PCR技术(包含引物设计)知识分享
PCR简介及PCR引物设计
动物科技学院
贾斌
聚合酶链式反应 (PCR)
聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction PCR是高效快速扩增DNA技术。应用广泛。
1985年Kary Mullis发明聚合酶链反应技术。 1993年获诺贝尔化学奖。
一、PCR的原理
• PCR 定义：根据 DNA 复制和变性的原理， 体外扩增DNA片段或cDNA片段的技术。 • 根据已知的待扩增目的基因两侧的序列， 人工合成上游和下游引物。利用 TaqDNA 聚合酶反应，大量扩增DNA。
核酸凝胶电泳技术
凝胶板
EB
制 作 胶 块
常用的6X载样缓冲液
Ⅰ Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
Detection of PCR products
UV Light
Gel contains Ethidium Bromide, which binds to the DNA. When bound, the EtBr will fluoresce when exposed to UV light
PCR引物的设计原则：
• 5.碱基随机分布
引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚 嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′ 端不应超过 3 个连续的 G或C，因这样会使引物在 G+C富集序列区错误引发。
• 6.引物自身
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折 叠成发夹状结构引物本身复性。这种二级结构会因 空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工 判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
• 4.）在实验加样中不一定每一个样品都换一个枪头，可 在阳极槽中反复吸打电泳缓冲液以清洗。（对于 Southern印迹转移和需要回收DNA片段的电泳，则应该 每一个样品用一个枪头加样，避免样品交叉污染。）
pcr知识点总结归纳
pcr知识点总结归纳PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种用于抑制、合成、扩增DNA的技术。
PCR技术广泛应用于科学研究、临床诊断、法医鉴定和生物工程等领域。
PCR技术的出现不仅提高了DNA的扩增速度，而且在很大程度上解决了DNA分析的难题和可行性问题。
PCR技术的关键在于DNA的扩增，通过特定的引物（primer）和热稳定的DNA聚合酶在不同温度下进行多次循环反应，使目标DNA片段扩增成百上千倍。
PCR技术的应用可以在较短时间内获得充足的DNA，为后续的实验提供了可行性基础。
PCR技术是分子生物学研究的重要工具，掌握PCR技术的原理和操作方法对于分子生物学研究者来说至关重要。
下面将对PCR技术的知识点进行总结和归纳，包括PCR的基本原理、PCR反应体系、PCR引物设计、PCR技术的优缺点以及PCR技术在生物学研究中的应用等方面。
一、PCR的基本原理PCR技术是通过DNA的酶解、DNA的引物延伸、DNA的片段合成来实现DNA扩增。
PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性步骤：将DNA的双链解链成两条单链，即使DNA解链。
2. 退火步骤：将引物与DNA模板结合成双链，即使DNA复性。
3. 延伸步骤：在退火变性条件下将引物作为起始核酸，然后DNA聚合酶将其扩增成DNA。
通过以上三个步骤的循环反应即可实现DNA的多次扩增。
二、PCR反应体系PCR反应体系主要包括DNA模板、引物、DNA聚合酶、四种dNTPs、缓冲液和辅助剂等。
1. DNA模板：PCR反应的起始材料，可以是基因组DNA、cDNA或其他DNA模板。
2. 引物：在退火步骤中将与DNA模板特异性结合，为DNA的扩增提供起始核酸。
3. DNA聚合酶：用于合成DNA，PCR反应中通常采用热稳定的DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶。
4. dNTPs：即脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP，是DNA聚合的四种脱氧核苷酸单体。
PCR使用说明引物设计技巧
PCR使用说明引物设计技巧PCR（聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，可用于扩增DNA片段以及进行基因分型、疾病诊断和DNA克隆等应用。
在PCR实验中，引物的设计是非常关键的步骤之一，合理的引物设计可以确保PCR反应的特异性和高效性。
以下是一些PCR引物设计的技巧和原则。
1.引物长度：引物长度应该在18到30个核苷酸对之间，一般来说，较短的引物可以提高反应的特异性，但也容易导致非特异性扩增。
较长的引物可以提高特异性，但也会降低PCR反应的效率。
2.引物的碱基组成：引物的G+C含量应在40%到60%之间，避免过高或过低的含量，以确保引物的熔解温度适中。
3.引物之间的互补性：引物之间不应有任何互补性，以避免引物之间的杂交和产生非特异性扩增。
4. 引物的熔解温度：引物的熔解温度（Tm）应该相近，通常设计为60℃至70℃之间。
可以使用一些在线工具来计算引物的Tm，例如NCBI的Primer-BLAST。
