免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术实验步骤及方法
免疫荧光技术实验步骤及方法免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
10个关键点免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。
除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。
1、选择合适的细胞种板密度细胞数过多时，生长过密，细胞结构不清，易导致染色背景深，细胞数过少时，会使贴壁贴壁不佳，状态不好，一般以六孔板为例，（1-5）×100000比较适宜。
2、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。
现在固定液选择比较多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。
之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。
前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。
使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。
另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。
3、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。
在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。
使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
4、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。
但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。
如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
5、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。
免疫荧光技术实验报告
免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术实验报告免疫荧光技术是一种通过将荧光标记的抗体与特定抗原结合来检测和定位生物分子的方法。
本实验旨在探究免疫荧光技术的原理和应用，并通过实验验证其可行性。
一、实验原理免疫荧光技术基于抗原与抗体的特异性结合原理。
在本实验中，我们选择了一种常用的抗原-抗体反应，即兔抗小鼠IgG。
首先，将小鼠IgG注射到兔体内，兔体会产生针对小鼠IgG的抗体。
然后，将这些抗体与荧光染料标记，形成荧光标记的抗体。
当荧光标记的抗体与小鼠IgG结合时，可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
二、实验步骤1. 准备样本：将小鼠IgG溶解在缓冲液中，制备不同浓度的小鼠IgG溶液。
2. 固定标本：将小鼠IgG溶液滴加到载玻片上，使其均匀分布，并用乙醇固定。
3. 孵育抗体：将荧光标记的兔抗小鼠IgG加入载玻片上，与固定的小鼠IgG反应。
4. 清洗样本：用缓冲液洗涤载玻片，去除未结合的抗体。
5. 观察结果：在荧光显微镜下观察载玻片上的荧光信号。
三、实验结果在实验中，我们观察到荧光显微镜下载玻片上出现了荧光信号。
荧光的强度与小鼠IgG的浓度成正比，即小鼠IgG浓度越高，荧光信号越强。
这表明荧光标记的抗体与小鼠IgG发生了特异性结合。
四、实验分析免疫荧光技术的原理是利用抗体与抗原的特异性结合来检测和定位生物分子。
在本实验中，我们成功地将荧光标记的抗体与小鼠IgG结合，形成荧光信号。
这表明免疫荧光技术可以用于检测特定抗原，并通过荧光显微镜观察到信号。
免疫荧光技术在生物医学研究中具有广泛的应用。
它可以用于检测病原体、研究细胞蛋白定位、诊断疾病等方面。
例如，在病原体检测中，可以使用荧光标记的抗体来检测病原体的存在和定位，从而提高病原体的检测灵敏度和准确性。
在细胞蛋白定位研究中，免疫荧光技术可以用于观察蛋白在细胞内的分布情况，从而揭示蛋白的功能和相互作用关系。
在疾病诊断中，荧光标记的抗体可以用于检测特定抗原的存在，从而帮助医生进行疾病的早期诊断和治疗。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光的技术介绍
免疫荧光的技术介绍免疫荧光技术是一种基于抗原-抗体反应的荧光标记技术，常用于生物医学研究领域中的细胞、组织以及溶液等样本的分析和检测。
以下是关于免疫荧光技术的详细介绍：1.技术原理免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，从而实现对样本中特定抗原的精确检测。
抗原-抗体反应具有高度的特异性和灵敏性，使得免疫荧光技术成为一种具有高分辨率和高灵敏度的分析方法。
2.常用样本类型免疫荧光技术适用于多种类型的样本，包括细胞、组织、溶液等。
其中，细胞样本可以是单细胞悬液、细胞培养物或组织切片等；组织样本可以是病理切片、器官组织等；溶液样本则可以是血清、尿液、脑脊液等体液成分。
在制备样本时，需要保持样本的稳定性和活性，以便进行后续的实验操作。
3.标记方法免疫荧光技术的标记方法主要包括荧光素、生物素、抗生物素等。
其中，荧光素是最常用的标记物之一，其具有高荧光量子产率、良好的光稳定性以及优良的生物相容性等特点。
生物素和抗生物素则是一对亲和素和抗亲和素的标记物，可以用于放大免疫反应的信号，提高检测的灵敏度。
此外，标记过程中的关键控制参数包括抗体浓度、孵育时间、温度和pH值等，需要根据实验的具体情况进行优化和调整。
4.荧光显微镜观察在进行免疫荧光实验时，需要使用荧光显微镜对样本进行观察和拍照。
荧光显微镜的基本构造包括激发光源、滤光片、目镜和物镜等部分。
在观察时，需要选择适当的激发光源和滤光片，以最大程度地激发荧光信号并抑制背景噪声。
同时，需要调节物镜和目镜的焦距，以便清晰地观察到样本中的荧光信号。
拍照时，需要选择合适的曝光时间和增益，以便真实地记录样本中的荧光信号。
5.数据分析与解释对于观察到的荧光信号，可以使用相关的图像分析软件进行定性和定量分析。
这些软件通常具备多种图像处理功能，如背景噪声的去除、信号强度的测量、目标区域的识别等。
结合文献资料，可以对数据分析结果进行深入探讨，从而得出有关样本中抗原分布和含量的有价值的信息。
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类一、免疫标记法及其分类1.荧光免疫法原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb 竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
免疫荧光测试项目
免疫荧光检查可分直接法、间接法、夹心法和补体法。
1. 直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10分钟后弃去，使标本保持一定湿度。
（2）滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30分钟）。
（3）取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序经过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5 分钟，不时振荡。
（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
（5）立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度来判断免疫复合物的多少，常用半定量法，（-）阴性，无荧光；（±）高倍镜下似乎可见；（+）低倍镜下似乎可见，高倍镜下明显可见；（++）低倍镜下明显可见，高倍镜下清晰可见；（+++）低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；（++++）低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。
2. 间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。
如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10分钟后弃去，使标本片保持一定湿度。
