连接产物转化
平端PCR产物加尾及连接转化
丁香1微升（2.5U）Taq酶1微升Taq酶缓冲液1微升（10mM）dNTPdna 50－100ng灭菌水补充到10微升体积72度10分钟（建议水浴）若有dATP请使用dATP代替dNTP，这样的效率会高一些;反应体积可以根据你的DNA的量来确定，如果浓度比较小，可以扩大体系.加A后可用纯化试剂盒进行纯化或乙醇沉淀,有时就直接拿来连接,都有成功1.由具有校正活性的DNA 聚合酶（如Pfu DNA 聚合酶）产生的PCR 扩增片段的纯化产物1-7μl2.加入1μl T aq DNA 聚合酶10×反应缓冲液（含MgCl2）3.加入dATP 至终浓度0.2mM。
4.加入5 单位的Taq DNA 聚合酶5.加去离子水至终反应体积为10μl70℃孵育15-30 分钟6.采用1-2μl 用于载体连接反应连接后转化感受态细菌，转化步骤：操作者需准备的材料（溶液配制参见章节XII. A）LB 平板（含有氨苄/IPTG/X-Gal）SOC 培养基1．每个连接反应准备2 个LB/氨苄/IPTG/X-Gal 平板，附加2 个平板测定转化效率（见章节VI.E），涂板前将平板平衡至室温（步骤10）。
2．离心使连接反应内容物汇集到管底，取2μl 连接反应产物加到置于冰上的1.5ml 离心管中（见注意事项1），向另一置于冰上的1.5ml 离心管加入0.1ng未酶切的质粒以测定感受态细胞的连接效率。
3．将冻存的JM109 高效率感受态细胞从－70℃冰箱中取出，放置在冰浴直至融化（大概5 分钟），轻轻振动离心管使之混匀。
4．向步骤2 准备的每个转化管中加入50μl 感受态细胞。
（加入100μl 细胞进行转化效率的测定）5．轻轻振动小管混匀，冰浴20 分钟。
6．在精确的42℃水浴中热击45－50 秒（不要振动）。
7．迅速将管子移到冰浴中，使细胞冷却2 分钟。
8．每管连接反应转化细胞中加入平衡至室温的950μl SOC 培养基，而转化未酶切质粒的细胞加入900μl SOC 培养基。
连接转化步骤
1.10 连接产物的转化1.10.1 大肠杆菌（E. coli DH5α)感受态的制备（1）将-70℃保存的DH5α甘油菌活化于LB培养基，37℃过夜培养。
挑取DH5α单菌落至20 mL LB液体培养基中，37℃条件下，180 rpm振荡过夜培养；（2）吸取200 μL上述菌液按1%接种量加至20 mL的LB液体培养基中，37℃，180rpm，振荡培养1-2 hr，直到菌液浓度达到OD600=0.2-0.5；（3）吸取培养好的菌液移至50 mL的灭菌离心管中，5,000 rpm，4℃离心10 min，弃尽上清；（4）用5 mL冰浴的0.1 M CaCl2轻轻悬浮菌体，在冰上放置10 min；（5）5,000 rpm，4℃离心10 min，弃上清，收集菌体；（6）用2 mL冰浴的含10%甘油的0.1 M CaCl2重新悬浮菌体，并分装于冰浴的1.5 mL离心管中（每管装入100 μL），在4℃放置（48 hr内进行转化效率最高），或者置于-70℃保存备用。
注：感受态的制备必须保证在低温条件下进行，操作过程尽量轻柔。
可在制作完后，转工具性质粒，以验证感受态效率。
1.10.2 连接产物的热激转化（1）吸取连接产物（体积≤10 μL）于50-100 µL感受态细胞中，轻轻混合均匀，在冰上放置30 min；（2）将离心管放到42℃水浴中，热激90 s（严格控制热击时间），取出后迅速放于冰上，冷却1-2 min；（3）向离心管中加入5倍体积的SOB(或LB)液体培养基，37℃振荡培养45-60 min；（4）8,000 rpm离心30 s，去部分上清，留100 μL左右培养液，移液枪吸打均匀后，用三角涂布器涂布在选择性LB平板（含相应抗生素）上；（5）倒置培养皿于37℃培养12-16 hr，待单菌落长出后，挑取单菌落于已加入相应抗生素的LB液体培养基中，37℃条件下，180 rpm振荡过夜培养，提取质粒并进行酶切验证。
PCR产物的T载体连接和转化
将阳性克隆扩大培养，用灭菌的甘 油按比例与培养液混合，保存于80℃低温冰箱中。
04 PCR产物的应用
克隆基因的表达
克隆基因的表达是PCR产物应用的重要领域之一。通过将目的基因克隆到表达载 体中，可以实现在宿主细胞中的高效表达，从而获得大量的重组蛋白。
克隆基因的表达有助于研究基因的功能、蛋白质的结构和性质，以及开发新的药 物和治疗方法。
03
04
使用高质量的感受态细胞，确保其处于良 好的生长状态。
优化连接条件，如连接时间、温度、酶产物浓度，可以提高转化效率。
克隆基因表达不理想的问题及解决方案
问题：克隆基因表达量低 或未表达。
确认目的基因的ORF是否 正确，是否有基因缺陷或
突变。
优化表达条件，如温度、 pH、诱导剂浓度等。
02
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04
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解决方案
对PCR产物进行测序验证， 确保目的基因的序列正确。
对于关键突变，可以通过 定点诱变技术进行精确的 基因改造。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
解决方案
选择合适的宿主菌，有些 基因在特定的宿主菌中表
