免疫染色一抗稀释液
Western一抗稀释液
北京雷根生物技术有限公司
Western 一抗稀释液
简介：
Western 一抗稀释液(Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫印迹中的一抗的稀释和配制。
使用Leagene Western 一抗稀释液配制的一抗，可以在4℃保存6个月，并且可以反复多次使用。
组成：
操作步骤(仅供参考）：
1、 根据一抗的使用说明，以及样品中目的蛋白含量，按照适当比例(例1:1000、1:500等
比例)稀释一抗。
2、 直接用于Western 孵育膜。
一次Western 结束后，可以回收稀释的一抗4℃保存，用
于下次Western 实验。
注意事项：
1、 为了能使抗体可以反复多次使用，建议尽量在4℃条件下进行一抗和蛋白膜的结合反
应，以减缓一抗的衰减速度。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号 名称 PW0040 PW0040 Storage Primary Antibody Dilution Buffer 50ml 100ml 4℃ 使用说明书
1份。
免疫印迹常用试剂(除一抗外)
200µg/0.2ml 1000µg/1ml 浓缩液 亲和纯化抗体
产品应用
WB=1:200-500 Elisa =1:1000-2000 IP=1:20-100 IHC=1:200-500
2.酶标二抗
产品编号
bse-0295G
英文名称
Goat Anti-Rabbit IgG/HRP
中文名称
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG
产品标准
1L（100ml浓缩液）
产品应用
蛋白印迹(Western Blot,WB)
13.WB洗涤液
产品编号
C-0043
英文名称
WesternBlotWashBuffer
中文名称
WB洗涤液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
30ml/48元 70ml/78元
产品标准
10X浓缩液
免疫印迹常用试剂（除一抗外）
1.内参抗体
产品编号
bs-0061R
英文名称
β-Actin(内参抗体)
中文名称
β-肌动蛋白（抗体）（浓缩液）
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
兔抗人、羊、狗、猪、牛、兔、鸡、猴和大、小鼠β-Actin多克隆抗体
产品价格
0.1ml/400元 0.2ml/650元 1ml/1860元
产品编号
C-0075
中文名称
KODAK胶片
生产产地
KODAK原装
产品类别
曝光胶片
产品价格
100张/盒/240元
产品标准
5X7英寸
产品应用
转膜曝光
17.硝酸纤维素膜
Western一抗稀释液
北京雷根生物技术有限公司
Western 一抗稀释液
简介：
Western 一抗稀释液(Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫印迹中的一抗的稀释和配制。
使用Leagene Western 一抗稀释液配制的一抗，可以在4℃保存6个月，并且可以反复多次使用。
组成：
操作步骤(仅供参考）：
1、 根据一抗的使用说明，以及样品中目的蛋白含量，按照适当比例稀释一抗。
2、 直接用于Western 孵育膜。
一次Western 结束后，可以回收稀释的一抗4℃保存，用于下次Western 实验。
注意事项：
1、 为了能使抗体可以反复多次使用，建议尽量在4℃条件下进行一抗和蛋白膜的结合反应，以减缓一抗的衰减速度。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号 名称 PW0040 PW0040 Storage Primary Antibody Dilution Buffer 50ml 100ml 4℃ 使用说明书
1份 编号
名称 DC0032
Masson 三色染色液 PE0103
Acr-Bis (30%,29:1) PT0001
BCA 蛋白定量试剂盒 PW0041
Western blot 二抗稀释液 PW0046
Western 封闭液 TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。
免疫组组织化学染色操作过程
1.接蒸馏水1L2.PBST配置：PBS ：Tween20=1000：1 （PBS 2000mL-其中用1000mL配PBST）3.30%的过氧化氢配成3%的过氧化氢(200ml）4.配DAB 第二天配(1滴:1000ul)5.一抗稀释（当天用当天配）第一天1．烤片：石蜡切片，烘烤箱内60度，3到5小时（目的使组织与玻片牢固结合）2．脱蜡：二甲苯(10min×3)3．复水：无水乙醇5min×3，然后95%，75%，50%乙醇各5min。
(目的是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容）4．自来水冲洗5min，蒸馏水浸泡5min5．抗原修复：热修复（目的是将抗原表位暴露，使得后续的一抗可以结合上去）。
①配置修复液：修复液主要有柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0），EDTA（pH=8.0）和TE（pH=9.0）三种，其酸碱度不同，不同抗体的要求不同，要根据抗体和试剂的说明书来配；②高压锅：半锅抗原修复液，蒸汽鸣笛开始算时间，进行3min，5mim，10min，15min进行摸索时间（如果是电热锅从沸腾开始算时间，修复时间要久一些）。
