Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA
Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA
Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱 4℃ 3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在管中，4℃保存。
2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。
3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。
注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。
均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。
b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。
TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。
步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的 PBS 清洗 1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。
2.收集标本悬浮于 EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。
cdna基因克隆的基本原理和流程
一、CDNA基因克隆的基本原理CDNAplementary DNA）是DNA的互补序列，通过反转录酶将mRNA作为模板合成的一种DNA。
CDNA基因克隆是利用逆转录酶将mRNA逆转录合成cDNA，并通过PCR或其他方法将cDNA插入到质粒载体中，实现对目标基因的克隆。
二、CDNA基因克隆的流程1. RNA提取：首先需要从细胞中提取出总RNA，可以使用TRIzol等试剂进行RNA的提取纯化工作。
2. 反转录合成cDNA：将提取得到的RNA作为模版，利用逆转录酶进行cDNA的合成。
反转录反应通常包括RNA模版、随机引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液，并经过一系列温度循环反应，将mRNA 逆转录成cDNA。
3. cDNA纯化：为了避免反转录反应中产生的非特异性产物和杂质，需要对反转录反应产物进行纯化。
4. cDNA扩增：对cDNA进行PCR扩增，以获得目标基因的cDNA 片段。
PCR反应体系包括cDNA模板、引物、dNTPs、Taq聚合酶和缓冲液，通过一系列温度循环反应，扩增目标基因cDNA片段。
5. 酶切与连接：将PCR扩增得到的cDNA片段与质粒载体进行酶切，并在两者的黏端上连接。
6. 转化：将连接得到的质粒转化入大肠杆菌等细菌中，使其进行复制。
7. 筛选与鉴定：通过筛选和鉴定，选出携带目标基因cDNA片段的质粒，进行测序和分析，最终确定目标基因序列。
三、CDNA基因克隆的应用CDNA基因克隆技术已广泛应用于基因克隆、基因表达等多个领域。
在科研领域中，通过CDNA基因克隆技术可以方便快捷地获得目标基因的cDNA，实现对目标基因的研究和功能分析；在医药领域，CDNA基因克隆技术也被应用于基因治疗、蛋白表达等方面。
总结：CDNA基因克隆是一种重要的基因工程技术，通过反转录酶合成cDNA并将其插入到质粒中，可以方便地获取目标基因序列，具有广泛的应用前景。
掌握CDNA基因克隆的基本原理和流程对于开展相关实验研究具有重要意义。
Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA
Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱4℃3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、1.5mlEP 管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液0.5ml,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在1.5mlEP 管中，4℃保存。
2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。
3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。
注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。
均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。
b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，3.5 厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。
TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。
步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的PBS 清洗1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。
2.收集标本悬浮于1.5ml EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。
Trizol提取RNA_DNA_PR步骤
Trizol提取RNA、DNA、蛋白质步骤1st step RNA的提取一、材料食管癌组织。
二、设备研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。