5.引物的位点选择：引物应该选择在目标序列上独特的位点，避免引物在其他不需要扩增的区域上产生扩增。
可以使用序列比对工具，如BLAST，来确定引物的特异性。
6.引物的末端设计：引物的末端应该避免酶切位点，以防止引物被酶切和降解。
此外，末端的碱基对的GC含量应保持平衡，以确保引物的稳定性。
7.引物的序列结构：引物的序列中应避免重复和倒序重复的碱基序列，因为这些序列容易形成引物间的二级结构和非特异性扩增。
8.引物的交叉反应：引物的序列应该经过认真筛选，避免与其他非目标序列发生交叉反应。
在引物设计前，可以先使用基因序列比对工具，如BLAST，来检查引物是否会与其他区域发生交叉反应。
9.引物的引导方向：引物的引导方向应与目标序列的末端互补，以确保正确的扩增方向。
总而言之，PCR引物的设计应遵循特异性、高效性和可重复性的原则。
合理设计的引物对PCR实验的成功至关重要，可以提高扩增产物的特异性和产量，并避免非特异性扩增和交叉反应的发生。
PCR引物设计原理
PCR引物设计原理PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增特定DNA序列。
PCR引物设计是PCR实验的关键步骤，合理的引物设计能够确保PCR反应的特异性和高效性。
1.引物长度：通常，PCR引物的长度在18-25个碱基对之间，较短的引物能够提高PCR扩增的特异性，但也会减弱引物与模板DNA的互补性。
较长的引物能够提高PCR扩增的选择性，但也会增加二次结构的可能性。
2. 引物温度：引物通常被设计成具有相似的熔解温度（Tm），即引物与模板DNA解离的温度。
Tm计算可根据引物序列中的碱基组成和长度来进行，通常采用Wallace规则或Marmur规则。
相似的Tm可以确保引物在PCR反应中一起工作，提高特异性和扩增效率。
3.引物特异性：为了确保PCR扩增的特异性，引物应在模板DNA中有唯一的互补区域。
这可以通过NCBI的BLAST或其他引物设计软件进行引物序列比对来验证。
特异性也可以通过引物的3'端碱基匹配限制来提高。
此外，避免引物之间的重叠或互补也可以减少非特异性扩增的风险。
4.引物GC含量：GC含量是影响PCR引物的熔解温度和特异性的重要因素。
高GC含量的引物比低GC含量的引物具有更高的熔解温度，因此在高GC含量的引物中，引物长度应适当缩短，以保持相似的Tm。
此外，高GC含量的引物在互补区域中与模板DNA结合更牢固，有利于特异性扩增。
5.引物末端修饰：末端修饰可以改变引物的特性，如增加引物的亲合性、稳定性和特异性。
一般采用引物末端加入磷酸基团或胺基基团的修饰，用于提高引物的稳定性和抗核酸酶降解的能力。
6.引物序列的配对：在PCR反应中，两个引物需要配对以形成DNA双链，在DNA扩增过程中选择性地与模板DNA结合。
引物配对需要满足碱基之间的互补关系。
因此，引物序列的选择应考虑到碱基之间的配对能力。
总结起来，PCR引物设计的原理主要涉及引物长度、温度、特异性、GC含量、末端修饰和序列配对。
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则
PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。
同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。
如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。
如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。
一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。
而且四种碱基的分布最好随机。
不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。
否则P1引物设计的就不合理。
应重新寻找区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。
但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。
这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩引物3′端要避开密码子的第3位。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
（完整版）PCR技术（包含引物设计）
（完整版）PCR技术（包含引物设计）聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板- 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
PCR技术
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外95度时解旋，35度时引物与单链按碱基互补配对结合，再调温度至65度左右DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
由PCR技术制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在95度，35度，65度之间很好的控制。
1.PCR原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合酶--Taq 酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