煮完自然冷却。
6.洗涤：①蒸馏水5min，②PBST：3min × 2 ③ PBS：3min× 17.免疫组化笔画圈：切片置于湿润操作盒上。
（若要破膜的话，移液枪滴0.3%Triton溶液于标本上45min）8.淬灭（阻断）:（目的去除内源性过氧化物酶），30%过氧化氢加蒸馏水配成3%溶液，切片浸泡15min。
9.洗涤：①PBST：3min × 2 ② PBS：3min× 110.生物素阻断，依次滴A，B剂切片浸泡，各10min，依次洗涤：①PBST：5min × 2 ，②PBS：5min× 111．封闭（目的为了减少二抗与组织的非特异蛋白结合，需用二抗来源的血清进行封闭）。
羊血清，移液枪。
免疫荧光染色 稀释抗体
免疫荧光染色稀释抗体免疫荧光染色是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定细胞或组织中的特定蛋白质。
这种技术利用免疫学原理，结合荧光染料，使特定抗原以荧光信号的形式显现出来。
稀释抗体在免疫荧光染色中起着非常重要的作用，是实现染色成功的关键。
稀释抗体是指在染色过程中需要将所用的抗体进行适当的稀释，以达到较高的特异性和敏感性。
稀释抗体的关键是确定合适的稀释倍数，使得抗体能够充分结合目标抗原，同时阻断非特异性结合。
本文将从稀释抗体的选取和稀释倍数的确定两个方面来探讨免疫荧光染色中稀释抗体的重要性。
首先，稀释抗体的选取非常关键。
在选择稀释抗体时，需要考虑到抗体的来源、纯度以及特异性等因素。
一般来说，购买商业化的抗体更加方便，但需要确保其从可靠的供应商购买，并验证其在其他实验中的可靠性。
此外，可以选择在实验室内进行抗体制备，通过免疫小鼠或小动物获得抗体。
抗体的纯度也是选择稀释抗体的重要指标之一。
纯度越高的抗体在稀释过程中的非特异性结合风险越低。
常见的抗体纯度检测方法包括SDS-PAGE凝胶电泳、Western Blot等。
若所用的抗体具有较高的非特异性结合，可能会导致染色结果的假阳性，从而影响实验的准确性。
其次，稀释倍数的确定是稀释抗体的另一个关键环节。
一般来说，稀释倍数的确定需要先进行初步的优化实验，以找到最佳的抗体稀释倍数。
常用的稀释倍数从1:50到1:200不等，具体需要根据实验中的情况来确定。
在初步的稀释实验中，可以设置不同的抗体稀释倍数，将其分别加入已固定的细胞或组织样本中，观察染色结果的强度和特异性。
一般来说，若抗体过度稀释，可能导致信号强度过弱，难以观察到目标抗原的区域；而若抗体过度浓缩，则可能出现非特异性结合和背景信号过高的问题。
通过逐步调整稀释倍数，最终选择出最佳的抗体稀释倍数。
这个倍数能够既保证抗体与目标抗原的高特异性结合，又使背景信号尽量降低，从而得到清晰可辨的染色结果。
不同细胞或组织类型对抗体的表达和结合情况有所不同，因此需要在不同样品中进行优化。
抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制
抗体稀释液和ELISA相关溶液的配制1、抗体或免疫球蛋白稀释液0.01mol/L pH7.2PBSNaH2PO4·2H2O 0.39克Na2HPO4 1.27克NaCl 0.85克NaN3 200mg H2O（蒸馏水）至1000ml2、ELISA洗液及HRP标记抗体稀释液p H7.4，PBSTNaCl 2.0克KH2PO4 0.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克KCl 0.2克NaN3 0.2克H2O 至1000ml 吐温（Tween）20 0.5ml3、包被液（简称CB）pH9.6Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克NaN3 0.2克H2O 至1000ml 4、ELISA底物液（可溶性底物）磷酸-柠檬酸缓冲液pH5.00.1mol/L柠檬酸（21.014克/100ml) 24.3ml0.2mol/L Na2 HPO4（28.4克/1000ml) 25.7mlH2O 50ml5、DAB底物液（不溶性底物，组化病理等）0.05mol/L pH7.6 Tris-HCLTris 6.05克HCL(36%) 3.15克（约2.7ml浓HCL）H2O 至1000mlDAB为3´，3´二氧基联苯胺，不溶性底物，呈棕红色6、DAB溶液配制：（组化及Western blot 显色）称DAB30mg，用0.05mol/L pH7.6Trs-HCL缓冲液100ml溶解,如有沉淀，过滤后使用，一般新鲜配制使用。
用前加入1%H2O2 1-1.5ml,H2O2浓度为0.01%，混均后使用。
7、3´，3´，5´，5´，-四甲基联苯胺（TMB）溶液配制：用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF)或无水乙醇，将TMB配成1%浓度，4°C保存半年以内使用。
使用前，用pH5.0磷酸-柠檬酸底物液9.9ml加入0.1ml(1mg/TMB)1%TMB液，再按每毫升TMB加入30%的H2O2 1ul，混匀后立即使用。
HE染色和免疫组化步骤
二十四、HE染色：1›伊红染液配方：称取伊红2 g，溶于5 ml 蒸馏水，逐滴加入冰醋酸，边加边搅拌至糊状，再加入数毫升蒸馏水，继续滴加冰醋酸至沉淀不再增加，过滤，将沉淀和滤纸一起置于50-60℃温箱中烘干，溶于400 ml 95%的酒精中。
2›苏木精染液配方：A液：苏木精2 g ；无水乙醇250 ml 。