（2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30分钟。
（3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5分钟，不时振荡。
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学和生命科学领域中的分析技术。
根据不同的用途和操作方法，免疫荧光技术可以分为以下几类：
1. 直接免疫荧光法
直接免疫荧光法是一种最简单的免疫荧光技术，通常用于检测单一抗原。
该方法将荧光标记的抗体直接与待检测物接触，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
2. 间接免疫荧光法
间接免疫荧光法是一种常用的免疫荧光技术，可用于检测多个抗原或抗体。
该方法通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，然后使用荧光标记的二级抗体识别和结合一级抗体，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
3. 间接免疫荧光染色法
间接免疫荧光染色法是一种特定的间接免疫荧光技术，通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，再使用被标记的一级抗体结合一级抗体，形成免疫复合物。
该方法可以用于检测多个抗原或抗体，并且适用于细胞和组织的检测。
4. 光度法免疫荧光
光度法免疫荧光是一种快速、准确的免疫荧光技术，用于检测微量物质，如细菌和病毒。
该方法通过对待测样品进行化学反应，形成荧光物质，然后测量荧光信号强度。
5. 免疫电子显微镜法
免疫电子显微镜法是一种高分辨率的免疫荧光技术，用于检测细胞和分子水平上的抗原或抗体。
该方法使用标记有金颗粒的抗体，进行免疫染色，然后使用电子显微镜观察荧光信号。
总之，免疫荧光技术是一种多功能的生物分析技术，可用于各种生命科学领域，其中不同的分类方法可以根据需要进行选择。
免疫荧光技术（immunofluorescencetechnique）又称荧光抗体技术
免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。
始创于40年代初，1942年coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
一、实验的基本原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。
由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。
免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
二、实验方法1、直接法这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。
滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。
标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。
此法的优点是简单、特异。
但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。
图一、直接免疫荧光法原理示意图2、间接法根据抗球蛋白试验的原理，用荧光素标记抗球蛋白抗体(简称标记抗抗体)的方法。
检测过程分为两步：第一次，将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。
第二，滴加标记抗抗体。
如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。
此法的优点是敏感性高于直接法，而且无需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。
免疫荧光、SDS-PAGE、Western-blot实验技术
小心仔细。
Western Blot常见问题分析
SDS-PAGE电泳
胶不平？ 凝胶漏液？
➢ 胶板洗刷干净 ➢ 加入APS和TEMED的量要合适 ➢ 加入试剂后摇匀，使其充分混
合，防止部分胶块聚合不均匀 ➢ 温度合适，受热不均匀导致胶
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 线性分离范围（KD)
15
10-43
12
12-60
10
20-80
8
30-90
操作步骤：采用垂直式电泳槽装置
配制分离胶(12%)（1.0mM的玻璃板）
ddH2O 30%丙烯酰胺贮存胶 1.5M Tris-HCl 10% SDS 10% AP TEMED
3.3ml 4.0ml 2.5ml 0.1ml 0.1ml 4.0μlห้องสมุดไป่ตู้
三、Western blotting
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的 方法，称为Southern印迹法。
间接法
1.固定 2.通透（选做） 3.封闭（选做） 4.一抗孵育 5.荧光二抗孵育 每步都需要PBS或PBST洗涤3次，每次5分钟。
补体法
利用补体反应，通过形成抗原-抗体-补体复合物发射荧光
二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分 子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯 基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋 白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同 密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用 考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。 因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表
免疫荧光组织(细胞)化学技术：如何设置对照(直接法、间接法和
免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和
为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，
必须在初次试验时设置对照：
1、直接法
（1）标本自发荧光对照
标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称
为自发荧光。
（2）抑制试验
可分为一步方法和二步方法。
一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，
再加在标本上染色，结果应为阴性。
二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光
抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。
（3）阳性对照
用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。
如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。
2、间接法
（1）自发荧光对照：同直接法。
（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。
（3）抑制试验：同直接法。
（4）阳性对照：同直接法。
结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。
3、补体法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。
（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释
液，结果应为阴性。
（6）阳性对照。
（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。
免疫荧光技术(医学相关)
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目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：
