚期非小细胞肺癌MET 14外显子跳跃突变的治疗新进展
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞如何做好转染实验及提高实验效率
细胞如何做好转染实验及提高实验效率①从健康细胞开始Ⅰ转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。
这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
Ⅱ仅使用活性>90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。
如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。
我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。
Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。
可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。
部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。
传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
②进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA(0.5–1 µg/µL)。
③转染时，请使用优质DNA。
Ⅰ使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
Ⅱ通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。
数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。
Ⅲ在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
PRRSV强弱毒感染PAM和Marc-145细胞入胞途径差异的研究
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘 要：猪繁殖与呼吸综合征（PRRS ）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）引起的猪场最重要传染病之一，给全世界养猪业造成了持续的经济损害。
减毒活疫苗免疫接种作为防控PRRS 的有效手段在全世界范围内得到广泛应用。
减毒活疫苗毒株是在猴源细胞系上连续传代获得的，导致其与亲本毒株在生物学特性上存在巨大差异，同时本实验室前期结果也提示HP-PRRSV 野毒株和疫苗毒株在入胞途径上可能存在差异。
Na +/H +交换的依赖是巨胞饮的标志性特征，阿米洛利（EIPA ）是Na +/H +交换的特异性抑制剂，细胞骨架重排在病毒的入胞过程中发挥重要作用，细胞松弛素D （Cyt D ）是肌动蛋白聚合的特异性抑制剂。
分别利用EIPA 和Cyt D 预处理PAM 和Marc-145细胞后接毒，对比强弱毒在两种细胞内病毒拷贝数、蛋白表达水平及子代病毒的释放上与空白对照组的差异。
结果表明，PRRSV 强弱毒均不利用巨胞饮途径感染Marc-145或者PAM 细胞，但强弱毒在感染不同细胞时对肌动蛋白的依赖性存在明显的区别。
本研究结果初步揭示了PRRSV 野毒株和疫苗毒株入胞过程的差异，为进一步揭示PRRSV 疫苗毒株致弱机制提供了前期基础。
关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；入胞途径；巨胞饮；肌动蛋白中图分类号：S858.28 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）04-0018-08Analysis of the Differences of the Entry Pathway of PAM and Marc-145 Infectedwith Highly Pathogenic and Attenuated PRRSVsZHU Haojie 1, GAO Fei 1, XU Jingjing 1, LIU Yuting 1, TONG Guangzhi 1, JIANG Yifeng 1, LI Guoxin 1,2(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for the Prevention andControl of Important Animal Infectious Disease and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)收稿日期：2021-01-02基金项目：国家生猪现代产业技术体系（CARS-35）；国家自然科学基金（31670158）作者简介：朱豪杰，男，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：李国新，E-mail：*****************.cn；姜一峰，E-mail：********************.cnPRRSV 强弱毒感染P AM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究朱豪杰1，高 飞1，徐晶晶1，刘宇婷1，童光志1，姜一峰1，李国新1,2（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州225009）2023,31(4):18-25Abstract: Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS), which caused by Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is considered as the most important infectious disease to the pig industry. Immunization is considered as an effective way to control PRRS all over the world. Live attenuated vaccine which obtained by continuous generation on Marc-145 cells was considered as the most effective vaccine, the generation on allogenic cell line resulting huge biological difference compaired with their parents strains