B液：钾矾（硫酸铝钾）17.6 g；水750mL 。
具体步骤：分别按以上配方配好A液和B液，并混合后加入碘酸钠0.2g，冰醋酸20mL染液配好后，将瓶口用裹着棉花的纱布塞紧，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。
成熟时间约1个月。
此染液需要提前1个月配置好，备用，如果想要促进它的成熟，可在染液里加入0.2 g碘酸钠。
此染液染核效果良好，染色均匀，不会发生沉淀，而且可以长期稳定保存。
此染液可同时与伊红等进行细胞的染色。
整个染色过程包括五个内容：脱蜡复水、染色、脱水、透明和封片。
1›脱蜡复水：a. 65℃温箱烤片30min后, 石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min,b. 石蜡切片依次各级浓度酒精复水：经100%酒精→100%酒精→95%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精→蒸馏水，各1-2 min。
2›染色：a. 苏木精染色约4min。
染色时间主要根据染色剂的成熟度以及室温高低，可以适当缩短或延长（现在的成熟度4min左右）。
b. 水洗5-10minc. 脱水Ⅰ切片经50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→95%乙醇，各1-2 min。
d. 复染伊红染色10s-20s ，着色以较浅为宜。
3›脱水Ⅱ：用95%乙醇洗去切片多余的红色，然后放入100%无水乙醇两次各1.5 min，共3min。
4›透明：切片依次经乙醇-二甲苯等量混合液1.5min、纯二甲苯Ⅰ5min、Ⅱ5min。
二甲苯要定期更换，切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。
5›封片滴加中性树胶，注意组织不能有气泡。
石蜡切片免疫荧光染色方法
对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
碧云天生物技术 Beyotime Biotechnology 产品说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology订货热线：400-168-3301或800-8283301订货e-mail：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站微信公众号MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody产品编号产品名称包装AF0240 MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody 50μl产品简介：来源用途交叉反应性分子量Rabbit ICC, IF M 67KDa WB, Western blot; IP, Immunoprecipitation; IF, Immunofluorescence; IHC, Immunohistochemistry; ICC, Immunocytochemistry;FC, Flow Cytometry; ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; ChIP, Chromatin Immunoprecipitation Assay.H, Human;M, Mouse; R, Rat; C, Chicken; Cw, Cow; Dg, Dog; Gp, Guinea pig; Hm, Hamster; Hr, Horse; Mk, Monkey; Pg, Pig;Rb, Rabbit; S, Sheep; Z, Zebrafish; All, all species expected.配套提供了Western一抗稀释液，可以用于Western检测或其它适当用途时的一抗稀释。
建议抗体使用时的稀释比例如下(实际使用时需根据抗原水平的高低作适当调整)：WB IP IF IHC ICC FC ELISA ChIP- - 1:200 - 1:200 - - -抗体详细信息如下:About this AntibodyName MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal AntibodyCategory Polyclonal antibody(pAb); Primary antibodyIsotype IgGPurification Peptide affinity purifiedAbout the ImmunogenImmunogen This antibody is produced by immunizing rabbits with a synthetic peptide (KLH-coupled) corresponding to MuERVL-Gag.Gene ID - SwissProt - Synonyms - CategoryBackground A large number of retrotransposons are expressed when the zygotic genome is first transcribed, including the endogenous retroviruses (ERVs), LINE-1 elements, and the