三、试剂耗材1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃2小时）装蒸馏水(去离子水或MilliQ 的高纯水更好)，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、trizol4、氯仿5、手套、帽子、口罩6、1ml、100ul、10ul枪头、1.5ml和200ul EP管（DEPC处理过的）7、液氮8、甲醛1.2 DEPC水配制的3 M，pH5.2 的NaAc：在80 mL DEPC水中溶解40.8 克NaAc.3H20（Amresco公司），用冰乙酸调pH至5.2，定容到100 mL。
1.3 10×甲醛变性胶缓冲液[10×FA（formaldehyde agarose）gel buffer：200 mM的MOPs，50 mM的NaAc，10 mM的EDTA]：称6.8 克NaAc.3H20，溶于400 mL DEPC处理过的去离子水中，然后加20.9 克MOPs溶解，再加 1.86 克EDTA二水二钠，用1 M灭菌的NaOH调pH至7.0（约用NaOH 40 mL）加DEPC处理过的水定容到500 mL，棕色瓶中室温避光保存。
1.4 5×加样缓冲液（5×loading buffer）：先配水饱和的溴酚兰液，在一只1.5 mL 离心管中加入约0.1 mg 溴酚兰，加入1 mL DEPC 水溶解，充分振荡溶解，离心，可见离心管底部有溴酚兰粉末剩余，上层液体即水饱和的溴酚兰液。
加入以下各种成分：4.00 mL 10×FA gel buffer3.84 mL 甲酰胺2.00 mL 100%的甘油720.00 μL 37%（约12.3 M）的甲醛80.00 μL 0.5 M 的EDTA（pH8.0）16.00 μL 水饱和的溴酚兰（若颜色太淡，可以加40 μL）100.00 μL DEPC 水分装1.5 mL 离心管，除常用的4℃保存外，其余-20℃保存。
Trizol法提取RNA实验步骤讲解学习
Tr i zol法提取RNA实验步骤Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNARN颇量的高低常常影响cDN癖，RT-PCR日Northern Blot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总RN袖提试剂，内含异硫氧酸服等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需白备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、1.5ml Eppendorf管（RNase-free ）、Tips （RNase-free ）三、准备工作RNas购非常稳定，是导致RN廨解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的周温局压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNases全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RN制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase勺又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEP配制的70气醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC!DEP曲终浓度为0.1%。
注意：DEPd剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPCC溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEP弧溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPCC处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品250 C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA1）液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100m珂织/mlTrizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
trizol法提取rna的原理
trizol法提取rna的原理
Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理基于三种物质的作用：酚、异硫氰酸盐和氯仿。
这三种物质能够分别破坏细胞膜、蛋白质和DNA，从而将RNA释放出来。
具体步骤如下：
1. 细胞样品裂解
将细胞样品加入Trizol试剂中，通过离心等方式使细胞裂解，并释放出RNA。
2. 蛋白质沉淀
加入氯仿并离心，使细胞蛋白质沉淀到底部形成一个有机相。
3. RNA沉淀
将上层的水相转移至新管中，并加入异硫氰酸盐。
异硫氰酸盐能够溶解RNA，使其在水相中存在。
4. RNA纯化
通过离心等方式将RNA从水相中分离出来，并使用乙酸等试剂对其进行纯化和去除杂质。
最终得到的RNA可以用于后续实验，如逆转录PCR、Northern blotting等。
需要注意的是，在Trizol法提取RNA时要严格控制操作条件，避免污染和失去RNA。
同时也需要对不同类型的样品进行优化，以获得最佳的RNA提取效果。
RNA提取-反转录-半定量PCR
RNA提取原理及每个步骤的原理一、实验目的：提取组织中RNA,作为逆转录cDNA的原料二、实验原理：（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）a） TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
试剂主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
加入氯仿后离心，样品分成水样层（无色）和有机层（黄色）。
RNA存在于水样层中。
收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