including growth characteristic. Our previous results also showed that PRRSV fi eld strain and vaccine strain might have differences in the pathway of entry the cell. Na +/H + exchange is the key characteristic of macropinocytosis, Amiloride (EIPA) is the specific inhibitors of Na +/H +exchange, Cytochalasin D (Cyt D) was widely used to inhibited actin polymerzation. The PAM and Marc-145 cells were pretreated· 19 ·朱豪杰等：PRRSV 强弱毒感染PAM 和Marc-145细胞入胞途径差异的研究第31卷第4期猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种急性且高度传染的病毒性疾病。
百远生物 细胞角蛋白14抗体试剂说明书APA138
细胞角蛋白14抗体试剂说明书APA138【产品名称】通用名称：细胞角蛋白14抗体试剂英文名称：Anti Human CK14Monoclonal Antibody【检测原理】本抗体试剂基于抗原抗体特异性结合原理，样品组织经过抗原修复后，暴露抗原决定簇的目标靶蛋白与一抗结合，形成抗原与一抗的复合物。
然后加入HRP酶标多聚物二抗与一抗结合，最后二抗上的HRP催化DAB显色液中的H2O2分解，使联苯胺氧化变成联苯亚胺，使组织切片中抗原位点上出现棕色或棕褐色沉积物。
借助光学显微镜，通过观察颜色的变化以此判定目标抗原的表达情况。
【主要组成成分】细胞角蛋白14鼠源性单克隆抗体；缓冲液。
【储存条件及有效期】本产品2~8℃储存，有效期为12个月。
采用泡沫箱加冰袋密封的运输方式，时间不大于7天，开箱温度不超过30℃，产品性能无影响。
（使用时应即拿即用，使用后立即放回冰箱。
）【适用范围】适用于人工手动操作或全自动免疫组化染色机自动操作。
【样本要求】新鲜活检或10%中性福尔马林固定的病人组织，参照病理技术规范要求取材、固定（8-24小时为宜）、脱水、石蜡包埋并制成蜡块。
建议组织切片厚度为3~5μm，室温下保存并于10天内完成实验检测以确保组织中抗原分布情况的良好重现。
【使用方法】1.准备工作：1)仪器设备：电磁炉，不锈钢高压锅，孵育盒，计时器，免疫组化笔，移液器，全自动免疫组化染色机，光学显微镜等；2)溶液配制：PBS溶液（7.2-7.6）、抗原修复液、DAB显色液等，各溶液的配制可参见相关说明书；3)反应温度：室温（18℃~37℃）；4)抗体工作液：浓缩型抗体建议稀释比例1：100-1：400（注：该稀释比例为建议参数，实际使用时会由于实验室差异而有所不同，建议客户在使用前对该浓缩抗体进行检测，以确定最佳稀释度。
）；2.操作步骤：2.1.用于全自动免疫组化染色机：1)在软件上按照推荐的染色方案设制相应的染色程序；2)将抗体工作液（浓缩液按推荐稀释比例稀释后）放至相应的机用一抗开放容器中；3)打印切片信息标签，并将贴好标签信息的载玻片载入染色机；4)准备好相关实验耗材，将实验所需试剂放至仪器对应位置，并确认所有试剂余量充足；5)点击开始，运行染色程序；详细实验操作步骤及要求请参照全自动免疫组化染色机操作手册。
真核细胞常见表达载体
真核细胞罕见表达载体之马矢奏春创作真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对, 主要由CMVp启动子、兔β-球卵白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成, 在年夜大都真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因.更重要的是, 由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在, 转染细胞后, 用G418筛选, 可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株.拔出外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点.注意在此载体中有二个EcoR1位点存在.2、pEGFP, 增强型绦色荧光卵白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光卵白, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点, 将外源基因扦入这些位点, 将合成外源基因和EGFP的融合基因. 借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光卵白/人肌动卵白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光卵白和人胞浆β-肌动卵白基因, 在PCMV启动子驱动下, 在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成, 能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株.另外, 载体中的pUC origin 能保证该载体在年夜肠杆菌中的复制, 而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在年夜肠杆菌中的表达.用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合卵白, 该卵白能整合到胞内正在生的肌动卵白, 因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动卵白的亚细胞结构.4、pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的, 克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因, 故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株.5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动, 多克隆区域酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得注意的是, 该表达载体不含有neo基因, 转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株. 