达较好。
添加基因表达增强剂，如 使用稀有密码子或增强子
序列。
基因突变研究中的问题及解决方案
问题：基因突变导致功能 丧失或表达异常。
使用高保真酶进行PCR扩 增，减少突变的发生。
在突变研究中，考虑使用 互补DNA（cDNA）代替 基因组DNA。
01
基因突变的研究
基因突变是生物多样性和进化的重要 驱动力。通过PCR技术，可以快速、 准确地检测和鉴定基因突变，研究其 产生机制和生物学意义。
基因突变的研究有助于了解人类遗传 性疾病的发病机制、药物抵抗和癌症 发生等生物学过程，为疾病诊断和治 疗提供依据。
实验四感受态细胞的制备和连接产物的转化
实验四、感受态细胞的制备和连接产物的转化一、实验原理与目的法制备大肠杆菌感受态细胞的方法；学习CaCl2掌握外源DNA重组质粒导入受体菌细胞并筛选阳性转化体的方法。
感受态就是受体菌能接受外源DNA（周围环境中的DNA分子）能力的一种生理状态，一般认为处于生长对数期的后期能够发展成为感受态，但是细菌中能发处展成为感受态的细胞是很少的，一般认为0.1%-1%，而且时间短暂。
用CaCl2理大肠杆菌细胞可以使20%的细胞成为具有转化能力的感受态细胞。
冷冻也能增加感受态细胞有量，而且还可以延长感受态时间，提高转化效率。
二、材料与试剂0.1mol/L CaCl2溶液:称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,高压灭菌。
含15%甘油的0.1mol/L CaCl2: 称取0.56g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml 重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
1.5ml EP管、灭菌枪头、移液枪、冰盒、低温离心机、涂布棒、大肠杆菌DH5a、重组质粒（实验三的连接产物）、LB固体培养基、氨苄青霉素三、实验方法1、大肠杆菌感受态细胞的制备（CaCl法）21）取-70℃超低温冰箱保存的大肠杆菌DH5a菌液30μl（过夜菌液约16小时）接种于3ml LB培养液（1：100接种）37揺菌（250rpm）培养过夜。
2）将过夜培养的菌液1ml移入100ml LB培养基中，37℃快速振荡（250rpm），至OD=0.4—0.6（约2小时）；冰上30min。
3）取10ml培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下4000g离心10分钟。
4）弃去上清,用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下4000g离心10分钟。
5）弃去上清,加入2ml预冷的含20%甘油的0.1mol/L的CaCl2 溶液重悬,即成感受态细胞悬液。
pcr连接产物的转化问题讨论
pcr连接产物的转化问题讨论PCR连接产物的转化问题可以涉及多个方面，例如连接效率、转化效率、阳性对照等。
以下是对这些问题的讨论：
1.连接效率：连接效率取决于多种因素，包括目的片段和载体的浓
度、连接酶的活性与浓度、反应缓冲液和温度等。
如果连接效率低，可能需要调整反应条件，如提高目的片段和载体的浓度、更换连接酶或调整反应缓冲液。
2.转化效率：转化效率低可能是由于感受态细胞状态不佳、转化条
件不适当或目的片段有问题。
可以采取一些措施来提高转化效率，例如制备高质量的感受态细胞、调整转化条件或重新验证目的片段。
3.阳性对照：阳性对照是用来判断连接和转化是否成功的关键因素。
如果阳性对照未成功，可能是由于载体失去T、核酸酶污染或目的片段出现缺失和重排等原因。
可以采取更换阳性对照、更换核酸酶或重新验证目的片段等方法来解决阳性对照问题。
总之，对于PCR连接产物的转化问题，需要仔细分析每个环节，并采取适当的措施来解决可能出现的问题。
同时，建议多参考相关文献和经验总结，以便更好地解决这些问题。
连接产物的转化
连接产物的转化一、器械冰盒，酒精灯，镊子，彩色笔，酒精棉，打火机，移液枪（1000μL）及其吸头，平皿（装废液）、计时器，水浴箱，氨苄平板，1.5mL离心管二、试剂及其样品冰块，SOC液体培养基，连接产物，三、步骤1、把冰块装于冰盒中，取－70℃冻存的感受态细胞于冰盒中，待感受态细胞融化后，低速离心一会，再放回冰盒中，样品也作低速的离心，放在离心管架上；2、把感受态和样品放进无菌操作台上；3、用酒精棉擦试手，点燃酒精灯；4、调好刻度（>100μL），装好枪头5、用烧过的镊子打开反应管的盖子和离心管的盖子，从而把感受态细胞移取到样品中，然后盖实管盖，做好标记，再放于冰盒中；6、待所有样品加完后，轻轻混匀，冰浴30min（放于4℃冰箱中）7、42℃水浴热冲击90-120s，再迅速放回冰上2min；8、在无菌操作台上，夹取相应数量空1.5Ep管于架子上，加上750μLSOC液体培养基（操作时双手不要放在管口正上方），然后把样品中的液体移进该离心管中，再用一定量的SOC液体冲洗管底再把它移取干净，标记好之后150r/min振荡培养45mins，9、离心（5min，5000rpm）10、在无菌操作台上移弃550μL上清液，再用枪吹打沉积物成混浊状（混匀），然后把它涂在氨苄平板上（尽量均匀的涂），11、在操作台里平皿正放并半开朝向酒精灯让其菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