pcr实验知识点总结
pcr实验知识点总结PCR实验（聚合酶链反应）是一种在生物化学中广泛使用的分子生物学技术，用于扩增特定的DNA片段。
该技术由Kary Mullis于1983年发明，并于1993年获得了诺贝尔化学奖。
以下是关于PCR实验的知识点总结。
一、PCR原理PCR的基本原理是利用DNA聚合酶对单链DNA进行复制的能力。
这个过程分为三个步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：在高温（通常为95℃）下，双链DNA被解旋成两条单链模板。
2. 退火：温度降低（一般为50-65℃），引物与模板DNA的互补序列结合。
3. 延伸：在适宜的温度（72℃左右）和DNA聚合酶的作用下，引物沿着模板DNA向两侧延伸，形成新的双链DNA。
这三个步骤循环进行，每次循环都会使目标DNA的数量翻倍，经过几十到几百次循环后，就能得到大量的目标DNA。
二、PCR所需材料1. DNA模板：待扩增的目标DNA。
2. 引物：两段短的寡核苷酸，与目标DNA的两端互补。
3. dNTPs：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
4. Taq DNA聚合酶：能在高温下保持活性的酶，用于催化DNA的合成。
5. 缓冲液：提供合适的pH和离子环境。
三、PCR操作步骤1. 设计引物：根据目标DNA的序列设计出两条引物，分别与DNA的正反两条链互补。
2. 配制反应体系：将模板DNA、引物、dNTPs、Taq酶和缓冲液按照一定比例混合。
3. PCR循环：将反应体系放入PCR仪中，设定好变性、退火和延伸的温度和时间，开始循环反应。
4. 产物检测：可以通过凝胶电泳等方法检测PCR产物的大小和数量。
四、PCR的应用1. 分子诊断：如病原体检测、基因突变检测等。
2. 基因克隆：将目的基因扩增后，可以方便地进行后续的克隆和表达。
3. 序列分析：通过扩增特定的基因区域，可以进行基因测序和SNP分析等。
4. 生物考古学：可以从古代样本中提取DNA并进行扩增，研究古生物的遗传信息。
五、PCR实验注意事项1. 引物设计：引物应具有良好的特异性和稳定性，避免产生非特异性扩增和二级结构。
PCR技术基本原理及相关知识
PCR技术基本原理及相关知识PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中常用的基因扩增技术，其基本原理是利用体外体内的DNA聚合酶（通常是热稳定聚合酶）在DNA模板上进行逐渐增加的连续DNA合成过程。
1. 变性（Denaturation）：将DNA双链融解成两条单链。
通常使用高温（约94-98℃）使DNA的双链结构分离，使得DNA模板变为两个单链，以便后续的反应。
2. 退火（Annealing）：在较低的温度下，引物（primers）与DNA模板结合。
引物是一段长度为15-30个核苷酸的短DNA或RNA分子，能与目标DNA序列的两端互补碱基对结合。
这些引物在PCR反应中起到限制DNA合成的作用。
3. 扩增（Extension）：在适温下，DNA聚合酶利用引物开始在目标DNA序列作为模板上进行DNA合成，不断扩增目标序列。
常用的DNA聚合酶是热稳定的聚合酶，常见的是来自热液单纯病毒Taq聚合酶。
PCR反应通常进行30-40个循环，每个循环包括上述三个步骤。
每个循环的时间和温度取决于目标DNA序列和反应条件。
除了基本的PCR技术原理，以下是一些相关知识：1. 反向转录PCR（Reverse Transcription PCR，RT-PCR）：可以在RNA模板上合成相应的DNA序列，通过引物合成cDNA，然后进行PCR。
RT-PCR常用于分析转录水平、检测RNA病毒和研究基因表达调控。
3. 嵌段PCR（Nested PCR）：在传统的PCR反应后，再次进行PCR，使用内部引物扩增上一次PCR反应获得的产物。
嵌段PCR提高了灵敏度和特异性。
4. 随机引物PCR（Random Primed PCR）：使用随机引物作为引物，能扩增DNA模板上的所有可能的序列，常用于建立基因文库和DNA指纹。
PCR技术在许多领域应用广泛，如医学诊断、遗传学研究、基因工程等。
其快速、高效、灵敏和特异性的特点使其成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
高中生物选修三pcr技术
高中生物选修三pcr技术
PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它可以扩增DNA片段。
以下是高中生物选修三PCR技术相关的内容：
1. PCR反应原理：PCR反应利用DNA聚合酶对DNA序列进行复制和扩增。
主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
2. PCR反应体系：PCR反应需要的试剂包括DNA模板，引物（前向引物和反向引物），Taq DNA聚合酶，dNTPs和缓冲液等。
3. PCR反应步骤：
（1）变性：将DNA模板加热至95℃，使其解旋成两条单链。
（2）退火：降温至引物的退火温度，使引物与模板互补结合。
（3）延伸：加入Taq DNA聚合酶和dNTPs，开始扩增DNA片段。
4. PCR应用：PCR技术可以用于基因克隆、基因表达分析、基因诊断等领域，例如DNA指纹鉴定、疾病基因检测等。
5. PCR优化：PCR反应条件对扩增效率有很大影响，需要根据实验目的和样品特点进行优化，如引物设计、反应体积、温度梯度等。
希望这些信息对你有所帮助。
如有任何疑问，请随时询问。
引物设计知识点总结图