其他经常使用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ugpUC18 DNA 25 ugpUC19 DNA 25 ug说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点, 当外源DNA片段扦入, 转化lacZ基因缺乏细胞, 并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时, 含有外源DNA 载体的细胞将为白色菌落, 而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落, 由此易于筛选有无外源DNA片段的载体.另外, 这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序. 保管液: TE BufferTE Buffer组成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA用途:克隆外源DNA片断. 进行基因表达. 使用M13、T7和T3引物进行测序. 存在的问题细胞的生命活动是一个复杂的调控过程, 有些生命活动的机理还不完全清晰, 由于插人的目的基因分歧, 载体构建栗用的顺式组件分歧, 组装的空间位置分歧, 采纳的表达系统分歧, 目的基因表达水平和阳性克隆筛选率城市有很年夜不同.另外, 由于所有的顺式元件存在种属和组织特异性, 所构建的高效表达载体纷歧定在所有细胞株中均高效表达.再者, 细胞生长状态的不同, 转染方法的分歧培养时阉的长短, 筛选药物浓度的高低, 对表达量都有很年夜影响.所以, 需要综合评价一个表达载体和表达系统, 排除一些不定因素, 筛选出最佳组合真核表达载体趋向于既有利于扩增目的基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建.许多有效的应用范围广的强启动子和增强子被人发现并应用于载体中, 年夜年夜提高了目的基因的表达量, 另外一些强的组成型启动子, 如 SV40早期启动子+PHTLv, 已应用于年夜规模生产的细胞系中. 应用以GS为筛选标识表记标帜的表达载体可兼有筛选和扩增目的基因两种功能, 是目前研究的重点.以IRES连接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体.在同一启动子操纵下, 筛选基因或陈说基因与目的基因转录在同一mRNA上通过IRES的作用, 表达出两种卵白, 因而在理论上可认为, 通过了筛选或表达了陈说基因的克隆必为阳性克隆, 即表达目的基因的克隆, 有报道说这种双顺反子的共表达率为90％.这就年夜年夜提高了筛选率, 简化了实验过程. 将强启动子、增强子和可扩增的筛选标识表记标帜组装在同一载体上, 构建高效表达和筛选的表达载体并将其运用于最合适的表达系统中, 是现今真核表达载体构建研究发展方向.。
构建稳转细胞株命名
构建稳转细胞株命名
构建稳定细胞株是生物学研究中常见的实验操作，命名稳定细
胞株时需要考虑以下几个方面：
1. 表达载体或基因的命名，如果稳定细胞株是通过转染表达载
体或基因来构建的，可以在命名中包含表达载体的信息，比如
pCMV-EGFP稳定细胞株表示该细胞株是通过pCMV载体转染表达EGFP
基因构建的。
2. 细胞类型，稳定细胞株所使用的细胞类型也可以作为命名的
一部分，比如HEK293稳定细胞株表示该细胞株是在HEK293细胞中
构建的。
3. 转染方法，有时候稳定细胞株是通过特定的转染方法构建的，比如利用CRISPR/Cas9技术构建的稳定细胞株可以在命名中体现出来。
4. 蛋白功能或特性，如果稳定细胞株是用于研究特定蛋白的功
能或特性，可以在命名中体现出该蛋白的名称或功能，比如EGFP-overexpressing HEK293稳定细胞株表示该细胞株是用于过表达
EGFP蛋白的。
5. 序号或日期，为了区分不同的稳定细胞株，可以在命名中加入序号或日期信息，比如pCMV-EGFP-HEK293-1表示第一个构建的pCMV-EGFP稳定细胞株。
总之，在命名稳定细胞株时，需要清晰明了地体现出细胞株的基本信息，方便其他研究人员理解和识别。
同时，命名需要简洁明了，避免过于复杂的命名方式，以免造成混淆。
蛋白亚细胞定位方法
蛋白亚细胞定位方法
蛋白质的亚细胞定位是指确定蛋白质在细胞内的具体位置。
这对于理解蛋白质的功能和细胞生物学过程至关重要。
以下是一些常用的蛋白质亚细胞定位方法：
1. 免疫荧光技术：这是一种基于抗体特异性结合的方法。
通过使用针对目标蛋白质的特异性抗体，将其标记上荧光染料，然后观察荧光信号在细胞内的分布，从而确定蛋白质的亚细胞定位。
2. 荧光蛋白标记：将目标蛋白质与荧光蛋白（如GFP、RFP 等）融合表达，使其在细胞内发出特定颜色的荧光。
通过观察荧光的分布，可以确定蛋白质的亚细胞定位。
3. 细胞器特异性染料：使用细胞器特异性染料对细胞进行染色，然后观察目标蛋白质与这些染料的共定位情况。
例如，使用线粒体染料可以确定蛋白质是否定位于线粒体。
4. 免疫组织化学技术：该方法用于检测组织切片中的蛋白质定位。
通过使用针对目标蛋白质的抗体，将其标记上可见的染料，然后观察染料在组织切片中的分布。
5. 蛋白质相互作用分析：通过研究蛋白质与其他已知亚细胞定位的蛋白质之间的相互作用，可以间接推断目标蛋白质的亚细胞定位。
这些方法可以单独使用，也可以结合使用，以提高蛋白质亚细胞定位的准确性。
在进行蛋白质亚细胞定位研究时，需要选择合适的方法，并结合其他实验手段进行综合分析。
基质金属蛋白酶MMP—14与肿瘤侵袭转移的关系
基质金属蛋白酶MMP—14与肿瘤侵袭转移的关系【摘要】目前肿瘤是危害人类健康最严重的疾病之一。
肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤最重要也是最本质的生物学特征，是引起恶性肿瘤患者预后不良和死亡的主要原因。
据临床统计，有80%以上的肿瘤病人死于侵袭和转移⑴。
若没有侵袭和转移的发生，预后一般较好。
因此, 对肿瘤侵袭转移方面的研究可以为肿瘤侵袭转移的早期诊断和靶向治疗提供帮助和依据，正成为目前抗癌治疗研究的热点。
肿瘤的侵袭及远处转移是一个相当复杂的病理过程，与肿瘤细胞穿破细胞外基质(extraeellullaniatrix, ECM)屏障、血管壁基膜及进入宿主微环等过程密切相关【％大量实验证明，肿瘤细胞侵袭转移能力的强弱与其诱导产生的蛋白酶降解ECM 及基膜的能力密切相关，而基质金属蛋白酶(MMP)则是其最重要的一组蛋白酶［“】，在肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用［“】，成为近年来研究的热点。
【关键词】肿瘤侵袭转移MMP-14 ECM肿瘤的侵袭和转移是一个复杂的、多步骤的、多阶段的病理过程。
肿瘤细胞向周围组织运动时会遇到一系列的屏障，肿瘤细胞单靠自身运动能力是不能克服这些屏障的，需要依赖于某些能降解基质和基底膜成分的酶的共同作用冈。