12—16h；四、注意事项1、质粒的浓度：转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低，一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%2、在连接产物中加入感受态细胞后应轻轻混匀，避免细胞破裂；在移取感受态细胞时，枪头不能在管内进行吹打；3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量：对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现；对照组2：以质粒代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含蓄地抗生素的LB平板上应出现大量菌落；4、SOC培养液务必保证无菌，用时烧瓶口，盖子侧放，用完也要浇瓶口；5、用100μL量程的枪把混合物加到SOC培养液中，加入后再吸取一定量的SOC再冲洗一下混合物，再把它们吸取干净；。
PCR产物的T载体连接和转化
PCR产物的A尾巴和T载体
连接酶
T4 DNA Ligase 1967
酶连 将4.5μLPCR产物转移到无菌微量离心 管中，加入0.5μL T载体，加5μL 2×连 接buffer，16℃连接反应12小 E.coli DH5α感受态细胞转移至无菌离心管 中，每管加2ul酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30min，将离心管放到预先加热到42℃ 的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 快速将离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟， 每管加800ul LB培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将离心管转移至37℃摇床上，温育 45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗 性基因。已转化的感受态细胞转移至20mmol/L MgSO4和相应抗生素的LB琼脂平板上，将平板于 室温至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养，1216小时后可出现菌落。
连接产物的转化
3. 自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；
4. 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻 译
重组子的筛选
抗生素标记法：菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因 （如氨苄青霉素， 卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素
的培养基上长出。
互补法：现在使用的许多载体（如PUC系列）有含有一个大肠杆菌 ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列 和头146个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。 受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。β－半乳糖苷酶表达， 在底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（x-gal）培养基 中形成兰色菌落。 而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ
段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定 的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现 在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化 的关键。
•
Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x106~2x107 转
化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+ 的基
除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需 要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA 进 入 细 菌， 转 化 率最高能 达到 109~1010 转 化 子 /ug闭 环 DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
DNA分子转化分以下几步:
1. 吸附－－双链DNA分子吸附于受体菌表面； 2. 转入－－双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另 一条降解；
连接产物的转化
1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化；
PCR产物的T载体连接和转化
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4、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的 错儿。 11:01:1 411:01: 1411:0 1Saturday, December 12, 2020
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5、知人者智，自知者明。胜人者有力 ，自胜 者强。 20.12.1 220.12. 1211:0 1:1411: 01:14D ecembe r 12, 2020
PCR产物的T载体 连接和转化
PCR产物的A尾巴和T载体
连接酶
T4 DNA Ligase 1967
酶连
将4.5μLPCR产物转移到无菌微量离心 管中，加入0.5μL T载体，加5μL 2×连 接buffer，16℃连接反应12小时以上。
转化
取200ul E.coli DH5α感受态细胞转移至无菌离心管 中，每管加2ul酶连产物，轻轻旋转以混匀内容物， 在冰中放置30min，将离心管放到预先加热到42℃ 的循环水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动试管。 快速将离心管移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟， 每管加800ul LB培养基，用水浴将培养基加温至 37℃，然后将离心管转移至37℃摇床上，温育 45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗 性基因。已转化的感受态细胞转移至20mmol/L MgSO4和相应抗生素的LB琼脂平板上，将平板于 室温至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养，1216小时后可出现菌落。
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1、有时候读书是一种巧妙地避开思考 的方法 。20.1 2.1220. 12.12Sa turday, December 12, 2020
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2、阅读一切好书如同和过去最杰出的 人谈话 。11:0 1:1411: 01:1411 :0112/ 12/2020 11:01:14 AM
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3、越是没有本领的就越加自命不凡。 20.12.1 211:01: 1411:0 1Dec-20 12-Dec-20
连接与转化
蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz ’的基因，lacz’ 中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段； 一个 多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是 外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽 链的功能活性。
LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色
底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。 然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，会
实验流程（转化需要无菌操作）
连接产物 或质粒
冰浴3min 加入
200 µL感受态
冰浴30min
42 ℃ 90s
1 mL 37℃预热LB
37 ℃ 60min
振荡培养
加入5 µL X-gal、 5 µL IPTG
4 ℃ 3000r/min 10min
倒掉上清，留下 约200 µL
37 ℃
37 ℃
涂板，正面向上 30min
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz的基因 。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中 含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N 端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用 X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
T-载体与PCR产物连接