引物设计知识点总结图引物设计是在分子生物学研究中常用的实验技术之一，用于扩增目标DNA序列。
本文将就引物设计的相关知识点进行总结和图示，以帮助读者更好地理解和应用该技术。
一、引物设计的基本原理在引物设计之前，我们需要了解PCR（聚合酶链式反应）的基本原理。
PCR是一种快速扩增DNA的方法，其关键在于引物的选择和设计。
引物是PCR反应中的两段寡核苷酸序列，分别与目标DNA序列的起始点和终止点互补配对。
通过PCR反应，引物与目标DNA序列结合，聚合酶随后从引物的3'端开始合成新链，形成所需扩增的DNA。
二、引物设计的关键要点1. 引物长度：引物长度通常为18-30个碱基，过短的引物可能无法特异性地结合目标DNA，而过长的引物则可能导致不必要的非特异扩增产物。
2. 引物序列：引物的序列应与目标DNA的互补序列相匹配，确保引物能够特异性地结合目标DNA并进行扩增。
3. 引物峰值温度(Tm值)：Tm值是引物设计中非常重要的参数，它表示引物与目标DNA的解链温度。
引物的Tm值应相似，以确保二者能够在相同的温度下扩增。
4. 引物GC含量：引物的GC含量直接影响其Tm值，较高的GC 含量通常意味着较高的Tm值。
适当调整GC含量可以帮助优化引物的扩增效率。
5. 引物间的相互作用：在引物设计过程中，需要避免引物之间的互补性，以免引物间发生二次结合导致非特异性扩增。
三、引物设计的步骤示意图[图示]四、引物设计的实际应用引物设计广泛应用于分子生物学领域中的DNA克隆、基因表达分析、突变检测等实验中。
具体应用包括：1. DNA克隆：通过引物设计扩增目标DNA序列，可用于获得目标基因的全长序列或特定片段。
2. 基因表达分析：通过引物设计扩增特定基因的编码区域，可用于研究该基因的表达水平和调控机制。
3. 突变检测：通过引物设计扩增包含突变位点的DNA片段，可用于检测目标基因的突变类型和频率。
五、引物设计的常见问题及解决方法1. 引物的Tm值差异较大：可通过调整引物的长度和GC含量来优化Tm值，使其相似。
高二生物pcr技术知识点
高二生物pcr技术知识点PCR（聚合酶链反应）是一种在生物学领域广泛应用的技术，它能够通过体外扩增DNA特定片段，为研究者提供了强大的工具。
本文将介绍高二生物学中关于PCR技术的知识点，帮助学生更好地理解和掌握该技术的原理和应用。
第一部分：PCR技术的原理PCR技术基于DNA的复制过程，通过在体外模拟DNA的自然复制过程来扩增目标DNA片段。
其原理可以分为三个重要步骤：变性、退火和延伸。
1. 变性：PCR反应开始时，将待扩增的DNA目标加热至95摄氏度，使其双链DNA解旋成两条单链。
这一步骤被称为变性。
2. 退火：降温时，引入两条单链DNA上的引物（寡核苷酸序列），并使其与目标序列的两端互补结合。
引物的设计需要确保与目标序列的两端完全互补。
这一步骤被称为退火。
3. 延伸：在退火的条件下，酶DNA聚合酶（Taq聚合酶）将通过添加缺失的碱基，将引物延伸至DNA目标序列的3'端。
这个过程重复多次，从而扩增目标序列。
这一步骤被称为延伸。
第二部分：PCR技术的应用PCR技术作为分子生物学中一项重要的工具，被广泛应用于各个领域，如疾病诊断、基因表达分析和DNA指纹鉴定等。
1. 疾病诊断：PCR技术可以在病人的体液（如血液或尿液）中扩增潜在病原体的DNA，并通过特定的引物检测其存在，从而帮助医生进行疾病的早期诊断。
2. 基因表达分析：PCR技术可以用于分析目标基因在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达水平。
通过比较PCR扩增产物的数量和大小，可以了解基因表达是否受到调控，并进一步研究其生物学功能。
3. DNA指纹鉴定：PCR技术在法医学和亲子鉴定中发挥着重要的作用。
通过扩增特定位点的DNA片段，可以从不同个体中鉴定出独特的DNA指纹，以确定个体的身份或亲子关系。
第三部分：PCR技术的优点和注意事项PCR技术相比传统的DNA扩增方法有许多优点，但也需要注意一些细节，以确保结果的准确性。
1. 优点：- 高度敏感和特异性：PCR技术可以扩增极少数量的DNA分子，并能够区分不同的DNA序列。
PCR引物设计汇总
PCR引物设计汇总PCR（聚合酶链反应）引物是PCR反应中的两个核酸序列，它们分别位于待扩增的DNA片段的两端。
合理设计的PCR引物是PCR反应成功的关键，它们决定了PCR扩增的特异性和效率。
1.引物长度：一般选择18-25个碱基的引物长度。
引物过短可能导致非特异性扩增，引物过长则降低扩增效率。
2.引物碱基组成：引物中尽量避免使用连续的同类碱基，如连续的A、T、C或G。
同时，引物设计中应尽量均衡使用四种碱基，避免GC含量过高或过低。
3.引物Tm值：引物的Tm值（解链温度）是很重要的参数，它决定了PCR反应的温度条件。
一般，引物的Tm应在50-60摄氏度之间，且相互之间的Tm值差别不应超过两度。
4.引物特异性：引物应具有足够的特异性，以确保只扩增目标DNA片段，避免扩增到非特异性产物。
5.引物末端：引物的3'末端不应含有碱基修饰物，以免影响引物的扩增效率。
下面是几种常见的PCR引物设计方法：1.传统引物设计方法：传统引物设计方法主要是基于DNA序列的特点进行设计。
根据待扩增DNA片段的序列信息，可以选择合适的引物位置，并确保引物的长度、碱基组成和Tm值满足设计原则。
2.引物设计软件：引物设计软件是根据一系列预先设定的算法和规则，自动设计合适的引物。
常用的引物设计软件有Primer3、Primer-BLAST等。
这些软件可以根据用户输入的目标序列信息，自动生成合适的引物序列，并提供引物的Tm值、特异性等信息。
3.引物库：引物库是包含大量已设计好的引物序列的数据库。
研究人员可以直接从引物库中选择合适的引物序列，以节省时间和精力。