ECM和基底膜的降解及破坏是肿瘤转移多阶段过程中的关键步骤之一，恶性肿瘤对这些结构的破坏需要多种酶的参与，其中基质金属蛋白酶类(MMPs)在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥着重要的作用。
MMPs是自然界进化中高度保守的一类酶，其广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中，是ECM降解过程中必不可少的酶，几乎能降解ECM的所有成分［刃。
它们是一组锌离子依赖性肽链内切酶，大小各异，底物不尽相同，能裂解维系蛋白结构的肽链，主要参与结缔组织的降解。
根据底物的特异性，序列的相似性及区域组成，脊椎动物的MMPs可分为六个亚群:(1)胶原酶：MMp — 1、MMp — 8、MMP 一13、MMp — 185,此类酶的主要特征为能够分解间质I、n、m型胶原，同时也可消化其它一些细胞外基质(ECM)成分及非ECM 分子。
干扰NBS1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并促进凋亡
ation,migraUon and iuvvsion by targeting TRAF5iu colorectalcaucegj].BiochemBiopyys Res Commun,2212,510(5)：799-7050[12]CHEN QY,DES MARAIS T,COSTA M.Dereaulatiov of SATB0iu carciuoyexesis with emppasis on miRNA-mediated control[J].Caniuoyexesis,258,45(3)：596-450.[07]PATEL Y,SONI M,AWGULEWITSCH A,et al.OverexpresUon ofmiU-489derails mamma/hierarchy structure and indibitsHER2/kex-induced tumo/gexesis[J].Odcoyexe,228,38(3):245-453.[13]ZHAO T,QIC B,ZHOU S,et al.Expression of DEK iu paucreaticcauces and Us correlation with clinicopatSoloyicai features andproyuosis[J]■8Caucer,2219,15(4)：910-909.[12]WEN Y,XU HN,PRIEETTE VIENEDGE L,et al.Optical ndopimaging detects the effects of DEK oncoyexe kuochkoou on theredop state of MDA-MB-050breast cauces cells[J].Mol Imaging BUU258,20(3)：412-48.[22]LIE L,PIAO J GAO W,et al.DEK oves expression as as inde-pexdext biomarkes for poos proyuosis iu colorectal cauces[J].BMC Cauces,2513,13：367.[20]李景阳，孙丽梅，徐慧，等・DEK蛋白在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J]现代肿瘤医学,2512,20(20)：3556-35590LI JY,SUN LM,XU H,et al.The clinical WgmUcadce of DEKproteiu expression iu uon-small cell lung cauces[J]•MoVeruOdcology,2212,24(20)：3556-3559.(编校：张西敏)干扰NBS1表达抑制肝癌HepG2细胞增殖并促进凋亡肖瑞雪1,魏飞力2,徐忠法1,甄亚男1InteCering NBS1expression匚血巾匚恰proliferation and promotes apoptosis of livet cancer HepG2celloXIKO Ruixue1,WEI FeiU,XU Zhongfu1,ZHEN Yansu11Thr Thirg J^filiated Hospitai of Shandong First Medicai Universito(Affiliated Hospital ep ShanOong Acalema of Medical Sciences P, ShanOong Jinan250031,China；1Beijing Huhe op Henatolopa,Beijing Youan Hospital,Capital Medical Unwersito,Beijing100067, China.【Abstrvct i Objective:To invesUgato the ekect of NBS1knochdown oo yrollra/od and apoptosis of HepG2ceks.Methodt：NBS1specific small interference RNA(siNBSl)was transfected into HepG2cells,performed using Lipc-fectamine2000,with empty liposome as coowO grovp■The expressioo of NBS1was detected by RT-PCR and Western blot.The HepG2cell yrolifera/od was detected bs CCK-8methoV,and cell apoptosis was analyzed bs usingFCM.R csu U s:DiRerent codcekWatiods of siNBS1(10nmol/P,20nmol/L,50nmol/P)conlU indibit the expression ofNBS1gene at mRNA level in HepG2cells(P<0.05or P<0.01)■The highest codcekWa/od of UNBS1(50nmol/L)conlU significantly indibit the expression of NSB)K-8assas demodsWateX that the yrolifera/od of HepG2cells in siNBSl grovp transfected with diNerent codcekWatiods of siNBSl was lowec than that of the coowO grovp(P<0.05or P<0.01), and the yrolifera/od rate decreased most significantly aftec44h of Wansfectioo.FCM revealed thatthe apoptosis rate increased significantly aftec Wansfectioo(P<0.05or P<0.01),and was related to the concenWa-tioo.Conclusion:1ndibikod of NBS1gene expression can significantly inhibit the yrolifera/od and promote apoptosisof HepG2ceks.【Key words】NBS1,RNA interference,HepG2ceks,cek pndfen/od,cek apoptosisMoVern Oncoloyy2021,29(11):1859-1871【摘要】目的:探讨干扰NBS1基因表达对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响。