non-autonomous SINE elements. At the 2C stage, MuERV-L/MERVL retrovirus-like elements are transiently de-repressed and produce 3% of the transcribed mRNAs. Following the 2C stage, MERVL-retroelement expression is silenced. The newly study discovered that this regulated pattern of MERVL expression overlapped with greater than one hundred 2C-specific genes that have co-opted regulatory elements from these foreign retroviruses to initiate their transcription.包装清单：产品编号产品名称包装AF0240 MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody 50μlAZ050 Western一抗稀释液50ml－说明书1份保存条件：MuERVL-Gag Rabbit Polyclonal Antibody -20ºC保存，Western一抗稀释液-20ºC或4ºC保存，一年有效。
免疫荧光染色技术
免疫荧光染色技术标签: 荧光免疫染色技术2009-04-07 22:28最近看了几篇文章，文中都涉及一项技术叫：免疫荧光染色。
感觉这项技术不错，实验的图片经过染色很漂亮，再一merge，更加说明问题，今日网上搜来有关介绍，恶补一下。
竟觉也不是和特别，所谓难者不会，会者不难，大概也就是如此了。
将该项技术介绍如下：（转载）荧光免疫染色和DAPI染色实验1．实验原理免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。
实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。
利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。
二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。
另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。
DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。
结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。
Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。
后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。
免疫荧光染色一抗的成分
免疫荧光染色一抗的成分
免疫荧光染色一抗的成分，主要包括抗体、缓冲液、防腐剂和辅助试剂等。
免疫荧光染色是一种常用的实验技术，用于检测和定位特定蛋白在细胞或组织中的表达情况。
一抗作为免疫荧光染色的重要组成部分，其成分和特点对于实验结果具有重要影响。
首先，一抗的主要成分是抗体。
抗体是一种特异性蛋白质，能够与特定的抗原结合。
在免疫荧光染色中，一抗的选择对于实验结果至关重要。
一抗的种类和来源多种多样，包括单克隆抗体和多克隆抗体，不同的抗体对于不同的蛋白具有不同的特异性。
其次，一抗的成分还包括缓冲液。
缓冲液是用来稀释和稳定抗体的溶液，可以帮助维持适当的pH值和离子强度，保证实验条件的稳定性。
另外，一抗中还会添加一些防腐剂，如NaN3等。
防腐剂的作用是防止抗体在存储和使用过程中受到污染和降解，保证抗体的稳定性和活性。
此外，一抗中可能还包括一些辅助试剂，如牛血清白蛋白（BSA）、牛血清或羊血清等。
这些辅助试剂可以帮助稀释和稳定抗体，减少非特异性结合，并提高实验的灵敏度和特异性。
总之，免疫荧光染色一抗的成分包括抗体、缓冲液、防腐剂和辅助试剂等。
这些成分共同作用，确保了免疫荧光染色实验的准确性和可靠性。
在进行免疫荧光染色实验时，科研人员需要根据具体的实验要求和条件选择合适的一抗，并合理配置相关成分，以获得准确可靠的实验结果。
免疫荧光抗体稀释比例
免疫荧光抗体稀释比例
免疫荧光抗体的稀释比例通常取决于具体的实验目的、样本类型以及试剂的特性。
稀释比例是根据试剂的浓度和样本中所需的最佳信号强度来确定的。
一般来说，对于免疫荧光抗体的稀释比例，可以进行初步的试验和优化。
这需要根据具体实验中的试剂浓度、样本类型、抗体特异性等因素来确定最佳稀释比例。
下面是一般的步骤：
1.初步试验：初步试验可以尝试一系列不同稀释比例的抗体，例如1:50、
1:100、1:200等。
2.免疫荧光染色：使用不同稀释比例的抗体对样本进行免疫荧光染色处理。
3.观察结果：观察免疫荧光信号强度，选择最适合的稀释比例。
信号过强
或过弱都可能影响结果的准确性。
4.优化：一旦确定了初步的稀释比例，可能需要进行微调或优化，以获得
最佳的信号和背景比。
值得注意的是，不同抗体的最佳稀释比例可能会有所不同，并且样本类型、处理条件等因素也可能影响最终的稀释比例选择。
因此，在进行实验前最好先进行初步的优化试验来确定最佳的稀释比例。
免疫组织化学染色前的准备事项
