双酚A的酶联免疫检测方法的建立

收稿日期： #’’97!’7!$ 作者简介： 姚卫蓉 （ !9:’ 7 ） ， 女， 博士， 副教授， 研究方向： 食品安全与 质量控制。 基金项目： “ 十一五” 国家科技支撑计划重点项目 （ #’’9*)U*9*’$ ） 。
!="< 实验方法
$ !"#
!"#"!$ 偶联蛋白的制备及免疫操作 $ 双酚 % 完全抗 原按文献 ［ !# ］ 方 法 制 得。采 用 重 氮 化 法 在 双 酚 % （ &’%） 上引入羧基， 得到双酚 % 半抗原 （ &’%( ） ， 采 用水溶性碳化二亚胺 （ )*+ ） 法， 将双酚 % 半抗原与 牛血清蛋白 （ &,% ） 和ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ清蛋白 （ -.% ） 共价偶联， 分 别制得 免 疫 抗 原 &’%( / &,% 和 包 被 抗 原 &’%( / -.%。经紫外扫描及红外光谱分析， 表明双酚 % 分 子与大分子蛋白偶联成功。 用 &’%(/ &,% 免疫新西兰纯种白兔。为增强免 疫原性采用加佐剂的方法， 免疫剂 量 每 只 !01。初 次免疫用 &’%(/ &,% 与等体积弗氏完全佐剂乳化， 皮下多点注射。一个月后每两周加强免疫 ! 次， 加 强免疫用 &’%( / &,% 与等体积弗氏不完全佐剂乳
!"#"#$ 包被抗原及抗体稀释度的确定 $ 用方阵滴定 法确定包被抗原和血清的工作浓度。取一块 !# 4 5 的 酶标板， 横向分别以 !6! 、 !67 、 !6!8 、 !678 、 ! 6!88 、 !6#88 、 !6388 的 &’%( / -.% 稀释浓 度 进 行 包 被， !88 !1 9 孔， 3: 冰箱保存过夜。洗液洗涤 2 次， 20;< 9 次， 拍干 （以 下简称洗涤拍干） 。以含 !80= ・01 / ! &,% 的 ’&, 溶 液封闭， #88 !1 9 孔， 2>: 温育 #? 。洗涤拍干， 分别以 !6!88 、 !6#88 、 ! 6388 、 ! 6 588 、 ! 6 !@88 和 ! 6 2#88 稀释抗 体， !88 !1 9 孔， 设置 # 个平行， 2>: 温育 #? 。洗涤拍 干， 加 入 ! 6 2888 稀 释 的 酶 标 二 抗（ 羊 抗 兔 A=B/ (C’） ， !78 !1 9 孔， 2>: 温 育 !? 。 洗 涤 拍 干， 加 入显 色 液， !88 !1 9 孔， 暗 处 反 应 !70;< 。 加 终 止 液 （ #0DE・1 / ! 硫酸） ， 78 !1 9 孔。酶标仪上测定吸光度， 选择阳性血清的 %378 值在 !"8 左右时， 包被抗原、 抗体 稀释度为最佳工作浓度。 !"#"2$ 竞争 )1A,% 标准曲线的制作 $ 选用最佳工作 浓度的包被液进行包被， 取等量浓度梯度的 &’% 标 准溶液 （ 8"88! 、 8"882 、 8"8! 、 8"82 、 8"2 、 !、 2、 !8 、 #7 、 78 、 !88 、 !888 != ・01 / ! ） 与最佳工作浓度的抗体充分混 合， 吸取 !88 !1 9 孔按照竞争 )1A,% 进行测定。前四 个浓度低的设 2 个平行， 后面设 !# 个平行。以 & 9 &8 为纵坐标， 以 !888 倍的标准溶液浓度的对数值为横 坐标作图， 即得 &’% 的竞争标准曲线。对标准曲线 的范围进行截取， 并拟合标准曲线方程。 !"#"3$ 半数抑制浓度 A+78 和最低检测浓度的测定 $ 评价 )1A,% 方法灵敏度的方法， 常用的有 A+78 和最低 检测限， 两者的值越低， 说明方法的灵敏度越高。以 C 值接近 78F 时的混合溶液中的 &’% 标准浓度作为 A+78 ， C 值的计算方法见公式 （!） 。 # 测定阴性孔 !# 次， 计算阴性孔的平均值 （% 及 阴） 标准偏差 （ ,*） ， 以 % 值对应的 &’% 浓度为最低检测 限， % 值的计算方法见公式 （#） 。 C （ F ）G %阴 / %阳 4 !88F %阴 式 （!） 式 （#）