广州细胞转染 rnaimax的si步骤
广州细胞转染 rnaimax的si步骤细胞转染是一种将外源基因导入细胞中的技术，通过这种方法，可以用siRNA或其他RNA介导的基因沉默技术，来研究特定基因的功能、亚细胞定位及其在生物系统中的信号转导等。
RNAMax是一种常用于细胞转染的转染试剂，可有效地将siRNA导入细胞内。
下面将简要介绍广州细胞转染RNAMax的siRNA步骤。
1.准备试验所需材料：-细胞培养基（适用于所研究的细胞系）- siRNA（目标基因特异性的siRNA）- Opti-MEM媒体（用于稀释siRNA和RNAMax）- RNAMax转染试剂- PBS缓冲液（用于洗涤细胞）-生长期细胞2.培养细胞：-将所研究的细胞系培养在适当的培养基中，使其达到合适的生长状态。
通常情况下，细胞培养应在37°C、5% CO2环境下进行。
3.制备适量siRNA：-根据所需要的浓度，稀释siRNA至合适的浓度。
-使用Opti-MEM媒体来稀释siRNA。
4.制备转染复合物：-将适量的Opti-MEM媒体稀释RNAMax转染试剂，使其溶液较为均匀。
-静置15-30分钟，使RNAMax和Opti-MEM媒体充分混合。
-加入稀释后的siRNA至转染试剂中，轻轻混合。
等待20-30分钟，使转染复合物形成。
5.转染细胞：-用PBS缓冲液洗涤细胞一次，将培养基换成Opti-MEM媒体（不含血清）-加入制备好的转染复合物至细胞培养基中，轻轻摇动培养皿，使复合物均匀地分布于细胞上。
-在37°C、5% CO2条件下，孵育细胞。
6.细胞处理：-经过一定时间的孵育，用合适的实验方法检测转染效率，如荧光显微镜观察草图蓝染色，定量PCR或Western blot分析等。
细胞转染RNAMax的过程实际上就是将RNAMax转染试剂与siRNA 相互作用形成转染复合物，然后将该复合物与细胞进行接触，借助RNAMax的转染效果导入细胞中。
通常情况下，细胞转染RNAMax的siRNA步骤可在2-4小时内完成。
mlom14细胞株特点
mlom14细胞株特点
ML-14细胞株是一种源自于大鼠脑内皮细胞的细胞株，具有以下特点：
1. 永生性：ML-14细胞株是一种永生细胞系，这意味着它们可以在培养条件下无限繁殖，为科学研究提供了稳定的细胞来源。
2. 内皮细胞特性：ML-14细胞株保持了内皮细胞的特性，可以用于研究血管内皮细胞的生理和病理过程，例如血管生成、炎症反应等。
3. 易于培养：ML-14细胞株在体外培养条件下易于生长和增殖，适合用于各种实验研究。
4. 基因和蛋白质表达：ML-14细胞株在基因和蛋白质表达方面具有一定的特点，可以帮助研究脑内皮细胞的特定功能和分子机制。
5. 应用广泛：由于ML-14细胞株的上述特点，它们在神经科学、血管生物学、药理学等领域都有广泛的应用。
请注意，这些特点可能会因实验条件、细胞培养条件等因素而有所不同。
在具体研究中，还需要根据实验需求和目的进行适当的验证和表征。
上海细胞转染 rnaimax的si步骤
上海细胞转染rnaimax的si步骤在上海，细胞转染是一种比较常见的实验技术，可用于将siRNA引入细胞中，为研究基因功能提供了有力的手段。
在细胞转染rnaimax 的si 步骤中，需要注意以下几点。
1. 培养细胞：在进行细胞转染前，需要培养好细胞，并将其分装到相应的培养皿中。
通常情况下，选用的细胞应该呈现良好的生长状态，且需要在适宜的时间点进行转染操作。
2. 制备siRNA：在进行细胞转染的过程中，需要首先制备好siRNA。
siRNA的制备过程包括设计siRNA序列、合成siRNA、检测siRNA质量等步骤。
在这个过程中，需要严格控制siRNA的纯度、浓度和稳定性，以保证其在细胞内的有效性和安全性。
3. 准备细胞转染试剂：在进行细胞转染操作前，需要准备相应的转染试剂。
rnaimax 是一种常用的细胞转染试剂，能够有效地将siRNA引入到细胞内。
在准备rnaimax 试剂的过程中，需要按照厂家提供的说明书进行操作，以保证实验的准确性和稳定性。
4. 细胞转染操作：在进行细胞转染操作时，需要将制备好的siRNA 和rnaimax 试剂混合，形成一个转染复合物。
然后，将复合物倒入到培养皿中，轻轻地摇晃培养皿，使其均匀分布在细胞上。
在转染操作时，需要注意转染复合物的浓度、用量和时间等参数，以避免过度转染或者转染不足的问题。
5. 细胞处理：在细胞转染后，需要对细胞进行相应的处理。
通常情况下，处理方法根据实验需求而定，可包括药物处理、光学显微镜观察、RT-PCR检测、Western blot检测等。
在处理细胞时，需要注意实验条件的控制，以保证实验的准确性和可重复性。
总的来说，在上海进行细胞转染rnaimax 的si 步骤中，需要充分注意实验细节，严格控制实验参数，以获得可靠的实验结果。
同时，为了确保实验的成功，建议选择专业的实验室进行技术服务，以获得最佳的转染效果和数据结果。
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤
基因编辑技术CRISPRCas9的详细操作步骤基因编辑技术CRISPR-Cas9是一种革命性的工具，能够精确切割和修改DNA 序列。
它已被广泛应用于实验室研究、农业、医学和生物技术领域。
CRISPR-Cas9的操作步骤分为设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选、验证等几个阶段。
以下是基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤：1. 设计目标序列首先，确定要编辑的基因序列。
识别目标区域，通常选择高度保守的DNA 区域，以最大程度减少非特异性修饰。
目标序列的设计需要遵循一些规则，例如避免重复、剪切酶的PAM序列靠近目标区域等。
2. 构建修饰体根据设计的目标序列，构建CRISPR修饰体。
修饰体通常由CRISPR核酸（包括crRNA或sgRNA）和Cas9核酸组成。
crRNA（或sgRNA）负责定位到目标序列，Cas9则负责剪切目标序列。
合成修饰体的DNA或RNA序列后，可以使用PCR扩增或化学合成的方法得到修饰体。