三、实验材料：氯仿，异丙醇，Rnase-free ddH2O，75%乙醇（用Rnase-free水配制）四、实验步骤：（TIANGEN：Phase lock Gel TM Henny 配合Trizol A+提总RNA 操作）实验流程图细胞细胞选择冷贴壁细胞斗悬浮细胞pHS.71.匀浆处理（*打开离心机，降温）a） -80℃冻存组织，转移至普通2ml管中，每30mg组织加1ml Trizol A+。
用匀浆仪匀浆，样品体积不超过Trizol A+体积的10% （注：先加7003 Trizol A+,再加3003，防止外溢；一般匀浆1.5~2min,可设Timer）裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中2.将匀浆样品在20℃左右放置5min使RNA充分释放到溶液中3. 将Phase lock Gel TM（PLG）置于离心机中，15000Xg 离心30s离心到底部，不让贴壁4.将第2步中的匀浆样品全部转移至离心后的PLG中，每1ml Trizol A+加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s分层，PLG可在在水相和有机相之间形成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流出来。
RT-PCR操作步骤
RT-PCR步骤
一、总RNA提取
1. 取200mg组织，放到1.5mlEP管中，加入1mlTrizol剪碎。
2. 震荡30s。
3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。
4. 12000×g，4℃离心，15min。
5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。
6. 加等体积异丙醇，-20℃，30min。
7. 12000×g，4℃离心，10min。
在管底部可见微量RNA沉淀
8. 弃上清，加75%乙醇1ml，振荡。
9. 7500×g，4℃离心，10min。
10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥5-10min。
11. 沉淀溶于20μlDEPC水，取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280
12. 计算浓度与纯度，-70℃保存。
二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下
混匀快速离心一次
反应条件如下
-20℃冰箱冻存
三、PCR反应
混匀快速离心一次
反应条件如下
PCR产物-20℃冰箱保存
取PCR产物8μl加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。
100mA 30min 溴化乙锭染色，凝胶成象仪成象并保存结果。
TRIZOL法提取总RNA
目录
• 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 实验优化和常见问题处理
01
实验原理
Trizol的组成和作用
Trizol是一种常用的细胞裂解液，主要由苯酚、异硫氰酸胍和苯酚等成分 组成。
苯酚的作用是使蛋白质变性并释放核酸，异硫氰酸胍的作用是抑制DNA 酶活性，防止DNA降解，同时能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ效地变性蛋白质，使RNA充分释放。
RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳
将RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察28S和18S rRNA条带的亮度及完整性， 判断RNA的质量。
生物信息学分析
将RNA测序数据与基因组数据进行比对，分析转录本的拼接情况，评估RNA的 完整性。
反转录和PCR验证
反转录
将RNA反转录成cDNA，以便进行后 续的PCR验证。
效果。
去除DNA和蛋白质
在提取RNA的过程中，需要去除DNA 和蛋白质等杂质，以避免对后续实验 的干扰。
在去除杂质的过程中，需要注意控制 好离心时间和转速，以保证去除效果。
Trizol法中，DNA和蛋白质可以通过 离心和洗涤的方法去除。在离心后， 上清液中的DNA和蛋白质可以被去除， 而RNA则留在沉淀中。
在使用Trizol法时，通常采用玻璃匀浆器或匀浆机进行匀浆破碎。
抽提RNA
抽提RNA的目的是将RNA从细 胞碎片和其他杂质中分离出来。
Trizol法是一种常用的RNA抽提 试剂，它能够有效地分离出
RNA，同时抑制DNA和蛋白质 的降解。
在抽提过程中，需要按照试剂说 明书进行操作，注意控制好细胞 碎片的浓度和体积，以保证抽提
将提取的RNA存储在无菌环境中， 避免污染。
Trizol法提取组织和细胞RNA
Triz ol法提取组织和细胞RNA操作步骤：1、用剪刀将半个绿豆大小的组织剪碎，加入1 ml Trizol , 振荡器上震荡1分钟。
常温放置10 min，使核蛋白体完全分解。
2、加入200 ul 三氯甲烷（氯仿），盖紧管盖，剧烈震荡15 sec。
常温静置10 min。
3、在4度条件下，11000 rpm 离心15 min。
4、将水样层转移到一个新的离心管中，加入500 ul 异丙醇。
颠倒混匀后，常温静置10 min。
『离心后分为三层，下层为红色的苯酚-氯仿层，中间层，和上层的水样层。
RNA存在于水样层中』5、在4度条件下，11000 rpm 离心10 min。
6、用枪小心吸走液体，留沉淀在管底。
加入1 ml 75%的乙醇，在振荡器上震荡5sec，洗涤沉淀一次。
7、在4度条件下，8000 rpm 离心5 min。
8、将上清小心去掉，干燥沉淀10 min，加入适量的水溶解沉淀10 min。
9、检测浓度，鉴定RNA产量和纯度。
Takara PrimeScript RT reagent Kit逆转录Real-time PCR 用cDNA 操作步骤：1、按下列组分冰上配制RT反应液5×PrimeScript Buffer 4 ulPrimeScript RT Enzyme Mix 1 ulOligo dT Primer 1 ulRandom 6 mers 1 ulTotal RNA X（1 ug）RNA Free dH2O 补足20 ul2、混匀后，按如下反应条件进行：37度15 min85度 5 sec反应结束后将产物于-20度保存，待Real-time PCR检测。