TA克隆方法：把PCR片断与一个具有3 ’-T聚合酶同时具有的末端连接酶的 功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个 3`-A突出端。用经过特殊处理的具有3’-T突出末端的DNA 片断才能通过T/A配对进行连接。
倒置培养过夜
蓝白斑筛选
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
分子生物学-实验二 PCR产物T-A连接及连接产物转化-精选文档
实验结束： • 整理实验台； • 值日生值日；
• 写实验报告。
2. 42oC，45秒。然后迅速放回冰中 5 分钟；
6. 将上述菌液涂匀于含有Amp的LB琼脂培养板；
7. 待菌液被平板吸收后，将平皿倒置于37oC孵箱中培养12-16h。
思考题：
1. 影响T-A连接效率的因素有哪些？ 2. 感受态细胞制备、转化过程中的主要注意事项是 什么？转化后的平皿为什么需要倒置培养？
GAPDH gene 片段 (746bp)
实验第二部分 PCR产物与T载体的连接
T-A 连接原理：
1. Taq DNA聚合酶：PCR产物 的3’端突出一个A
A-3
2. 商业化的T载体：在3’端多 出一个T
5
T -3
3- T
5
3 -A
T - Vector
3. 两者的互补碱基先退火结合(粘 性末端连接)，然后连接酶在 缺口形成磷酸二酯键。
T-A连接的步骤：
1. 按下列配方进行连接反应： 回收的PCR产物（DNA片段） T-载体 10 X Ligation buffer T4 DNA ligase 终体积 7 1 l l 1 l 1 l 10 l
注：最后加入工具酶（T4 DNA ligase ） 2. 轻弹管底混合，离心机甩一下。 3. 将连接反应管置25℃水浴20min。
实验第一部分pcr产物的电泳及回收gapdhgene片段746bp750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpmarkerpcr产物的电泳结果观察及分析gapdhgene片段746bp750bp2000bp1000bp500bp250bp100bpmarker1在uv灯下用手术刀片将含dna片段的琼脂糖凝胶切下放入封口膜中
连接产物的转化
如导电、导热、发光、磁性等特性，满足多样化需求。
绿色化学的发展
绿色合成方法
发展高效、环保的合成方法，减少或消除对环境的污染，如酶催 化、光催化、电化学合成等。
可持续化学
利用可再生资源或副产物作为原料，实现化学品的可持续生产，减 少对化石资源的依赖。
绿色化学品
开发环境友好的化学品，如生物降解塑料、无毒或低毒的化学品， 减少对人类和环境的危害。
智能化技术的应用
人工智能
利用人工智能技术优化化学反应过程，提高生产效率和产品质量，降低能耗和资源消耗。
自动化技术
通过自动化技术实现生产过程的连续化、自动化和智能化，提高生产效率和安全性。
数据驱动决策
利用大数据和云计算技术，对生产数据进行实时监测和分析，实现智能化决策和优化管理 。
THANKS FOR WATCHING
利用先进材料技术，开发具有优异性能的复合材料，如耐高温、高强度、
轻质等特性，用于航空航天、汽车、能源等领域。
02
智能材料
智能材料能够根据环境变化做出响应，如形状记忆合金、光敏材料等，
在传感器、驱动器、结构健康监测等方面具有广泛应用前景。
03
多功能材料
通过纳米技术、分子组装等技术，开发具有多重功能于一体的新型材料，
03
环保友好，但需要特定的生物酶和微生物。
04 连接产物转化的挑战与解 决方案
能耗与效率问题
高温反应
许多连接反应需要在较高的温度下进行，这增加了能耗和反应时 间。
低选择性
某些连接反应可能产生多种产物，选择性较低，导致分离和提纯 成本增加。
催化剂效率
催化剂的效率低下，影响反应速率和选择性。
催化剂选择与优化
DNA连接与转化
.
10
三．实验方法
▪ ＤＮＡ分子的体外连接
▪ １．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
▪ a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
▪ b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新退火的粘端解链， 将 混合物冷却到０℃。
▪ c. 加入：
▪ １０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer 1μl
.
22
二、转化
▪ １．在1.5ml Eppendorf管中加入２００μl感受态细 胞和１０μl 40ng DNA溶液， 温和混匀，于冰上３ ０分钟。
▪ ２．于４２℃水浴９０秒。
▪ ３．冰浴２分钟。
▪ ４．加入８００μl ＬＢ 液体培养基３７℃ ４５分 钟。
▪ ５．取２００μl涂布于含Amp(50μg/ml)琼脂糖平皿， ３７℃培养１２～１６小时，观察结果。
▪ 关于感受态的本质与存在，说法很多， 目前 主要有两种假说： １．局部原生质体化假说 －－感受态细胞的表面形成一种能接受ＤＮ Ａ的酶位点， 使ＤＮＡ分子能进入细胞。
.
16
制备感受态细胞
▪ 现在制备感受态细胞通常用CaCl2处理，在低温中 与外来ＤＮＡ分子相混合.