3. 细胞转染将构建好的修饰体转染至目标细胞中。
转染可以选择不同的方法，例如化学法、电穿孔法、超声波法或病毒载体等。
转染后，修饰体会逐渐进入目标细胞，并开始作用于基因组。
4. 筛选在转染后，大部分细胞仍然具有未被编辑的基因组。
为了筛选出完成编辑的细胞，可以使用筛选方法。
最常用的方法是通过引入荧光蛋白标记的修饰体，利用流式细胞术或显微镜检查标记的细胞。
5. 验证对于筛选出来的细胞，需要进行进一步的验证。
最常用的方法是通过测序确认基因组是否发生了预期的编辑。
此外，也可以使用T7E1酶切或限制性内切酶消化等方法，进一步验证编辑效果的准确性。
总结起来，基因编辑技术CRISPR-Cas9的详细操作步骤包括设计目标序列、构建修饰体、细胞转染、筛选和验证等几个阶段。
通过遵循这些步骤，研究人员可以实现对目标基因组的精确编辑，进而揭示基因功能、治疗遗传疾病，并在农业和生物技术领域开拓新的应用前景。
体外转染荧光素酶mrna
体外转染荧光素酶mrna
体外转染荧光素酶（Luciferase）mRNA是一种常见的实验技术，用于研究基因表达和蛋白质合成。
体外转染是将外源DNA或RNA导
入细胞以实现基因转染或蛋白质表达的过程。
荧光素酶mRNA编码着
荧光素酶，可以通过添加荧光素底物来测定其活性，从而间接测定
转染效率或基因表达水平。
在进行体外转染荧光素酶mRNA实验时，首先需要准备荧光素酶mRNA。
这可以通过体外转录或商业购买获得。
接下来，需要选择合
适的细胞系进行转染。
常用的细胞系有HEK293、CHO、Hela等。
然后，将荧光素酶mRNA与适当的转染试剂（如脂质体试剂或聚合物试剂）混合，形成复合物，然后将其加入到细胞培养基中与目标细胞
共培养一段时间。
转染时间和复合物的浓度需要进行优化，以确保
最佳的转染效率和细胞存活率。
在转染结束后，可以利用荧光素酶底物（如D-luciferin）来
检测荧光素酶的活性。
通过测定荧光素酶的荧光产生情况，可以间
接测定转染效率或基因表达水平。
此外，还可以利用荧光显微镜或
荧光素酶报告基因系统来观察和记录荧光素酶的表达情况。
需要注意的是，体外转染荧光素酶mRNA实验需要严格控制实验条件，包括转染试剂的选择和浓度、转染时间、细胞密度等因素。
另外，还需要进行适当的对照实验，以验证实验结果的可靠性和准确性。
总之，体外转染荧光素酶mRNA是一种常用的实验技术，可以用于研究基因表达和蛋白质合成。
通过合理设计实验方案和严格控制实验条件，可以获得可靠的实验结果，为相关研究提供重要的数据支持。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法转染，是将外源性基因导入细胞内的一种特地技术。
随着基因与蛋白功能讨论的深化，转染目前已成为试验室工作中常常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法许多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
抱负细胞转染方法，应当具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的预备程序简单，经常对细胞类型有很强的选择性，在一般试验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采纳哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素许多，从细胞类型、细胞培育条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
一、细胞传代1. 试验预备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培育皿，离心管。
2. 弃掉培育皿中的培育基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟(37℃，5%CO2 )。
用手轻拍培育瓶壁，观看到细胞完全从壁上脱落下来为止。
4. 加入1ml的含血清培育基终止反应。
5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
6. 将培育液装入离心管中，1000rpm离心5min。
7. 用培育液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培育皿。
8. 将合适体积完全培育液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培育皿中，使其匀称分布。
9. 将培育皿转入CO2培育箱中培育，其次天转染。
二、细胞转染1. 转染试剂的预备① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
CD163_基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究
张健, 吴珍芳, 杨化强. CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究[J]. 华南农业大学学报, 2023, 44(3): 333-339.ZHANG Jian, WU Zhenfang, YANG Huaqiang. Resistance to blue ear disease and production performance assessment of CD163 gene-edited Large White pigs[J]. Journal of South China Agricultural University, 2023, 44(3): 333-339.CD163基因敲除大白猪的抗蓝耳病性能和主要生产性能研究张 健 ，吴珍芳，杨化强(岭南现代农业科学与技术广东省实验室 云浮分中心/广东中芯种业科技有限公司, 广东 云浮 527400)摘要: 【目的】运用CRISPR/Cas9基因编辑技术和体细胞核移植技术获得CD163基因全敲除(CD163 gene knockout ，CD163-KO)的克隆猪，验证该基因敲除大白猪的抗蓝耳病特性，并研究其与野生型大白猪在生理、生产和繁殖性能等方面的差别，评估CD163-KO 大白猪的主要生产性能。
【方法】用猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus ，PRRSV)流行毒株NADC30-like 对本研究所获得的11头CD163-KO 大白猪和5头年龄、体质量相当的野生型大白猪进行攻毒试验。
连续14 d 观察猪的临床症状，记录直肠温度变化，检测血清中PRRSV 病毒含量和抗体水平。
14 d 后取肺部组织进行切片，通过PRRSV 免疫荧光试验观察肺脏感染情况。
采集CD163-KO 和野生型大白猪肺泡巨噬细胞进行免疫染色，观察肺泡巨噬细胞表面CD163蛋白的表达情况；采集猪外周血单核细胞进行诱导分化，观察CD163-KO 与野生型大白猪诱导分化的巨噬细胞对血红蛋白−结合珠蛋白复合物的摄取情况。