cdna文库的构建步骤
CDNA文库的构建步骤一、引言在分子生物学和基因组学研究中，建立cDNA文库是一项重要的实验技术。
cDNA文库是从mRNA中合成的互补DNA（cDNA）的集合，它能够反映细胞中mRNA的表达情况。
本文将详细探讨cDNA文库构建的步骤和流程。
二、cDNA文库构建步骤2.1 RNA提取与纯化在构建cDNA文库之前，首先需要提取和纯化所需基因表达的RNA，这是启动构建cDNA文库的关键步骤。
1.准备细胞样本或组织样本。
2.使用适当的方法（例如TriZol法、RNA纯化试剂盒）提取总RNA。
3.通过离心等手段去除DNA和蛋白质等杂质。
4.使用酶切RNA的方法去除rRNA等非编码RNA。
2.2 逆转录合成cDNA逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，这是构建cDNA文库的关键步骤之一。
1.准备RNA模板和引物，引物可以是随机引物或特定引物。
2.将RNA样本与引物混合，在特定条件下进行反应。
3.添加逆转录酶（如Reverse Transcriptase），逆转录酶能合成cDNA的互补序列。
4.根据反应体系的要求进行反应，通常涉及温度和时间的控制。
5.利用热敏聚合酶（如Taq DNA Polymerase）可加热光敏不稳定的逆转录酶，从而停止逆转录反应，并保持产物的合成。
2.3 cDNA文库构建cDNA文库的构建涉及PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤，下面详细介绍。
2.3.1 PCR扩增1.准备扩增反应液：包括cDNA模板、引物（正向引物和反向引物）、dNTPs和聚合酶等。
2.设置PCR扩增条件，包括温度、循环数和时长等。
3.进行PCR扩增反应，其中cDNA模板将作为DNA合成的起始物，引物将提供扩增的特异性。
2.3.2 酶切1.使用限制性内切酶对扩增产物和载体进行酶切。
2.确定酶切产物的大小和酶切位点。
2.3.3 连接1.准备连接试剂盒和连接系统。
2.混合酶切产物和合适的载体，进行连接反应。
3.控制反应条件，如温度和时间。
RNA提取及逆转录
1.1.方法1.1.1.芋螺总RNA的提取本实验采用Trizol Reagent法从芋螺毒腺管提取总RNA，具体方法如下：（1）从液氮中取出芋螺毒腺管，用研磨器迅速研成粉末，再倒入预先冰浴好的微量匀浆器中；（2）吸取1.2mL Trizol加入到匀浆器，继续研磨使芋螺组织裂解以释放出其中的RNA；（3）将研磨好的浆液倒入1.5mL的离心管中，室温静置5min；（4）加入20％氯仿240μl，剧烈震荡15s，置于冰上10min；（5）4 ℃，12000rpm离心15min，小心转移上清至另一新的离心管中，（6）加入250μl高盐沉淀液和250μl异丙醇，反复颠倒30次左右，再放置冰上10min；（7）4 ℃，12000 rpm，离心10min，弃去上清；（8）加入1.2mL 75％乙醇，混匀后，4 ℃，9045 rpm离心5min，弃去上清；（9）空气中干燥10min，加入50~80 μl DEPC溶解沉淀，所得溶液即为RNA 溶液，于-80 ℃保存备用。
1.1.2.反转录合成cDNA利用大连宝生物TaKaRa公司提供的3’-Full RACE Kit试剂盒进行反转录反应，反应体系如下：（1）RNase Free ddH2O 4.5μl3’RACE Adaptor (5μmol/L) 1μlRNA(1.5 μg total RNA) 1μl混匀后，70 ℃变性10min，冰上急冷2min。
（2）上述反应溶液 6.5 μldNTP Mixture(10mmol/L each) 1μlRNase Inhibitor0.25μlM-MLV酶(RNase H-)0.25μl5×M-MLV Buffer2μl混合均匀后，42 ℃反应1h，70 ℃反应15 min。
反应结束后，将反转录产物于-20℃保存。
1.1.3.目的基因的巢式PCR扩增1.1.3.1.巢式PCR本实验中采用大连宝生物TaKaRa工程公司提供的3’-Full RACE Kit试剂盒进行巢式PCR反应，具体反应如下：3’RACEInnerPrimer：5'-CgCggATCCTCCACTAgTgATTTCACTATAgg-3'；3’RACE OuterPrimer：5'-TACCgTCgTTCCACTAgTgATTT-3'；3’RACEadaptor：5'-TACCgTCgTTCCACTAgTgATTTTTTTTTTTTTTTT-3' 第一轮PCR：（1）按下列反应体系配制反应液：反转录的cDNA模板3μl1×cDNA Dilution Buffer II7μl超家族外侧引物2μl3’-RACE外侧特异性引物2μl10×LA PCR Buffer II (Mg2+ plus)5μlLA Taq（5U/μL）0.5μl灭菌的去离子水30.5 μl总体积50μl（2）反应条件：（Tm-4）℃各超家族的PCR循环条件均为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸50s，30个循环；最后再72 ℃延伸10min，4 ℃保温。
TRIZOL法提取RNA
总细胞RNA的提取在建库过程中，由于cDNA合成这一步将使用通用引物oligo dT，因此在总RNA提取这一步中，提取纯化mRNA不是非常必要的。
提取高纯度的总细胞RNA足可以被用作cDNA合成的模板，目前提取RNA的方法很多，也有不少商业化的试剂盒。
1.TRIZOL法
(1)在上述方法中制备的带有细胞沉淀的Eppendorf管中加入1ml TRIZOL溶液，用手反复摇匀至细胞碎块完全被裂解，如不易完全裂解，可用移液器带有1ml无菌吸头反复吹打、研磨，至组织细胞完全裂解，液体基本澄清为止，必要情况下，可再次加入少许TRIZOL
溶液。
(2)将上述Eppendorf管置室温(25~27℃)静置15~20min后(也可置4℃较长时间)，每管加入0.2ml氯仿(02ml/ml)，在手中反复振荡摇匀，室温静置10min。
(3)将Eppendorf管置于高速台式冷冻离心机，或将普通离心机事先置4℃冰箱预冷。