▪ ＤＮＡ分子转化分以下几步: ▪ １．吸附－－双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ▪ ２．转入－－双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受
定，折衷方法是１２℃过夜。
.
6
3. DNA的平未端和粘性末端
▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。
▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
.
7
4.碱性磷酸酶处理质粒载体
golden gate的消化步骤
主题：Golden Gate的消化步骤1. Golden Gate是一种用于构建重组DNA的分子生物学技术，它通过结合不同的DNA片段来实现特定的基因组重排。
Golden Gate技术已经被广泛应用于植物基因组编辑、合成生物学和基因工程领域。
2. Golden Gate的消化步骤是该技术中至关重要的一环，下面将详细介绍Golden Gate消化步骤的具体流程。
3. 准备工作在进行Golden Gate消化步骤之前，首先要准备好所需的材料和试剂，包括DNA片段、酶切酶、缓冲液等。
需要对实验操作台和仪器进行消毒和清洁，以确保实验的准确性和可靠性。
4. 酶切反应体系筛选根据实验目的和所使用的酶切酶种类，选择合适的酶切反应体系。
通常情况下，Golden Gate消化步骤所使用的是双酶切反应，需要在反应体系中添加相应的酶切酶和缓冲液。
5. DNA片段酶切将待消化的DNA片段与酶切酶和缓冲液混合，然后进行酶切反应。
酶切反应的时间和温度一般根据实验方案进行调整，通常在37°C温度下进行反应1-2小时。
6. 酶切产物纯化酶切反应结束后，需要对酶切产物进行纯化。
通常采用凝胶电泳或PCR纯化技术，将所需的DNA片段从反应混合物中分离出来，以备后续应用。
7. DNA片段连接将经过酶切和纯化的DNA片段与载体DNA进行连接。
在Golden Gate技术中，常常采用特定的连接酶和连接缓冲液来实现DNA片段的连接过程。
8. 连接产物转化连接产物需要进行细胞转化，将其导入到相应的宿主细胞中，以实现重组DNA的表达和功能。
9. 结果分析对转化后的细胞进行分析和筛选，验证Golden Gate消化步骤的有效性和成功性。
通过PCR扩增、酶切分析、序列测定等方法，对重组DNA进行鉴定和鉴定。
10. 总结Golden Gate的消化步骤是该技术中的关键环节，对实验操作的规范性和准确性要求较高。
通过合理的实验设计和操作流程，可以有效实现DNA片段的酶切和连接，为后续的基因组工程和生物学研究奠定坚实的基础。
连接产物的转化
连接产物的转化实验原理：< 转化反应>1、即受体菌在低温下（0℃）被置于低渗的CaCl2溶液中，细菌在低渗环境中菌体膨胀成球形。
2、转化体系中的DNA与Ca2+形成羟基钙磷酸复合物黏附于细胞表面，之后使细菌经42℃短时间热冲击处理(热休克)，此时受体菌可大量吸收其表面黏附的DNA复合物，完成转化。
继而在培养基上生长一定时间(数小时)后，菌体恢复原状，并可以分裂增殖。
3、由于载体上含有氨苄青霉素抗性基因和LacZ基因的部分片段，所以可以利用抗性和蓝白斑进行含有重组质粒的大肠杆菌菌落的筛选。
< 显色反应原理>1、α互补：指E.coli β-半乳糖苷酶的两个无活性的片段组合而成为功能完整的酶的过程。
pGEM-T载体上的T位点位于可产生α肽段的基因片段之内。
若有外源基因插入此则破坏编码读框产生没有活性的α肽段。
2、宿主菌为缺失产生α肽段的突变体，但能产生酶的其它肽段（ω肽段）。
2、载体与宿主菌两者之间进行基因内互补就产生有活性的β-半乳糖苷酶。
在IPTG的诱导下，载体产生的α肽段与宿主菌产生的ω肽段结合成有活性的β-半乳糖苷酶，此酶能使显色底物X-gal分解成不溶于水的蓝色化合物，从而使菌落变蓝。
若有外源片段插入此位点，则使载体的β-半乳糖苷酶基因失活，不能产生α肽，也就不能形成有活性的β-半乳糖苷全酶，X-gal不能被分解，菌落为白色。
实验步骤：1、从-80℃冰箱中取出感受态细胞放于冰上，使其缓慢融化。
2、分装感受态细胞，每个小管30μL。
分别加入连接产物3μL，轻轻混匀，冰上30min。
3、42℃1min。
4、冰上2.5min，加入SOC培养基470μL。
5、37℃摇床摇动1小时。
6、将培养液分成等份后涂于LB培养基上，液体全干后，将平板过夜、倒置培养于37℃恒温箱中。
7、第二天早上观察培养结果。
培养基配制：一、LB/Amp/X-Gal/IPTG 培养基:加ddH 2O 搅拌溶解，滴加5M NaOH ，调节PH 值至7.0。
连接产物的转化
段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定 的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现 在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化 的关键。
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Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x106~2x107 转
化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+ 的基