常用的引物库有NCBI的PrimerBank和UCSC的Primer Database。
4.引物修饰：5.引物交互作用：引物交互作用是指多对引物之间的交叉杂交，形成二聚体或多聚体结构。
通过设计引物之间的相互作用，可以提高PCR的特异性和扩增效率。
常用的引物交互作用方法有引物交叉互补法、引物竞争法等。
PCR技术
PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于复制和扩增DNA片段。
PCR技术已广泛应用于基因分型、疾病诊断、基因工程等领域。
其中，引物设计是PCR技术的关键一步，决定了PCR扩增的特异性和效率。
引物是PCR反应中的两段短DNA序列，它们与待扩增的DNA片段的两端相互互补。
PCR反应中的引物设计需要考虑以下几个因素：1.引物长度：引物一般为15-30个碱基对长，过短会导致非特异性扩增，过长则会影响反应的效率。
2.引物的GC含量：引物的GC含量应该在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会影响PCR反应的特异性和效率。
3. 引物的熔解温度（Tm）：引物的Tm是指引物与待扩增DNA片段结合时的温度，通常设计时要求引物的Tm相近，一般在55-65摄氏度之间。
引物的熔解温度可以通过计算公式进行估算，如Wallace等提出的公式：Tm = 4(G+C) + 2(A+T)。
4.引物序列的特异性：引物的序列应该特异性地与待扩增的DNA片段相互配对，避免与其他非目标DNA片段发生非特异性扩增。
在引物设计中，可以使用生物信息学工具进行引物的特异性分析，如比对引物序列与基因组数据库，检查是否存在交叉重复序列。
5.引物之间的相互作用：在PCR反应中，引物之间的相互作用可能导致非特异性扩增或二聚体的形成。
因此，在引物设计中，要避免引物之间的互补或相似性，尤其是在引物的3'末端。
在实际引物设计中，可以使用计算机辅助设计工具来进行引物序列的设计和分析，如Primer3、OligoAnalyzer等。
这些工具根据上述引物设计的原则，通过计算引物的物理化学性质和与待扩增DNA片段的匹配情况，辅助用户选择合适的引物序列。
需要注意的是，引物设计是PCR技术成功的前提，但并不是唯一影响PCR扩增效果的因素。
在实验中，还需进行反应条件的优化，如PCR反应体系的设计、反应温度和时间的调节等，以确保PCR反应能够高效、特异地扩增目标DNA片段。
PCR、引物设计及逆转录PCR解析
模板：1 μL 上游引物：0.2 μL 下游引物：0.2 μL Easy Taq 酶：0.1 μL Easy Taq Buffer：1 μL dNTP：0.8 μL ddH2O：6.7 μL
94℃ 94℃ 56.2℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 30s 30s 30s 7min ∞
30个循环
PCR的R仪
实时荧光定量PCR仪
引物设计的目的
为了找到一对合适的核苷酸片段， 使其能有效地扩增模板DNA序列。
引物是PCR特异性反应的关键，同 时也与PCR扩增的效率密切相关。 引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
引物设计的基本原则
• PCR（Polymerase Chain Reaction) 技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外 扩增技术。
• 1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis 等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学 奖。
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、
cDNA，也可以使细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的
特异性；确定扩增产物长度。
➢DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动
PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。
➢缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离
因此仅mRNA可被逆转录。
逆转录引物：
（3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡
核苷酸引物，仅产生待分析基因的 cDNA。
3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以 引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72℃， 30 ～ 60s ）。
pcr技术原理 引物
pcr技术原理引物
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，可在短时间内扩增特定DNA片段，以便于后续的检测和
研究。
以下是PCR技术的原理：
PCR反应由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
第一步是变性。
反应体系中的DNA模板被加热至95℃，使其
双链DNA解聚成两条单链DNA。
此时，DNA的氢键被破坏，使得DNA链分离。
第二步是退火。
反应体系中的温度降低至50-65℃，此时两条