在4℃12 000r/min离心10min。
(4)小心吸取上层水相置于另一无菌的新的Eppendorf管中，内含有提取的细胞总RNA。
(5)于管中加入05ml异丙醇，室温沉淀10min或4℃沉淀30min至1h。
(6)4℃12 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用75%无水乙醇洗两次。
(7)最后让沉淀的RNA在室温自然干燥，切勿抽干。
(8)每管用8~10μl无RNAase的纯水重悬干燥后的RNA，置于冰浴立即用于cDNA合成或置-70℃长期保存。
dna与rna鉴定实验报告
dna与rna鉴定实验报告DNA与RNA鉴定实验报告DNA与RNA鉴定实验是一种常用的生物技术手段，用于确定生物体内特定基因或RNA序列的存在和表达情况。
这项技术在医学、法医学、农业和生物学等领域都有着重要的应用价值。
本文将介绍一项基于DNA与RNA鉴定的实验报告，以展示其在科研和实践中的重要性和应用价值。
实验目的：本实验旨在通过DNA与RNA鉴定技术，确定目标基因在细胞中的表达情况，以及RNA在转录和翻译过程中的作用。
通过该实验，我们可以深入了解生物体内基因的表达调控机制，为相关疾病的治疗和预防提供理论和实践依据。
实验方法：1. 提取细胞总RNA和DNA：采用TRIzol法提取细胞总RNA和DNA。
2. RNA反转录为cDNA：采用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
3. PCR扩增：设计合适的引物，进行PCR扩增目标基因的DNA序列。
4. Real-time PCR：利用实时荧光定量PCR技术，检测目标基因在不同样本中的表达水平。
5. Northern blot：通过Northern blot技术，检测目标RNA在不同样本中的表达情况。
实验结果：1. 实时PCR结果显示，在病例组中，目标基因的表达水平显著高于对照组，表明该基因可能与相关疾病的发生和发展密切相关。
2. Northern blot结果显示，在病例组中，目标RNA的表达水平明显增加，与实时PCR结果相一致，进一步验证了目标基因的高表达情况。
3. PCR扩增结果显示，目标基因的DNA序列在所有样本中均有扩增产物，表明该基因在细胞中存在且具有一定的保守性。
实验结论：通过DNA与RNA鉴定实验，我们成功确定了目标基因在细胞中的表达情况，并验证了其在相关疾病中的潜在作用。
这为进一步研究该基因的功能和临床应用奠定了基础，也为相关疾病的治疗和预防提供了重要的理论依据。
总结：DNA与RNA鉴定实验是一项重要的生物技术手段，可以帮助科研人员深入了解基因的表达调控机制，为疾病的治疗和预防提供理论和实践依据。
定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)
定量逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）一、实验原理逆转录-聚合酶链反应(Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-qPCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo （dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、实验步骤（一）总RNA提取1.Trizol裂解收集各处理组细胞于1.5ml离心管，用PBS缓冲液洗涤1次，每5～10×106个细胞加入1ml Trizol，吹打数次，使细胞充分裂解，室温静置5min。
（裂解后若不能及提取RNA，可在加入Trizol后，将其保存于-80℃）2.氯仿（三氯甲烷）萃取（1）每管加入200ul氯仿（Trizol :氯仿= 5 : 1），盖好离心管后，涡旋震荡15s后，放置室温静置2min。
（2）4℃、12000rpm条件下离心15min后，溶液分为上、中、下3层，上层为水相（无色透明，含RNA），下层为有机层（粉红色，含DNA和蛋白质等）。
3.异丙醇沉淀（1）吸取上层水相（约500μL）至RNase-free离心管中。
（不要吸到中间层）（2）加入500μL异丙醇（与上层水相等量），颠倒混匀数次。
（不要剧烈摇晃）（3）4℃、12000rpm条件下离心15min后，吸弃上清液，保留底部白色沉淀。
4.75%乙醇洗涤沉淀（1）加入1mL 75%乙醇（现配现用，DEPC水:无水乙醇= 1:3，配制后上下颠倒混匀）洗涤沉淀，涡旋震荡。
（2）4℃、12000rpm条件下离心5min后，吸弃上清液，将离心管开盖干燥10min。
5. RNA干燥溶解每管加入50μL DEPC水，盖好离心管后，敲打溶解。
（二）RNA浓度和纯度检测1.提前10min对酶联免疫分析仪进行预热。
2.用DEPC水洗涤微量比色皿。
利用Trizol抽提RNA制备cDNA
利用Trizol抽提RNA制备cDNARNA抽提一、准备工作氯仿、异丙醇、75℅乙醇、无RNase的水或者0.5℅SDS(溶液均需用1‰DEPC处理过的水配制)二、操作步骤:1.匀浆处理:a)将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪匀浆处理（样品体积不应超过TRIzol体积10℅）；b)单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次（TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数；TRIzol加量不足可能引起提出取得的RNA有DNA污染）；c)细胞悬液离心细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或者1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。
加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。
一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理2.将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离（可选步骤：如样品中含有较多卵白质，脂肪，多糖或者胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10min，取上清。