组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生 物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。使受 体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过 程就是转化。
通常所用的受体是大肠杆菌。
用于转化的细菌被称为感受态细胞。
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所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片
础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+ 、Co2+ ）、DMSO或还 原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由 Cohen 于 1972 年发现的。其原理是细菌处于 0℃ ， CaCl2 的低渗溶 液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA形成抗 DNase 的羟基 -钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42℃ 短 时间热冲击处理，促使细胞吸收 DNA复合物，在丰富培 养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转 化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基 平板上，可选出所需的转化子。
3. 自稳－－外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；
4. 表达一供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻 译
重组子的筛选
抗生素标记法：菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因 （如氨苄青霉素， 卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素
质粒or连接产物转化流程
质粒or连接产物转化流程转化分为电转和化转，将依次进行介绍。
A:实验原理1、电转电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，使目的产物进入感受态内。
因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对树生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。
这会导致细胞膜的电性质和细胞内外液体的电导率不同。
当细胞暴露于外部电场中时，细胞膜上的离子通道发生改变，引起细胞内外液体的电位差发生变化。
这种变化会引起细胞内部的生化反应以及细胞外部的形态变化，也就是形成孔洞。
2、化转DNA进入细胞时需要克服以下两个困难：DNA带负电荷，细菌的细胞膜也带负电荷，需要克服DNA和细胞膜间的电荷排斥作用；DNA进入细胞需要细胞膜上有孔隙。
化学感受态细胞转化的第一步，加入DNA后，轻弹管壁混匀，冰上静置，使Ca2+与DNA 结合中和DNA的负电荷，Ca2+与细菌细胞膜结合中和电荷，克服了外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥作用。
Ca2+与DNA和细菌细胞膜脂多糖的磷酸盐形成配位络合物，Ca2+促进了DNA和脂多糖的结合。
热激使温度升高，细胞膜的脂质释放，在细胞膜上形成孔隙，DNA进入细菌内部。
热激后在冰上冷却2 min，温度降低，细胞膜的蛋白质释放，脂质占比增高，细胞膜的流动性升高，细胞膜上的孔隙消失。
B:实验操作1、电转1)提前于-80℃取出电转感受态，将其放置于冰上化冻。
注：该步骤大概需要3-5min，时间切勿过长。
2)取出SOC培养基放入37℃摇床内预热。
3)准备超净工作台，物料准备包括10µL枪头以及枪头盒、划线棒或涂布棒，以及将电转杯放入冰上预冷。
注意：若电转杯为浸泡于酒精内反复使用，则需要提前将电转杯取出于超净工作台内晾干酒精，再行预冷。
晾干操作至少需要15min，预冷操作至少需要10min。
4)吸取2µL的连接产物/不超过50ng的质粒加入感受态内，混匀注意：若为连接产物，可根据需要适量多加。
若为质粒，则需要控制用量，不然容易在电击时爆杯，造成实验失败。
甲基化质粒构建
甲基化质粒构建甲基化质粒构建是基因治疗中的重要环节，其目的是将目的基因插入甲基化质粒载体中，以保护目的基因免受宿主细胞免疫系统的攻击。
本文将介绍甲基化质粒构建的七个方面。
1.目的基因获得目的基因可以通过基因文库、PCR、人工合成等方式获得。
这些方法都可以得到目的基因的DNA序列，但需要对其表达量和纯度进行鉴定。
2.甲基化酶切位点添加为了将目的基因插入甲基化质粒载体中，需要在目的基因和载体中添加适当的甲基化酶切位点。
这些位点可以是一些特定的酶切位点，如SacⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ等。
添加这些位点可以通过一些基因工程手段实现，如通过DNA重组技术将甲基化酶切位点序列添加到目的基因和载体中。
3.甲基化质粒载体构建甲基化质粒载体是携带甲基化酶切位点的质粒，可以将目的基因运送到宿主细胞中。
构建甲基化质粒载体的方法包括将甲基化酶切位点插入到质粒载体的合适位置，并保证其稳定性和可复制性。
插入位点应该选择多拷贝数和高转录效率的位点，以保证目的基因的高效表达。