免疫组织化学染色前的准备事项1.2 对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验；根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度。
1.3 抗体的原液应于分装后置于-20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价降低)。
1.4 抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。
1.5 抗体的稀释。
(1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。
(2)或用0.05M TBS(生理盐水三羟基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。
(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。
2被检测组织内抗原的修复2.1 经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。
进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。
有的抗体不需要进行抗原修复。
应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。
2.2 抗原修复缓冲液。
(1)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。
(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高pH值的EDTA(50mM Tris，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。
2.3 抗原修复的常用方法。
(1)胰蛋白酶消化法：①组织切片脱蜡、水化。
②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。
③37℃下温育20～40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。
④蒸馏水冲洗，终止反应。
⑤阻断内源性过氧化物酶。
⑥进行免疫组织化学染色。
[配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。
](2)胃蛋白酶消化法：①组织切片脱蜡、水化。
②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
免疫组化实验方案
鼠脑组织ICH实验操作步骤1. 所用试剂及耗材1)一抗：Anti-Tyrosine Hydroxylase, clone LNC1. Millipore. Cat. # MAB318.Lot # NG1899912.2)二抗：Envision TM Detection Kit. Gene Tech (Shanghai) Company Limited.Code No: GK500705/10.3)一抗稀释液：免疫染色一抗稀释液。
碧云天生物技术研究所。
Code No：P0103。
4)PBS：PBS缓冲液(PH 7.2-7.6)。
武汉博士德生物工程有限公司。
Code No：AR00305)枸橼酸盐缓冲液：PH 6.0。
武汉博士德生物工程有限公司。
Code No：AR00246)H2O2：3%(PBS配置）7)病理载玻片、病理盖玻片、免疫组化湿盒、免疫组化笔、切片盒、晾片板。
2. 免疫组化1)二甲苯脱蜡透明：每次10 min，连续2次。
2)梯度乙醇洗脱：100%浓度洗脱5 min，100%、95%、95%浓度洗脱2 min，然后用去离子水冲洗。
3)抗原修复：用去离子水冲洗切片，然后将组织放入枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）中，使用微波炉加热，先高火5 min，然后中低火10 min。
修复后自然冷却到室温。
4)PBS洗片：修复后的切片使用PBS冲洗，每次3 min，连续3次。
5)3% H2O2（PBS配置）封闭：避光孵育10 min，去离子水冲洗。
6)PBS洗片：每次3 min，连续3次。
7)封闭：用滤纸擦干切片组织周围的水，用免疫组化笔画圈。
然后滴加10 %血清（PBS配置）封闭非特异性作用位点，每张载玻片加200 μl到300 μl封闭液，室温孵育1 h。
8)一抗（1:1000）孵育：封闭后的切片，用移液器吸掉封闭液，然后每张切片滴加200 μl的一抗（抗体使用一抗稀释液稀释到所需浓度），湿盒中室温孵育1 h。
细胞免疫荧光染色
细胞免疫荧光染色细胞免疫荧光染色1.盖玻片处理：用前1天用纱布擦净灭菌，放入6孔板。
2.接种细胞：较低密度为适宜，约2000－10000个/孔（根据细胞生长状态决定，常用5000个/孔），2ml（浓度为2500/ml）3.24h后细胞贴壁，根据需要同步16－18h，干预处理，细胞融合60－70％时染色最佳4.37度PBS洗涤，3ml/孔，贴边加（可将6孔板倾斜，加完样在放正以防冲掉细胞，0.5min。
室温PBS也可，但4度禁止，否则细胞易皱缩。
5.固定：4％多聚甲醛(1ml)，先常温稳定5min，然后4度，10min，（可放在饭盒内）。
6.吸掉多聚甲醛，迅速加PBS 5ml/孔，洗涤5min×3次，镜下观察，细胞形态如前。
