生物分离工程-第七章 各种亲和分离方法2009

特异性洗脱利用含有与亲和配 基或目标产物具有亲和结合作用的 小分子化合物为洗脱剂，通过与亲 和配基或目标产物的竞争性结合， 脱附目标产物。特异性洗脱条件温 和，有利于保护目标产物的生物活 性。另外，由于仅特异性洗脱目标 产物，对于特异性较低的亲和体系 或非特异性吸附较为严重的物系， 特异性洗脱有利于提高目标产物的 纯度。
7. 过渡金属离子 Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通过 与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺 （TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表 面，用做亲和吸附蛋白质的配基。 这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为 金属螯合色谱（metal chelate chromatography） 或固定化金属离子亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography，IMAC）。
2. 环氧基活化法 可用于固定分子结构为R-NH2、R-OH和R-SH 的配基。常用的活化试剂为1,4-丁二醇-二缩水 甘油醚（BGE）和环氧氯丙烷。 以活化羟基为例：

或引入活性基团环氧基后，可采用下述直接法 或间接法（氧化法、碳二亚胺法、戊二醛法） 固定配基。
3. 硅胶的活化 活化硅胶常采用硅烷化试剂，如γ-氨丙基三甲 （乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：
5. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。 辅 酶 主 要 有 NAD （ nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和 ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可 用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP （ adenosine 5'-monophosphate ） 、 ADP （adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷部分与 上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配 基。
3. A蛋白 protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具 有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc 片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋 白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的 结合常数有所不同。 A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合 能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免 疫复合体。
1.3 亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其 从混合物中高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配 基（ligand），用L表示。


Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～ 108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。
第七章 各种亲和分离方法
内容简介
生物亲和作用 亲和色谱 膜亲和过滤法 亲和双水相萃取 亲和反胶团萃取 亲和沉淀 磁性亲和分离

第一节 生物亲和作用

生物亲和作用的本质 影响亲和作用的因素 亲和作用体系


1.1 生物亲和作用的本质
生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作 用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化 （affinity purification）。 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞细胞。
第三节 膜亲和过滤法
自20世纪80年代中期以来，把亲和色谱技术和 膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲 和过滤方法 。 膜亲和过滤方法包括两个分支： 亲和膜分离技术 亲和错流过滤

3.1 亲和膜分离 原理和特点 亲和膜（affinity membrane）是利用亲和配 基修饰的膜。 亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯 化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变 型 。 又 称 膜 亲 和 色 谱 （ membrane-based affinity chromatography）。
目标产物的非特异性洗脱
非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强 度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲 和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合 力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产 物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发 生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些 变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不 可逆变性，需慎重使用。

引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基 可发生二醇化反应：
4. 间隔臂 当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由 于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效 的亲和吸附作用。 这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂（spacer）”， 使其发生有效的亲 和结合。
图5-2 间隔臂的作用
亲和过滤的优点 ①以压差为传质推动力，速度快，易于放大； ②微孔膜种类多且价格便宜； ③无内扩散传质阻力，仅仅存在表面液膜传质阻 力。 亲和过滤的缺点 与固定床型亲和色谱相比，亲和过滤操作中目 标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行， 最多只能达到一级吸附平衡，相当于色谱过程 的一个理论塔板。采用多级串联亲和过滤操作 可弥补这一缺点。
第二节 亲和色谱
亲和色谱的特点 ①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高

2.1 亲和色谱株的制备
亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的， 需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定 相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀 豆球蛋白A（一种植物凝集素）。 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化 的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的 需要，有必要自制亲和吸附介质。
（3）. 抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍（guanidinohydrochloric acid）的存在可 抑制氢键的形成。 （4）. 温度 温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减弱；疏 水性相互作用增强 。 （5）. 离液离子 在SCN－，I－和ClO4－等离液阴离子存在下，疏水相 互作用降低。 （6）. 螯合剂 如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配 位键，加入乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会 使亲和作用消失
8. 组氨酸 组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和 疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。 在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液 中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度增大，亲和吸附作用降低。
9. 肝素 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、 肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5 至30 kD，具有抗凝血作用。 肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核 酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和 作用，可用作这些物质的亲和配基。 肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液 中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。


部分商品化的色谱填料见表。
表 部分商品化的色谱填料
载体的活化和配基的连接

亲和配基的固定化方法

介质的活化
1. 溴化腈活化法 用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的 配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载 体的活化在碱性（pH＞10）条件下数分钟即可 完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行， 一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：
在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的 双环氧化合物起间隔臂的作用。 事实上，除CNBr活化法外，其他活化法都引入 了不同的活性基团，这些活性基团如果有适当 的长度，都可起到间隔臂的作用。 利用CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先 引入ω-氨基已酸或1,6-二氨基已烷后再用相应的 方法固定配基。 引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂 超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又 会减弱。
4. 凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质 （酶和抗体除外）的总称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可 用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的 分析、纯化。pH＜5.6时con A为二聚体，分子 量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为 102 kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键 结合。因此，在利用con A为配基的亲和色谱 操作中，操作条件应当适宜。
表 常用的亲和作用体系
特异性 高特异性 亲和作用体系 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）

具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和 “锁孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键


氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格制约
1.2 百度文库响亲和作用的因素
（1）. 离子强度 离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互 作用等。 （2）. pH -羧基的pKa＝3.4～3.8 -羧基的pKa＝3.9～4.0 -氨基的pKb＝7.4～7.5 -氨基的pKb＝10.0～10.4 影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。

2.2 影响亲和吸附的因素

杂质的影响
料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质 的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材 料、配基固定化方法等众多因素相关

料液流速
流速的增大，分离速度加快，但柱效降低
2.3 亲和色谱洗脱方法
特异性洗脱法 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合 作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲 和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产 物。 例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定 化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进 行洗脱。

亲和色谱填料载体
亲和色谱的理想载体应具有下列特性： ①不溶性； ②渗透性； ③高硬度及适当的颗粒形式； ④较好的化学稳定性； ⑤抗微生物和酶的侵蚀； ⑥最低的吸附力； ⑦亲水性； ⑧具有大量的供反应的化学基团。

常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如葡 聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的。 近年来，为了满足快速高效分离的需要，以多 孔硅胶和合成高分子化合物为载体的高效AFC 色谱填料，得以迅速发展。 亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体 （carrier、support）的选择、载体的活化和配 基的连接。
群特异性
亲和配基
1. 酶的抑制剂 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸 和赖氨酸等。 2. 抗体 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱 （immunoaffinity chromatography）。抗体与抗 原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。 因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质 类生物大分子的有效手段。
亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的方式， 才能保证色谱柱的处理量（柱高压力过大，容易破坏 胶珠）。 如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径可即 “短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速度。


亲和配基固定 在膜孔表面， 流体在对流透 过膜的过程中 目标蛋白质与 配基接触而被 吸附。
图 5-5 亲和膜吸附原理示意图
6. 三嗪类色素 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色 谱（Dye-ligand affinity chromatography）。 Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染 料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟 色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外， 三嗪类色素还与血清白蛋白、 干扰素、核酸酶和糖解酶 等具有很高的亲和力。 Cibacron Blue F3GA ：