单链DNA的引物（primer）与目标DNA的互补序列结合。
引物是一小段单链DNA，具有能与目标DNA互补配对的序列。
第三步是延伸。
反应体系中加入DNA聚合酶（DNA polymerase）和四种核苷酸（dNTPs），温度升高至72℃。
DNA聚合酶通过互补配对原则，在每个引物的3'端引导下，
延伸合成新的DNA链。
此时，产生的新DNA链将与原DNA
模板相同，并且延伸长度为引物的互补序列。
通过多次重复以上三个步骤，PCR反应可以迅速扩增特定的DNA片段。
每个PCR循环将产生2倍的DNA，经过多个循环，DNA的数量呈指数倍增，从而得到大量特定的DNA产物。
PCR技术具有高度敏感性和高选择性，在分子生物学、医学
诊断、基因工程等领域被广泛应用。
pcr高中知识点总结
pcr高中知识点总结一、PCR的基本原理PCR技术是利用DNA聚合酶在适宜条件下，通过一系列特定的温度循环，将DNA特异性扩增为大量可检测的DNA片段。
PCR基本原理如下：1. 双链DNA的变性PCR反应涉及三个温度环节：变性（Denaturation）、退火（Annealing）和延伸（Extension）。
首先，对DNA双链进行变性使其解链成两条单链，变性温度通常在90-95℃之间。
2. 引物结合在合适的温度下，引物（primers）结合到DNA的末端以作为DNA聚合酶的起始点。
引物的选择至关重要，因为它们决定了PCR扩增的特异性和效率。
3. DNA延伸在适当的温度下，DNA聚合酶利用单链DNA作为模板，在引物的辅助下合成新的双链DNA。
延伸过程是在50-72℃之间进行的。
二、PCR的重要步骤PCR反应主要包括以下几个重要的步骤：1. 反应体系准备：包括DNA模板、引物、dNTPs、DNA聚合酶和缓冲液等。
2. 变性：将DNA变性为两条单链。
3. 退火：引物结合到DNA模板上。
4. 延伸：DNA聚合酶合成新的DNA链。
5. 循环：重复以上步骤，增加目标DNA的数量。
三、PCR反应组分1. DNA模板：PCR反应需要一段目标DNA的模板，可以是来自细胞核、质粒、线粒体等。
2. 引物：引物是PCR反应中的关键组分，通常为20-30个碱基对的寡核苷酸，起到引导DNA聚合酶合成新链的作用。
3. dNTPs：包括脱氧腺苷酸、脱氧胸苷酸、脱氧鸟苷酸和脱氧胞苷酸，是DNA合成的单体，是DNA聚合酶合成新链的构建单元。
4. DNA聚合酶：通常选用热稳定的聚合酶，如Taq聚合酶。
5. 缓冲液：提供PCR反应的适宜pH值和离子浓度。
四、PCR反应影响因素PCR反应的效果受多种因素影响，主要包括以下几点：1. 引物设计：引物的选择和设计对PCR的效果至关重要，需要考虑引物的特异性、长度和GC含量等。
2. 温度梯度：变性、退火和延伸的温度对PCR反应的特异性和效率有较大影响。
pcr引物知识点总结
pcr引物知识点总结引言聚合酶链式反应（PCR）是一种用于在体外合成DNA的技术。
PCR可以在短时间内扩增一小段DNA序列，从而产生大量的特定DNA片段。
PCR引物是PCR反应中不可或缺的组成部分，是在PCR反应中实现特异性扩增的关键因素。
本文将从引物的设计原则、引物的性质、引物的应用以及引物的优化等方面对PCR引物知识点进行总结。
一、引物的设计原则1. 引物长度PCR引物的长度通常在18-30个碱基对之间，推荐引物长度为20-25个碱基对。
过短的引物可能无法很好地与靶序列结合，导致扩增效率低；过长的引物会增加引物与非特异性模板的结合可能性，降低扩增的特异性。
2. 引物GC含量引物的GC含量应在40-60%之间，这样有利于引物与靶序列的稳定结合。
高GC含量可提高引物与靶序列的结合力，但也会增加引物与非特异性模板的结合可能性。
低GC含量的引物则可能导致与靶序列的结合力过低，影响扩增效率。
3. 引物的Tm值引物的Tm值是引物与靶序列结合时形成双链DNA的温度。
引物的Tm值应该尽量接近反应的最优温度，通常在50-65°C之间。
过高或过低的Tm值都会导致引物与靶序列的结合不稳定，影响PCR扩增效率。
4. 引物的特异性引物的特异性是指引物与靶序列结合的特异性。
引物在设计时要尽量避免与非靶序列的相似区域结合，避免产生假阳性结果。
为了保证引物的特异性，可以利用生物信息学工具对引物进行序列比对，确保引物只与目标序列结合。
5. 引物的配对引物的配对是指两个引物在PCR反应中共同引物化。
引物之间的相互作用应遵循一定的配对规则，避免引物之间的二聚体或引物之间的互相结合，影响PCR反应的效率和特异性。
二、引物的性质1. 引物的结构PCR引物通常为单链DNA，包括前向引物和反向引物。
前向引物是与靶序列的5'端相对应的引物，反向引物是与靶序列的3'端相对应的引物。
引物的设计需遵循前向引物与反向引物相互配对的原则，确保引物在PCR反应中的特异性与效率。
PCR引物设计
2、 退火： 引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物 的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对 程度以及引物的浓度。实际使用的退火温度比 扩增引物的Tm值约低5℃。一般当引物中GC含 量高，长度长并与模板完全配对时, 应提退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时 间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 通常退火温度和时间为45℃-65℃, 30 sec-2 min。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。 所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产 生非特异性扩增，影响产量。 (9) 简并引物 应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有 一种密码子的Met, 3′端应不存在简并性。否 则可能由于产量低而看不见扩增产物。