4.目的基因与甲基化质粒载体酶切后连接将目的基因与甲基化质粒载体进行酶切后，可以使用DNA连接酶将它们连接起来。
这一步骤需要选择合适的连接方式，如通过T4DNA 连接酶进行连接。
同时，连接过程中需要注意温度、pH值、离子浓度等参数，以保证连接的效率和稳定性。
5.连接产物转化连接产物需要在受体细胞中进行转化，以得到甲基化阳性克隆。
转化方法可以是有丝分裂转化或电转化，其中电转化效率较高。
在进行转化时，需要选择合适的受体细胞，如大肠杆菌、酵母等。
同时，需要对受体细胞进行筛选，以得到含有目的基因的阳性克隆。
6.甲基化阳性克隆筛选甲基化阳性克隆是指含有目的基因并且具有甲基化酶切位点的克隆。
筛选这些阳性克隆可以通过一些分子生物学技术，如PCR、DNA 测序等。
初步筛选可以找到一些阳性克隆，但为了确保目的基因的稳定表达和正确甲基化，需要进行进一步鉴定。
7.甲基化质粒大量制备在得到甲基化阳性克隆后，需要进行大量制备以满足后续实验或应用的需求。
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• Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5x106~2x107 转 化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆实验。如在Ca2+ 的基 础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+ 、Co2+ ）、DMSO或还 原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
大肠杆菌的转化常用热激法，该法最先是由Cohen于 1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶 液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗 DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短 时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培 养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转 化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基 平板上，可选出所需的转化子。
连接产物的转化
1、puc19质粒用HindIII和EcoRI酶切，线性化；
2、目的片段用HindIII和EcoRI酶切，线性化； 3、回收酶切后的质粒和目的片段，定量,连接；
一 实验目的
掌握细菌转化的一般技术和原理。
二 实验原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重
互补法：现在使用的许多载体（如PUC系列）有含有一个大肠杆菌 ＤＮＡ的短区段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列 和头146个氨基酸偏码区。这个偏码区中插入一个多克隆位点。
受体菌则含编码β－半乳糖苷酶Ｃ端aa的序列。β－半乳糖苷酶表达， 在底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷（x-gal）培养基 中形成兰色菌落。
组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生
物遗传、分子遗传、基因程等研究领域的基本实验技术之一。使受
体细菌从周围介质中吸收外来DNA分子，从而获得新的遗传物质的过
程就是转化。
通常所用的受体是大肠杆菌。
用于转化的细菌被称为感受态细胞。
• 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片 段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定 的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现 在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化 的关键。
除热击法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需 要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA 进 入 细 菌 ， 转 化 率 最 高 能 达 到 109~1010 转 化 子 /ug闭 环 DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
重组子的筛选
抗生素标记法：菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因 （如氨苄青霉素， 卡那霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素 的培养基上长出。
而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ 基因不表达而形成白色菌斑。 通过颜色不同而区分重组子和非重组 子。
实验步骤：
1）将2μl连接产物与100μl感受态细胞在冰上混匀，并静置 30min，42℃下处理60sec，然后加入600μl的LB（A-）液体 培养基，在摇床上37℃摇动培养1hr。