PAM14的细胞转染表达和定位的开题报告
PAM14的细胞转染表达和定位的开题报告一、研究背景与意义PAM14是一种属于人类ILL节点超家族的蛋白，能够参与到线粒体重要的电子传递链上，在细胞内起到重要的能量代谢作用。
因此，他在细胞代谢和能量转换中的作用备受研究关注。
近年来研究表明，PAM14在多种肿瘤细胞中表达升高，并参与肿瘤生长和转移，因此也被称为“肿瘤蛋白”，因此对于PAM14的功能和特性的研究，对于深入了解线粒体在细胞代谢和发育中的作用机制，以及对于肿瘤生长和转移的影响具有深远的意义。
二、研究目的1.通过质粒控制，进行基因工程的技术手段，构建PAM14的表达质粒。
2.将构建好的表达质粒转染到细胞中，利用荧光素酶等分析手段，检测PAM14的表达情况。
3.利用荧光检测和细胞成像技术，研究PAM14在细胞中的定位和转移。
三、研究内容和方法1.表达质粒的构建：从人类细胞中扩增PAM14基因序列，利用PCR扩增技术，并将PCR产物切割成预测大小的DNA片段，与表达载体连接。
然后通过酵母菌或者大肠杆菌等细胞进行重组，筛选得到含有PAM14基因的表达质粒。
验证质粒是否正确，可以通过PCR，限制性酶切，测序等方法进行验证。
2.细胞转染表达：将构建好的表达质粒显微注射至目标细胞，或利用通过某些生理过程将质粒进入到目标细胞内。
将转染后的细胞分为转染组、阴性对照组以及空白对照组，利用荧光素酶、蛋白质分离和西方印迹等方法分别分析并比较细胞间PAM14的表达情况。
3.细胞成像技术：利用荧光或者电子显微镜等技术将转染后细胞进行成像，并进一步研究PAM14在细胞内的定位和转移等现象。
四、研究预期结果1.成功构建含有PAM14基因的表达质粒，并通过验证，确保质粒可以用于表达PAM14蛋白。
2.通过细胞转染，成功将表达质粒转入目标细胞，并成功对PAM14蛋白进行表达，并可以用荧光素酶和西方印迹等技术进行表达情况检测和分析。
3.利用荧光和电子显微镜技术，观察得到PAM14在细胞内的定位和转移。
整理)慢病毒稳转细胞株步骤之欧阳数创编
稳转慢病毒一、所需试剂1、慢病毒载体（详细信息见附录及《质粒的扩增提取》）（大肠杆菌-80℃保存2-3年，质粒-20℃保存2-3年，病毒液-80℃保存1年）（1）载体质粒：两端的LTR、剪切位点、包装信号Ψ以及抗性或荧光基因、gag基因5′端350bp的序列及位于env 序列中的RRE，含宿主RNA聚合酶识别部分（2）包装质粒（psPAX2）：包含了pol、gag包装成分（3）包膜质粒（pMD2.G）：用其他病毒的包膜蛋白代替了env基因.三种质粒共同转染产生不具有自我复制能力的病毒载体。
2、包装细胞：293T细胞3、菌株：大肠杆菌，用于提取质粒4、转染试剂：XTREME-GENE（-20℃保存，不可分装），一种脂质与其他组份构成的混合物5、浓缩试剂（配好后4℃保存，原材料室温保存）：5X PEG8000/NaCl溶液（聚乙二醇）：NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在200ml Milli-Q纯水中，高压蒸汽灭菌**也可直接从公司买来病毒液（-80℃封口膜封口冻存管保存，4℃保存3天）：滴度一般为108TU/ml6、10mg/ml polybrene（-20℃分装保存）：溴化己二甲铵。
是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10 倍。
有一定细胞毒性，需要摸索浓度（1～10μg/ml）7、无血清培养基：optimen8、贴壁细胞（复苏后3代以上的细胞）9、puromycin：嘌呤霉素，用于筛选稳转细胞二、具体步骤<一>病毒包装与收集（中皿，转染步骤类似于瞬转）第一天1、种板，10×105个293T细胞，加入全培养基双抗DMEM 4-5ml，过夜2、配制5X PEG8000/NaCl溶液称取NaCl 8.766 g; PEG8000 50g溶解在200ml Milli-Q纯水中；121摄氏度 30min 湿热灭绝 30min；保存在4℃第二天1、配管A+B混合室温静置20min2、加入2ml全培养基DMEM3、将1加入2，孵育10h，换成5ml全培养基第四天第五天：1、9:00和17:00各收取一次5ml培养液，共20ml（-80℃保存）2、过滤：用孔径为0.45mm的过滤器除去上清中的293T细胞3、加入5ml 5XPEG8000/NaCl溶液，每30min-1h上下摇匀一次4、4℃过夜第六天1、4℃，3500rpm，20min2、弃上清，倒扣纸上静置1-2min，吸干残余液体3、加入120-150μl PBS，缓慢吹打，以防形成气溶胶4、50μl分装，-80℃保存。
【高中生物】转染实验常用的报告基因
【高中生物】转染实验常用的报告基因报告基因(reportergene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。
把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
作为报告基因，在遗传选择、筛选和检测中必须满足以下条件：（1）已确定并确定了整个序列；（2）受体细胞中不存在表达产物，即没有背景，转染细胞中也没有类似的内源性表达产物；（3）表达产物可以定量测定。
在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种：胭脂碱合酶基因（NOS）、章鱼碱合酶基因（OCs）nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(agrobacteriumtumfaciens)的ti质粒特有的，对ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。
新霉素磷酸转移酶基因ⅱ), 氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）荧光素酶基因（luciferasegene）该酶于1985年从北美萤火虫和头甲虫的cDNA文库中提取。
它在ATP、Mg2+、O2和荧光素存在下发出荧光。
这样，就可以用X射线胶片或专用仪器直接检测整个工厂或工厂的一部分。
它具有检测速度快、灵敏度比cat高30～1000倍、成本低、无需使用放射性同位素等优点。
β-d-葡萄糖苷酶基因这种酶催化底物生成β-D-葡萄糖苷酸，在植物中几乎没有背景，其组织化学检测非常稳定。
可通过分光光度法和荧光法进行检测。
除此之外还有庆大霉素转移酶基因等在动物基因表达调控的研究中，使用了以下报告基因：绿色荧光蛋白（gfp）基因等。
绿色荧光蛋白来自海蜇。
其基因可以在异源组织中表达并产生荧光。
gfpcdnad的开放阅读框长约740bp，编码238个氨基酸残基。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
１ ． ３ ． １ 载体 构 建