离心得到的沉淀中包孕细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。
处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。
取澄清的匀浆液举行下一步操作。
）3.每使用1ml TRIzol则加入0.2ml氯仿，剧烈振动15s，室温放置3min；4.2-8℃10000×g离心15min。
样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。
RNA主要在水相中。
实验步骤中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅；5.把水相转移到新管中，（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后），用异丙醇沉淀水相中的RNA，（异丙醇的量应根据吸出的上清的量来决定，等体积加入），室温放置10min；6.2-8℃10000×g离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清；7.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。
小分子rna的提取方法
小分子rna的提取方法1. 实验背景小分子RNA（Small Non-Coding RNAs，sncRNA）是指包括miRNA、sRNA、piRNA等长度介于19~25nt之间及其衍生物的一类RNA。
sncRNA可以与DNA形成复合物，减少mRNA 的产生和翻译，调控基因表达，影响细胞的活动。
由于sncRNA在细胞中分量很少，要有效获取其物质，提取方法就显得尤为重要。
2. 提取方法(1) Trizol法：该法是著名的分离小分子RNA的首选方法，其基本原理是使用Trizol对样品进行细胞或组织破裂，破裂之后通过反转录酶将RNA转换为cDNA。
然后通过分离技术（例如甲醇沉淀或洗脱）获得sncRNA的纯化物。
(2)梯度离心法：该方法的原理是在液体里添加由高至低浓度的离子交替层，使细胞组分以不同的速度经过梯度层，从而获得纯化的细胞组分。
该方法的优势是能够获得高纯度的RNA，同时保留了大量的细胞因子。
但是，其缺点是比较复杂，操作技巧要求高，容易出现污染等问题。
(3)RNA直接抽提法：该方法融合了实时PCR和RNA同源聚合物抽提。
实时PCR它通过使用反转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过RNA同源聚合物抽提技术，在实时PCR中引入了一种抗性用于除去模板RNA的金属杂质。
该方法的优势在于可以有效除去反转录产物的外源物质，可以获得高纯度的反转录产物，以及可以实现实验高效率、快速定位反转录物的位点。
3. 结论小分子RNA（sncRNA）物质的提取是一项重要的工作，可以有效促进相关研究的进展。
目前最常用的提取方法是Trizol法和梯度离心法，具体应用要根据研究目的选择合适的方法。
最新的RNA直接抽提技术可以有效除去反转录产物的外源物质，获得高纯度的反转录产物，以及可以实现实验高效率、快速定位反转录物的位点，值得大力推广应用。
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法第一节。
概述从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增，即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析；比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。
总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段.自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统，目前cDNA合成试剂已商品化.cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒）.一。
RNA制备模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率.由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键.所有的组织中均存在RNA酶，人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）.所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。
凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。
DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心.试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。
但DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。
Trizol法提取RNA实验步骤
Trizol法使用步骤一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。
RNA质量的高低常常影响c D NA库，RT-PCR和Nor thernBlot等分子生物学实验的成败。
Trizol是一种新型总R N A抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、Glycoge n（可能需要）、 1.5ml Eppendo rf管（RNase-free）、 Tips（RNase-free）三、准备工作RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。
它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。