异硫氰酸荧光 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精 溶剂。有两种异构体，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性与蛋白质结合力等方面都更优良。 FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm， 呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其 主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。
免疫荧光技术
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技术原理
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免疫荧光技术(immunofluorescence)
技术原理
将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在 细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激 发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或 组织，利用定量技术测定含量，从而可对抗原进行细胞定性和定位分析。
自发荧光：组织和细胞中某些成分受激发时可发出荧光，即自发荧光。
漂白：荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失，即漂白现象。
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多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用 多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光， 氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
免疫荧光技术
一般常用DAPI复染。
7、封片： 为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液； 避免产生气泡。
5、二抗孵育条件：
二抗一般室温或37度30min-1h，具体时间需要摸索；
而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度； 切记要避光反应；
但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和 孵育时间；
四乙基罗丹明 (rhodamine, RB200) RB200为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可 长期保存。最大吸收光波长为 570nm，最大发射光波长为595～600nm，呈现橘红色荧光。
四甲基异硫氰酸罗丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC) TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉 末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光波长为620nm，呈现橙红色荧光，与 FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用 于单独标记染色。
【固定液的选择】
2、冰冻切片制备：
建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。 选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片和脱片严重。
3、血清封闭： 为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致） 封闭，减弱背景着色。 封闭是血清与非特异性位点结合，以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低 背景。 血清封闭的时间是可以调整的，一般30min。
激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的
定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间
活细胞动态观察。
免疫荧光方法【精品】
免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2014.4.4-免疫荧光技术实验
免疫荧光技术实验的常用方法免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )，又叫做荧光抗体技术，其主要的实验原理是抗原与抗体能够特异性结合，通过之间的化学反应使得标记抗体的荧光素显色来确定组织细胞内的目标抗原（多肽和蛋白质），并对其进行定位、定性及定量研究的一类方法，该技术也是标记免疫技术中发展最早的一种。
免疫荧光实验主要的实验步骤有三步：首先是抗原片的制作，接下来是试验类型，最后是荧光显微镜检查。
抗原片的制作分为标本组织的制作和样品固定，试验类型分为直接法、间接法、补体结合法等。
其中细胞滴片的间接免疫荧光法属于免疫组化方法的一种，可用于抗体、抗原的定性、定量及定位检测，也是目前使用最为广泛的一种实验技术。
从相关的文献中很容易找到其操作步骤，但是由于很多实验室的条件有限，通常实验无法正常进行。
此外，其他的免疫荧光技术还有流式细胞仪、时间分辨免疫荧光技术、荧光偏振免疫分析技术、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫分析技术等。
手机微信“扫一扫”，更多学术齐分享！免疫荧光技术实验过程中改进的小窍门免疫荧光技术实验过程中往往对实验条件要求较高，所以在具体的操作过程中根据现有条件及实验要求对实验做一些改进、简化，既省力又省钱，同样可以达到预期效果。
该实验对玻片的清洁度要求很高，因此在玻片的选择和处理时要格外注意，只能使用干净的普通玻片或有凹孔的玻片。
在用普通玻片制作细胞滴片时，通常需要采用盐酸浸泡、乙醇清洗处理等方法保证玻片的清洁。
要使得细胞悬液在玻片上充分固定，需要用PBS缓冲液洗涤，只有这样样品烘干后才能显示印迹。
当向印迹滴加试液和二抗后，伊文斯兰将样本染成肉眼可见的蓝色，荧光观察时也极易找准观察位置。
当然，用专门进行免疫荧光操作的凹孔玻片效果更好，但是成本较高。
此外在粘片剂的使用方面，可以使用直接细胞滴片法代替蛋白甘油，直接滴片样本有较好的附着力，避免使用费劲的粘片剂，还能简化实验步骤、节省经费支出。
免疫荧光实验原理及其步骤
免疫荧光实验原理及其步骤免疫荧光实验是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定的抗原或抗体。
其原理是利用荧光染料与抗原或抗体结合形成复合物，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而确定目标物的存在和分布情况。
下面将详细介绍免疫荧光实验的步骤及其原理。
免疫荧光实验的步骤一般分为样品处理、抗体处理、荧光染色和观察四个主要步骤。
第一步是样品处理。
首先需要选择合适的样品，可以是细胞培养物、组织切片或动物体内的器官等。
样品处理的目的是使样品适应实验条件并提取目标物，一般包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定可以采用乙醛或甲醛等化学物质，使细胞或组织保持形态结构。
脱水和透明化则是为了去除样品中的水分，并使其透明以便于观察。
第二步是抗体处理。
根据实验的需要，可以选择针对目标物的一抗或二抗进行处理。
一抗是指对目标物抗原的特异性抗体，二抗是指对一抗特异性结合的抗体。
抗体处理的目的是使抗体与目标物结合形成复合物，一般需要在适当的温度和时间下进行孵育。
在进行抗体处理之前，需要对样品进行预处理，如孵育样品以降低非特异性结合等。
第三步是荧光染色。
荧光染色是利用荧光染料标记抗体，以便于荧光显微镜观察。
常用的荧光染料有荧光素（fluorescein）和罗丹明（rhodamine）等。
荧光染色的原理是荧光染料与抗体结合后发射荧光信号，通过荧光显微镜可以观察到目标物的荧光信号。
荧光染色的过程包括将荧光染料溶液加入样品中，与抗体发生特异性结合，并进行洗涤以去除未结合的荧光染料。
最后一步是观察。
观察是通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标物的存在和分布情况。
观察时需要选择适当的荧光滤光片和荧光显微镜参数，以便于观察到荧光信号的强度和位置。
观察结果可以通过摄影或记录视频等方式保存下来，以便进一步分析和研究。
