生物分离工程-第七章 各种亲和分离方法2009

2.2 影响亲和吸附的因素

杂质的影响
料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质 的非特异性吸附，会大大降低纯化效果 杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材 料、配基固定化方法等众多因素相关

料液流速
流速的增大，分离速度加快，特异性洗脱法 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合 作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲 和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产 物。 例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定 化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进 行洗脱。

引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基 可发生二醇化反应：
4. 间隔臂 当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由 于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效 的亲和吸附作用。 这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂（spacer）”， 使其发生有效的亲 和结合。
图5-2 间隔臂的作用
群特异性
亲和配基
1. 酶的抑制剂 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸 和赖氨酸等。 2. 抗体 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱 （immunoaffinity chromatography）。抗体与抗 原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。 因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质 类生物大分子的有效手段。
1.3 亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使其 从混合物中高选择性地分离纯化。 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配 基（ligand），用L表示。


Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～ 108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。
亲和过滤的优点 ①以压差为传质推动力，速度快，易于放大； ②微孔膜种类多且价格便宜； ③无内扩散传质阻力，仅仅存在表面液膜传质阻 力。 亲和过滤的缺点 与固定床型亲和色谱相比，亲和过滤操作中目 标分子与亲和过滤介质的接触在全混槽中进行， 最多只能达到一级吸附平衡，相当于色谱过程 的一个理论塔板。采用多级串联亲和过滤操作 可弥补这一缺点。
目标产物的非特异性洗脱
非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强 度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲 和吸附作用，是较多采用的洗脱方法。当亲和结合 力很大，利用通常的方法不能洗脱被吸附的目标产 物时，可利用脲或盐酸胍等变性溶液使目标产物发 生结构变化，失去与配基的亲和结合作用。但这些 变性剂容易使目标产物或固定化配基发生失活或不 可逆变性，需慎重使用。

具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和 “锁孔” 的空间结构关系。 亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键


氢键的产生与否受结合部位之间的位置关系的严格制约
1.2 影响亲和作用的因素
（1）. 离子强度 离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互 作用等。 （2）. pH -羧基的pKa＝3.4～3.8 -羧基的pKa＝3.9～4.0 -氨基的pKb＝7.4～7.5 -氨基的pKb＝10.0～10.4 影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。
第七章 各种亲和分离方法
内容简介
生物亲和作用 亲和色谱 膜亲和过滤法 亲和双水相萃取 亲和反胶团萃取 亲和沉淀 磁性亲和分离

第一节 生物亲和作用

生物亲和作用的本质 影响亲和作用的因素 亲和作用体系


1.1 生物亲和作用的本质
生物分子间的特异性相互作用称为生物亲和作 用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化 （affinity purification）。 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞细胞。
6. 三嗪类色素 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色 谱（Dye-ligand affinity chromatography）。 Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成染 料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模拟 色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶外， 三嗪类色素还与血清白蛋白、 干扰素、核酸酶和糖解酶 等具有很高的亲和力。 Cibacron Blue F3GA ：
亲和色谱操作速度有限。一般采用径向放大的方式， 才能保证色谱柱的处理量（柱高压力过大，容易破坏 胶珠）。 如果色谱柱的体积一定，降低柱高而增大柱径可即 “短粗”型亲和色谱柱有利于提高分离速度。


亲和配基固定 在膜孔表面， 流体在对流透 过膜的过程中 目标蛋白质与 配基接触而被 吸附。
图 5-5 亲和膜吸附原理示意图
表 常用的亲和作用体系
特异性 高特异性 亲和作用体系 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）
第二节 亲和色谱
亲和色谱的特点 ①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高

2.1 亲和色谱株的制备
亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的， 需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定 相粒子，制备所需的亲和吸附介质。 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀 豆球蛋白A（一种植物凝集素）。 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化 的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的 需要，有必要自制亲和吸附介质。

亲和色谱填料载体
亲和色谱的理想载体应具有下列特性： ①不溶性； ②渗透性； ③高硬度及适当的颗粒形式； ④较好的化学稳定性； ⑤抗微生物和酶的侵蚀； ⑥最低的吸附力； ⑦亲水性； ⑧具有大量的供反应的化学基团。

常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如葡 聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的。 近年来，为了满足快速高效分离的需要，以多 孔硅胶和合成高分子化合物为载体的高效AFC 色谱填料，得以迅速发展。 亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体 （carrier、support）的选择、载体的活化和配 基的连接。
5. 辅酶和磷酸腺苷 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。 辅 酶 主 要 有 NAD （ nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和 ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶可 用做脱氢酶和激酶的亲和配基。 AMP （ adenosine 5'-monophosphate ） 、 ADP （adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷部分与 上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配 基。
第三节 膜亲和过滤法
自20世纪80年代中期以来，把亲和色谱技术和 膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲 和过滤方法 。 膜亲和过滤方法包括两个分支： 亲和膜分离技术 亲和错流过滤

3.1 亲和膜分离 原理和特点 亲和膜（affinity membrane）是利用亲和配 基修饰的膜。 亲和膜分离是以亲和膜为亲和吸附介质纯 化目标产物的分离方法，是亲和色谱的变 型 。 又 称 膜 亲 和 色 谱 （ membrane-based affinity chromatography）。
在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的 双环氧化合物起间隔臂的作用。 事实上，除CNBr活化法外，其他活化法都引入 了不同的活性基团，这些活性基团如果有适当 的长度，都可起到间隔臂的作用。 利用CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先 引入ω-氨基已酸或1,6-二氨基已烷后再用相应的 方法固定配基。 引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂 超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又 会减弱。
（3）. 抑制氢键形成的物质 脲和盐酸胍（guanidinohydrochloric acid）的存在可 抑制氢键的形成。 （4）. 温度 温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减弱；疏 水性相互作用增强 。 （5）. 离液离子 在SCN－，I－和ClO4－等离液阴离子存在下，疏水相 互作用降低。 （6）. 螯合剂 如果亲和作用源于亲和分子与金属离子形成的配 位键，加入乙二胺四乙酸等螯合剂除去金属离子会 使亲和作用消失
3. A蛋白 protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具 有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc 片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部位。 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋 白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的 结合常数有所不同。 A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合 能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免 疫复合体。
4. 凝集素 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质 （酶和抗体除外）的总称。 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可 用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的 分析、纯化。pH＜5.6时con A为二聚体，分子 量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为 102 kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键 结合。因此，在利用con A为配基的亲和色谱 操作中，操作条件应当适宜。


部分商品化的色谱填料见表。
表 部分商品化的色谱填料
载体的活化和配基的连接

亲和配基的固定化方法

介质的活化
1. 溴化腈活化法 用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的 配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载 体的活化在碱性（pH＞10）条件下数分钟即可 完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行， 一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：