用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是R N ase完全失活。
它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。
取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNas e-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。
对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。
处理步骤如下：1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已D EPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
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Trizol法提RNA
试剂及材料：Trizol（3号冰箱 4℃ 3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以
上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞
仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、管、200μl EP管、EP管插板、冰盒
准备：
1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在管中，4℃保存。
2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存
于-80℃。
3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，
用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。
注：
均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。
均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。
b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂
1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。
TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。
-
步骤：
1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的 PBS 清洗 1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。
2.收集标本悬浮于 EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。
3.标本12000rpm，4℃离心15分钟（离心机提前预冷），然后小心取出离心管，置于冰上（注意：避免摇晃）。
4.用枪头慢慢吸取上清液（尽可能多吸，但避免吸到中间白色蛋白层），置于一新EP管中。
5.向管中加入异丙醇，混匀，室温孵育10分钟。
6.标本再置于离心机内，12000rpm ，4℃离心10分钟。
7.弃上清，加入事先配好的75%乙醇1ml（用DEPC水和100%乙醇配制），震荡，7500rpm 4℃离心5分钟。
8.倒掉上层乙醇，并保持离心管于倒置状态固定于离心管架上，待酒精挥发干（干燥5-10min即可）。
若管壁残留酒精较多，可用枪头吸干，但避免吸到RNA 沉淀。
9.加入20ulDEPC水，枪尖置于液面下吹打3次，混匀。
室温放置5-10分钟，溶解RNA。
10.置于冰上，吸取1ul RNA样本用紫外核酸蛋白分析仪（14楼）测RNA浓度。
评价标准：260/280接近2，不低于才可用。
&
测RNA浓度步骤：准备一管DEPC水（空白对照）；
a、连接nanodrip2000,打开电脑桌面软件
b、nuclide---TYPE选择RNA---加1-2ul水---点击Blank来进行空白对照检测并保存参比图谱，虽然不需要在每个样品之间进行空白校准，但我们建议在检测多个样品时，最好每30min进行一次空白校准。
30min后，最后一次做空白检测的时间将显示在软件下面的状态栏上。
c、用无尘纸擦干上下基座上的样品后，再加1-2ul水---点击measure，结果应该是差不多为一水平线，吸光值变化应不超过（10mm光程），显示浓度在+—以内。
d 、用无尘纸擦干上下基座上的样品后，再加入待测RNA溶液1ul，读数。
11.—80℃保存或供逆转录用即可。
RNA逆转录合成cDNA
试剂：TakaRa试剂盒（#AK5301）
》
仪器：PCR仪
步骤：
1.计算RNA需要量：反应体系中所需RNA的量为1000ng，体系为20ul(10ul+10ul)。
用200ulEP管，加入RNA的体积为V=1000ng/RNA浓度。
剩余体积用无RNA 酶的水（试剂盒内有）定容至10ul。
O
样本 RNA体积 RNA酶Fee H
2
1
2
3
NC
681
2.配制反应试剂混合液（Takara试剂盒，2号冰箱，—20℃，一层）。
@
O 3 18
RAN Fee H
2
5X Prim Buffer 4 24（最后再加）Prim RT Enzyme 1 6
Rando引物 1 6
Oligo引物 1 6
总体积 10 60
（总共配的份数要比需要的多2个体系，原因：有损耗）
3.吸取10ul反应混合物加至每管（每管10ul反应试剂混合物+10ulRNA液），混匀后置于冰上，14楼行逆转录。
（1）37℃ 15分钟（反应时间）
（2）85℃ 5秒钟（逆转录酶失活）
（3）4℃保存（相当于4℃冰箱）
操作步骤：开机—fiels—precious—CYQ—run（21min）
4 将cDNA产物稀释10倍（20ul产物+180ulDEPC，根据实际情况，组织样本可以稀释20倍，RNA提的不好的话可以稀释5倍），-20℃保存待用。