以 含人 Ｐ Ａ Ｍ１ ４全 长 ｃ Ｄ Ｎ Ａ序 列
中 图分 类 号
文献标识码 Ａ 文章编号 １ ０ ０ ０—１ ４ ９ ２ （ ２ ０ ０ ７ ） ０ ６— ０ ６ ３ ８— ０ ４
的质粒 ｐ Ａ Ｃ Ｔ ２ 一 Ｐ Ａ Ｍ１ ４为 模 板 ， Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 Ｐ Ａ Ｍ１ ４基 因 片段 （ 正 向引物 ： ５ 一 Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ Ｃ Ａ ｒ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ ｒ Ｇ Ｇ Ａ Ｃ 一 ３ ； 反 向引物 ： ５ 一 Ｇ Ｇ Ａ Ａ ｒ Ｉ － Ｉ ＇ Ｃ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｇ Ａ Ｃ Ｔ Ｃ Ｇ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ 一 ３ ） ， 回收 Ｐ Ｃ Ｒ产 物 并 用 Ｂ ａ ｍ Ｈ Ｉ 和Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ双 酶切 ， 再 次 回 收 酶 切 片段 ， 与 Ｂ ａ ｍ Ｈ
司； Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ培养基为 Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ 产品 ； 小牛血清购 自杭州 四季 青生 物 工程材 料 有 限公 司 ； Ｇ Ｆ Ｐ一 抗 购 自 Ｓ ａ ｎ ｔ ａ
Ｃ ｒ ｕ ｚ 公司； Ｅ Ｃ Ｌ显 色试 剂盒 是 Ｐ ｉ ｅ ｒ ｃ ｅ 公 司产 品 ； 引物
为 上海 生工 生物 工程 技术 有 限公 司合成 。其他试 剂 为 国产 分析 纯或 符合 实验 要求 。
粒， Ｂ ａ ｍＨ Ｉ 和Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ 双 酶切 鉴 定后 ， 送 上 海生 工 生
域 … 。研究 显示 Ｐ Ａ Ｍ１ ４能 与 ＭＯ Ｒ Ｆ ４ ／ ＭＲ Ｇ 家族 蛋
白以及肿瘤抑制蛋 白 Ｒ ｂ结合 ， 从而表明 Ｐ Ａ Ｍ １ ４可 能参与细胞生长、 永生化以及衰老等生命过程 ］ 。
Ｒ ３ ４ １ ；Ｒ ３ ９ ４ ． ２
性 内切 酶 、 Ｔ ，
Ｄ Ｎ Ａ Ｍａ ｒ ｋ ｅ ｒ 及 蛋 白 Ｍａ ｒｋ ｅ ｒ均 为 Ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｓ 公 司 产
品； 胶 回收 （ 小量） 试剂 盒 购 自北 京 道 普 生物 科 技 有 限公司 ； 质粒大量 抽提纯 化试剂盒 购 自 Ｑ ｉ ａ ｇ ｅ ｎ公
Ｐ Ａ Ｍ１ ４ （ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ａ ｓ ｓ ｏ ｃ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ＭＲ Ｇ，１ ４ ｋ ｕ ） 是
一
种与 Ｍ Ｒ Ｇ基 因家 族 和 Ｒ ｂ蛋 白相 关 的 蛋 白¨ － ２ ］ 。 含１ ２ ７个氨 基酸 残基 的 Ｐ Ａ Ｍ１ ４蛋 白 ， 具有 高 度 的保 守性 ， 其 蛋 白质 结 构 中 含 有 一 个 卷 曲 螺 旋 结 构
维普资讯
・
６ ３ ８。
安徽 医科大 学学报
Ａ ｃ ｔ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ａ ｌ ｉ ｓ Ａ ｎ ｈ ｕ ｉ ２ ０ ０ ７ Ｄ ｅ ｃ ； ４ ２ （ ６ ）
Ｐ Ａ Ｍ１ ４的细胞转染 表达和定位
Ｐ Ａ Ｍ１ ４基 因全 长 ｃ Ｄ Ｎ Ａ序 列 共 ３ ８ １ 个碱基对 ， 编 码
Ｉ 和Ｅ ｃ ｏ Ｒ Ｉ双酶切 后 的 ｐ Ｃ Ｄ Ｇ Ｆ Ｐ载 体 在 １ ６ ℃ 下 用 Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａ连接 酶连 接 过夜 。次 日将 适 量 的连 接 产 物 转化 ， 挑取 阳性 克 隆 后 摇 菌 ， 碱 裂 解 法 小 量 抽 提 质
为 了探讨 Ｐ Ａ Ｍ１ ４的功 能 ， 我们 在 克隆这 一 基 因的基 础上 构 建 了带 Ｇ Ｆ Ｐ标 签 的表 达 载 体 ｐ Ｃ Ｄ Ｇ Ｆ Ｐ — Ｐ Ａ Ｍ１ ４ ， 并将 其 转染 ＨＥ Ｋ ２ ９ ３ Ｔ细 胞 和 Ｃ Ｏ Ｓ ７细胞 ， 对Ｐ Ａ Ｍ１ ４在 细胞 内 的表 达 和定 位 进 行 了初 步 的 研
张庆 慧 ， 汪云 飞 ， 朱 恒锐 ， 刘 晓颖 ， 范礼 斌
摘要 目的 构建带 Ｇ Ｆ Ｐ标 签 的 Ｐ Ａ Ｍ１ ４表达 载体 ， 将其 转
细胞 系本 实验 室保存 。 １ ． ２ 主要 试 剂 Ｔ ａ ｑ酶 为 Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ产 品 ； 各 种 限 制
染至 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３ Ｔ细 胞 检 测其 表达 ， 转染至 Ｃ Ｏ Ｓ ７细 胞 观察 Ｐ Ａ Ｍ１ ４蛋 白在 细胞 内的定 位。方 法 以含人 Ｐ Ａ Ｍ１ ４全长 ｃ Ｄ Ｎ Ａ序列 的质粒 ｐ Ａ Ｃ Ｔ ２ － Ｐ Ａ Ｍ１ ４为模 板 ， 用 Ｐ Ｃ Ｒ方 法扩 增 Ｐ Ａ Ｍ１ ４全长 序列 ， 然后 插 入带 Ｇ Ｆ Ｐ标 签 的载 体 ｐ Ｃ Ｄ Ｇ Ｆ Ｐ中 构建表 达 载体 ｐ Ｃ Ｄ Ｇ Ｆ Ｐ — Ｐ Ａ Ｍ１ ４， 将构 建 的质 粒转染 至 ＨＥ Ｋ ２ ９ ３ Ｔ细 胞 ， 提 取 总 蛋 白， 进 行 Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ － ｂ ｌ ｏ ｔ检 测 ； 转 染 至 Ｃ Ｏ Ｓ ７细胞 ， 在荧 光显微镜下 观察 其细 胞定 位。结 果 成 功 构建了表达 载体 ｐ Ｃ Ｄ Ｇ Ｆ Ｐ － Ｐ Ａ Ｍ１ ４， 此 表达 载体 在 Ｈ Ｅ Ｋ ２ ９ ３ Ｔ 细胞 中能够有效表达 ， 转染表明 Ｐ Ａ Ｍ１ ４在 Ｃ Ｏ Ｓ ７细胞主要在 核 内表达 ， 胞质内也有少量表达 。结论 主题词 自由词 实验结果为进 一步 了解 Ｐ Ａ Ｍ１ ４的功能提供 了一定 的基础 。 基 因表达 ； 转染 ； 印迹法 ， 蛋 白质 Ｐ Ａ Ｍ１ ４ ； 细胞定位
究。 １ 材 料与 方法
物工 程技 术有 限公 司 测 序 。经 测 序 确 定 正 确后 ， 大
量抽 提 质粒 。
１ ． ３ ． ２ 细胞培养 转染前 ２ ４ ｈ ， 用胰酶消化细胞 ， 以（ １～２ ）×１ ０ ／ ｃ ｍ 密 度 重 新 种 人 加 入 Ｄ ＭＥ Ｍ 的