引物及引物设计：
引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引 物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。 引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列 原则：(1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低 退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性 增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中 G+C含量通常为40%-60%。(3) 四种碱基应随机 分布，在3'端不要存在连续3个G或C,因这样易导 致错误引发。
(4) 引物3′端最好与目的序列阅读框架中密码子 第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆 动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3′端应不 存在二级结构。(6) 两引物之间尤其在3′ 端不能 互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物 间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补 性。 (7) 引物5′端对扩增特异性影响不大，可在 引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、 起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物 素、荧光素、地高辛等。通常应在5′端限制酶位 点外再加3个保护碱基。
PCR技术和引物设计
PCR技术和引物设计PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
引物设计是PCR技术中的重要步骤，它决定了PCR反应的特异性和效率。
下面将对PCR技术和引物设计进行详细介绍。
PCR技术是由美国科学家凯瑟琳·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明的，他因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR技术利用了DNA的特性：DNA可以通过热变性（denaturation）使双链分离，然后通过低温环境下的适当引物进行互补连接，再通过DNA聚合酶进行扩增。
整个扩增过程可以重复进行多次，从而大幅度增加了DNA的数量。
PCR技术已经在许多领域得到了广泛应用，比如医学诊断、基因工程、遗传疾病研究等。
PCR技术主要包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，将反应体系温度升至94-95摄氏度，使DNA双链变性并分离成两个单链（denaturation）；然后，降低温度至50-60摄氏度，引物与模板DNA互相结合（annealing）；最后，将温度升至72摄氏度，DNA聚合酶在适当条件下扩增DNA片段（extension）。
一次PCR循环一般需要30秒至2分钟，整个PCR过程需要重复数十次至数百次。
在PCR反应中，引物设计至关重要，它决定了PCR反应的特异性和效率。
引物通常是由20-30个核苷酸组成的DNA或RNA片段，其中的序列要与待扩增的DNA靶标序列互补。
引物的设计需要考虑以下因素：1.引物长度：引物长度一般为18-30个碱基，较短的引物具有更好的扩增效率，但其特异性可能降低；较长的引物特异性较好，但扩增效率可能降低。
2.引物的GC含量：引物的GC含量越高，PCR反应的特异性越好。
一般来说，引物的GC含量应在40-60%之间。
3.引物的Tm值：Tm值是指引物与DNA靶标序列之间的解离温度，一般在55-65摄氏度之间。
Tm值的高低决定了引物的特异性，过低的Tm值可能导致引物与非特异DNA片段结合，影响扩增效率和特异性。
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P C R技术(包含引物设计)聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPCR)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA．后酶切片段自身环化．以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。
该扩增产物是线性的DNA 片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。
用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段。
（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。
（3）不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR 技术称不对称PCR。
在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50～100÷1比例。
在最初的10～15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。
（4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA 时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。
应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。
（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。
若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。
为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。
这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。
这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。
（6）多重PCR技术(multiplex PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。
主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。
（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5’-端和3’-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。
（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。
（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。
平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。
短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。
进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，故这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。
由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。
反应五要素---引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。
【引物的GC含量和Tm 值应该协调：Tm=4（G+C）+2（A+T）】④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3‘端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
5’端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
⑧引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
（3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR产物的产量。
（4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。
（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
RT-PCR -- 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。
总RNA提取（-70℃保存）Trizol法：1、取组织100㎎于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、加氯仿0.2ml（总体积的1/5），振荡混合，室温放置5min4、4℃，离心12000 rpm，15min5、取上层液相（约400μl）移入一新1.5ml EP管中，加等体积异丙醇（约400μl）,振荡混合，室温保存10min6、4℃，离心12000 rpm，10min7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合8、4℃，离心7500 rpm，5min9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA 充分溶解（可保存在液氮或低温冰箱-70℃）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值调零：750ul DEPC水测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml= OD260×40×150 ug/ml= OD260×6 ug/ulA1/A2应在1.8-2.0之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。