!" 结果与分析
!#$" 包被抗原及抗体稀释度的确定
由图 ! 可知， 当抗血清稀释倍数为 !6!@88 时， 几 个包被抗原稀释度下的吸光值都接 近 于 !"8 。同 时 从图上可以看到， 当包被抗原稀释度过大或过小时， 吸光值相对较小。随着包被抗原稀释倍数的 增 大， 吸光值变化幅度没有明显差别。考虑到适当大的包 被抗原稀释度能增加方法的灵敏度， 而且适当大的 抗体稀释度能够降低抗血清中干扰物质的干扰。因 此， 可以确定最佳包被抗原稀释度为 ! 6 #88 ， 最佳抗 体稀释度为 !6!@88 。
［ !7# ］ N;?6-.A=I， /NU） ， 具有某些雌激素特性 ， 对生殖 ［ %7& ］ ［ 37V ］ 发育有影响 。目前对双酚 ) 的检测用色谱法
模样本的快速筛选， 是目前最理想的筛选性分析方 法之一。鉴于此， 本实验将从免疫学的角度建 立 起 间接竞争 /01,) 检测 *+) 的方法， 并通过抑制浓度 1N&’ 、 最低检测限、 重现性、 交叉反应率和回收率等指 标进行方法学评价。
!< 材料与方法
!=!< 材料与仪器
双酚 ) （ *+)， W 9:8 ， S?X E?HI?D ， F,) ） 、 双酚 / （ *+/ ， QN ， W 9V8 ） 、 $7 枯基苯酚 （ QN ， W 9V8 ） 、 双酚 * （ *+* ， QN ， W 9V8 ） 、 双酚酸 （ *O+Y)， C， W 9V8 ） ( 均购自梯希爱 （ 上海） 化成工业发展有限公司； 牛血 清蛋白 （ *,) ） ( 上海华美生物工程公司； CX??@ 7 #’ ( 分析纯， 国药集团化学试剂有限公司； 新西兰长耳白 兔( 雄 性， !"& 4 #Z5 [ 只， 上海斯莱克实验动物有限 93 孔 !# \ V 可拆酶标板 ( 上海春博生物实验仪 器 有 限 公 司；]L=J-IZA@ ]^% 酶 标 仪 ( 0ATIDIJ?6I 公司。 C;?H6< 公司。
是比较理想的， 近来多用色谱和质谱联用技术
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，
这一技术除包括了色谱的全部优点外， 在定性、 定量 方面还有着色谱法无可比拟的优势。但使用的仪器 相对昂贵， 与常规分析方法相比需要更高的专业技 能培训。/01,) 法除了具有特异性强、 操作简便、 仪 器化程度和分析成本低、 样品前处理简单、 检测时间 短、 样品容量大等优点外， 亦不存在 O+0N 或 QN 对 待测物蒸汽压、 热稳定性、 卤素、 发色团等理化性质 的限制， 特别适用于难气化或难分离的高极性、 离子 型有害物的分析， 尤其适用于环境现场监控和大规
图 !$ 方阵滴定法确定包被浓度以及抗体稀释度
姚卫蓉! ， 石春红" ， 孙秀兰! ， 纪丽君! （ !" 江南大学食品学院， 江苏无锡 #!$!## ； #" 海通食品集团股份有限公司检测中心， 浙江宁波 %!&%’’ ）