免疫荧光实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面的蛋白质等。
免疫荧光方法
免疫荧光方法免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。
细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。
这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。
固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。
免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。
最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。
总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：（1）细胞准备。
免疫荧光技术
病毒
无水乙醇
丙酮、CCl4
固定方法
室温3~10min或4℃30min 同上 同上 同上
室温3~10min 室温3~10min或4℃30min
室温5~10min或4℃30~60min 或-20 ℃60min以上
㈡试验类型 1 直接法 2 间接法 3 补体结合法 4 双标记法
抗原
标记 抗体
荧光 光原
* F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。 * 固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 * 活细胞染色以F/P=2.4左右为宜
三、荧光抗体技术：
㈠抗原片的制作 ㈡试验类型 ㈢荧光显微镜检查
㈠抗原片的制作
1 制作： • 临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。
• 可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
• 细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
基本原理是：利用具有双功能基团结构的螯 合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上， 经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发 出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用 时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推 测待测物含量。
时间分辨荧光测定的特点： 1 采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯), 照射样品后即暂短熄灭. 2 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧 光衰退后，再测镧系荧光。 3 镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时 间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰， 4 镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差 异(即较大的Stokes位移），有利于排除非特异性 荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有Eu、Sm Tb、Nd 和Dy等，其中以Eu最为常用。 5 测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。
⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。
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免疫荧光技术的实验方法及其分类
一、免疫标记法及其分类
1.荧光免疫法
原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)
ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
但不适合急诊的快速检测。
以双抗法为例。
首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。
接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—抗体复合物。
最后加入底物，由酶催化底物生成产物。
通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。
4.偶联生物素—亲和素系统的酶免法
利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
5.时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析(Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
6.解离增强镧系元素荧光免疫分析
解离增强镧系元素荧光免疫分析(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。
它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。
由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3 从复合物上解离下来，自由Eu3 同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。
因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。
二、荧光抗体染色方法及其分类
1.直接染色法
将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。
直接染色法的优点是：特异性高，操作简便，比较快速。
缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。
2.间接染色法
如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗体)与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。
在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。
如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。
由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。
间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。
缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。
间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层
对照(即中间层加阴性血清代替阳性血清)。
3.抗补体染色法
抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。
本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。
染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。
如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光。
抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。
因为补体的作用没有特异性，它可以与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。
它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。
除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体-抗补体法等等。
此文章由广州深华生物技术有限公司编辑修改。