7.透化：0.1％－4％triton×－100，1ml/孔，室温透化5min （triton是去污剂，目的是将脂质成分破坏，如细胞膜、核膜等，故不影响实验结果，可不用洗涤）8.5％BSA（滤过）室温封闭至少20min（可配制含5％BSA和0.2％triton的混合液，将两步合成一步）风干9.用5％BSA将一抗1：50或1：100（常用）稀释至EP管200ul/玻片10.将纱布垫在饭盒中，去离子水润湿纱布，准备封口膜。
11.吸去BSA，迅速滴加一抗，从玻片1中央滴加，液体会自行扩散至全片。
为保持细胞湿润，将6孔板封好，放入饭盒，37度孵育1－2h（有利于抗体结合），再室温3－4h。
（或室温2h后，4度过夜）注意勿晃动6孔板，防止抗体不均或从玻片洒出。
12.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床）13.用5％BSA将二抗1：50稀释（得到的实际浓度为1：100，因二抗本身已经被甘油稀释1倍），也可1：200稀释。
室温1.5h后可显荧光（放在饭盒里，避光）14.PBS洗涤10min*3次（可用western的摇床）15.免疫荧光显微镜观察。
泡在2ml的PBS中保存。
怎么样稀释一抗
怎么样稀释一抗简单说几句，封闭血清的原理主要有两点，第一是待检样本会非特异性的和蛋白结合，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分非特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。
第二是待检样本中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间结合。
BSA则无法封闭Fc受体。
不能用来自一抗同物种的血清举个例子就清楚了，比如一抗是鼠抗人的抗体，二抗是兔抗鼠的抗体，你要先加一抗后再封闭的话，一抗就会结合到固相表面上，这种结合力是非特异性的疏水作用力，这种作用力是比较强的，经过处理的固相表面如硝酸纤维膜，酶标板对蛋白的吸附力更强，你再去封闭就没有作用了。
当然，也不是说封闭蛋白就完全不会封闭掉一抗的蛋白结合位点，在蛋白过量的条件下，蛋白质之间会有黏附和堆积作用，但这种作用通常是不稳定的。
如果你所选择的一抗与固相抗原亲和力较高，在适合的buffer条件下，一抗会竞争它的结合位点。
蛋白质之间那点黏附和堆积作用力当然竞争不过它啦。
下面是从书上摘下的几句话，希望对你有帮助：" 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。
最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5~1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。
必要时可加入2%~5% 牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。
作用时间为10~20min。
也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)。
有明显溶血的血清不能""对消除背景的非特异性染色有很好的效果。
当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。
""抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。
这种反应没有化学键的形成。
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北京雷根生物技术有限公司
免疫染色一抗稀释液
简介：
免疫染色一抗稀释液(Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer)可以用于免疫染色时一抗(primary antibody)的稀释和配制。
使用Leagene 免疫染色一抗稀释液稀释和配制的一抗可以在4℃保存和使用6个月，可以反复多次用于免疫染色。
按照每个一抗稀释10ml 计算，100ml 免疫染色一抗稀释液可以稀释10次一抗。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 参考所用的一抗的说明书，以及样品中目的蛋白的含量，按照适当比例，例如1:1000～1:500稀释一抗。
2、 一抗稀释后即可直接用于免疫染色。
3、 一次免疫染色结束后，可以回收稀释的一抗，4℃保存，以用于下次的免疫染色。
注意事项：
1、 为了能使抗体可以反复多次使用，建议尽量在4℃进行一抗和蛋白膜的结合反应，以减
缓一抗的衰减速度。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
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编号 名称 IH0340 Storage 免疫染色一抗稀释液 100ml 4℃ 使用说明书 1份 编号
名称 DC0032
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多聚赖氨酸溶液(10×PLL,1mg/ml) IH0119
内源性生物素封闭液 PW0053
Western 抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD 比色法)。