摘( 要： 将双酚 ) （ *+)） 半抗原与牛血清白蛋白 （ *,)） 共价偶联后， 制备兔抗双酚 ) 多克隆抗体， 建立了双酚 ) 间接 竞争酶联免疫 （ -./01,)） 检测方法， 并对其进行了方法学评价。结果表明： 最佳的抗体稀释度为 !2!3’’ ， 双酚 ) 竞争标 准曲线在 ’"%4!’’ !5・60 7 ! 之间具有良好的线性关系， 最低检测浓度为 ’"’’! !5 ・ 60 7 ! ， 重现性实验变异系数均小于 !’8 。交叉反应实验中， 与双酚酸和双酚 * 的交叉反应率分别为 #’"’8 和 !’"’8 ； 与双酚 / 和 $7 枯基苯酚的交叉反应 率均在 &8 以下。水样的添加回收实验， 回收率范围为 9#"&84!’:":8 。 间接竞争 /01,)， 交叉反应率 关键词： 双酚 )，
#$%&’()$*+,-% ./ %*, )0#1234 /.5 674
!"# $%&7 ’()*! ， +,- ./0)7 /()*# ， +12 3&07 45)! ， 6- 7&7 80)! （ !",.;<<= <> ,.-?@.? A@B C?.;@<=<5D， E-A@5@A@ F@-G?HI-JD， KLM- #!$!## ， N;-@A； #"C?IJ N?@J?H <> OA-J<@5 P<<B QH<LR N<" ， 0JB" ， S-@5T< %!&%’’ ， N;-@A） 4’$%5&0%： !"#$%&’() * %+$,&’ （ !-*. ） /+# 0(’123+,&4 /",% ,%& 0+55"&5 $5(,&"’# 6(7"’& #&528 +)628"’ （ !9* ） +# "882’(3&’ /%"0% /+# 2#&4 :(5 "’1&0,"(’ (: 5+66",# ,( $5&$+5& +’,"#&528" *’4 ,%&’ "’4"5&0, 0(8$&,","7& ;<=9* （ "0;<=9*） /+# &#,+6)"#%&4 /",% ,%"# +’,"#&528 +’4 &7+)2+,"(’ (: 8&,%(4()(3> %+# 6&&’ 4(’&" ?%& 5&#2),# (: ,%& &@$&5"8&’, 4&8(’#,5+,&# ,%+, ,%& ($,"8+) 0(’0&’,5+,"(’ (: 5+66", #&528 /+# !2!3’’ ， ,%& )"’&+5 5+’3& /+# :5(8 ’"% ,( !’’ !3・ 8< 7 ! ， ,%& )(/&#, 4&,&0,"(’ )"8", /+# ’"’’! !3 ・ 8< 7 ! ， +’4 ,%& 0(&::"0"&’,# (: 7+5"+,"(’ /&5& )(/&5 ,%+’ !’ A " ?%& +’,"#&528 %+4 05(## 5&+0,"7",> (: #’"’ A +’4 !’"’ A /",% $ ， $ 7 !"# （ $ 7 %>45(@>$%&’() ） B+)&5"0 *0"4 +’4 6"#$%&’() !， 5&#$&0,"7&)>， 62, %+4 05(## 5&+0,"7",> (: )&## ,%+’ & A /",% !"#$%&’() ; +’4 $ 7 028>)$%&’()" ?%& 5&0(7&5"&# "’ /+,&5 5+’3&4 :5(8 9#"& A ,( !’:": A " 8,9 :.5;$： !"#$%&’() *； "’4"5&0, 0(8$&,","7& ;<=9*； 05(## 5&+0,"7",> 中图分类号： C,#’!"!( ( ( ( 文献标识码： )( ( ( ( 文 章 编 号： !’’#7’%’3 （ #’!! ） ’!7’#9’7’% ( ( 双酚 ) 是近几年从食品塑料包装材料中新发现 的 一 种“ 内 分 泌 干 扰 物（ /@B<.H-@? U-IHLRJ-@5