细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时１０.３７度PBS洗净，３＊５min凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（三）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
细胞免疫荧光标记实验步骤
细胞免疫荧光标记实验步骤细胞免疫荧光标记实验是用来观察和分析细胞中的特定分子或结构的一种常用方法。
下面是一些常见的细胞免疫荧光标记实验步骤：1. 细胞培养准备:- 在无菌条件下准备所需培养基和培养器具。
- 将待标记细胞接种在培养皿中，以适当的细胞密度使其在培养基中生长。
2. 固定细胞:- 将细胞培养皿中的培养基倒掉。
- 用生理盐水或磷酸缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除未附着的细胞和培养基残留。
- 加入适当的固定液，例如4%的乙醛，固定细胞并封存其内部结构。
3. 渗透化处理:- 使用适当的渗透剂，如0.1%的Triton X-100，以打破细胞膜，使抗体能够渗透到细胞内部。
- 进行渗透化处理的时间应根据实验要求而定。
4. 抗体标记:- 制备适当的抗体和荧光染料稀释液。
- 将抗体稀释液加入到细胞上，使其与目标分子结合。
- 按照实验要求，在适当的温度和时长下孵育细胞，促使抗体与目标分子充分结合。
5. 洗涤和染色:- 用洗涤缓冲液充分洗涤细胞，以去除未结合的抗体和荧光染料。
- 使用适当的荧光染料对细胞进行染色。
如需防褪色，可以添加适当的抑制剂。
6. 显微镜观察和图像捕获:- 用适当的显微镜观察细胞，并捕获荧光图像。
- 根据需要，使用图像处理软件对图像进行分析和量化。
注意事项：- 实验前确保实验室和设备都是清洁的，并遵守实验安全操作规范。
- 涉及有害物质时，戴好个人防护用品，如实验手套和护目镜。
- 每个实验步骤的时间和条件可能因实验要求而异，需根据具体实验方案进行调整。
这些步骤提供了一般的细胞免疫荧光标记实验的大致流程，但具体实验方法还需根据实验目的和材料的特性进行优化和调整。
参考资料：[1] Smith, C. et al. ___. Cold Spring Harb. Protoc. 7, 1052–1055 (2013).[2] Manders, E. M. M. et al. FISH: ___. Cold Spring Harb. Protoc. 2006, db.rot4111 (2006).。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤
1. 细胞一定要贴在玻片上（最好可以放入24孔板），为后面照像打基础。
细胞密度适中，大约60-75%满片即
可，否则容易脱片。
2. 取出细胞后用4%多聚甲醛固定15分钟，现用现配。
（以下各步骤切毋使玻片干燥）
3. PBS冲洗
4. 0.1%Triton作用20分钟
5. PBS冲洗
6. 10%正常血清封闭10分钟
7. 加入一抗，4度孵育过夜（找个小瓶盖将小玻片支起来，抗体就不容易溢出），还要记住“砸片”，就是抗
体从较高处落到片子上，以分布均匀。
抗体稀释度1：60，较常用！
8. PBS冲洗4次，各5分钟
9加入荧光二抗，室温30分钟。
抗体稀释度1：400，较常用！
10. 同8。
11. 90%甘油封片。
也很关键阿，多封几次才有体会。
12. 避光保存，或到显微镜下观察。
0.1%Triton和山羊血清。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。
2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。
3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。
4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。
5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。
6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。
7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。
8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。
注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。
9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。
10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。
染核后PBST洗3次，5min/次。
11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。
说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。
②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。
耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。
2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤第一步：样本准备1.根据实验需要，选择并培养适当的细胞系或组织样本。
2.将细胞或组织培养在适当的载玻片、孔板或离心管中。
3.使细胞或组织粘附在载玻片等表面上。
第二步：固定和渗透化处理1.使用适当的缓冲液（如甲醛）或有机溶剂（如甲醇）将细胞/组织进行固定处理。
2.在室温或低温下，将缓冲液中的固定液置于载玻片或孔板中，进行固定处理。
3.固定后，用洗涤缓冲液（如PBS）洗涤细胞/组织，去除多余的固定液。
4.在细胞内透明化的同时，保持细胞结构完整。
第三步：抗体染色1.准备合适的一抗和二抗。
一抗是特异性与待检测蛋白结合的抗体，二抗是带有荧光染料的抗体。
2.将一抗稀释到适当的浓度，并加入到载玻片或孔板中，与细胞孵育。
3.将载玻片或孔板中的一抗与细胞孵育30-60分钟，使抗体与待检测的蛋白相结合。
4.在恰当的洗涤缓冲液中洗涤载玻片或孔板，去除多余的一抗。
5.同样的方法，添加二抗到载玻片或孔板中，并孵育30-60分钟，使二抗与一抗结合。
6.再次使用洗涤缓冲液洗涤载玻片或孔板，去除多余的二抗。
第四步：显微镜观察1.利用适当的显微镜镜头，观察载玻片或孔板上的细胞，并选取合适的区域进行观察。
2.使用适当的荧光滤波片，观察细胞中的荧光信号。
3.根据实验设计的需要，进行图像记录和分析。
细胞免疫荧光实验是一种常见的实验技术，可以用于研究细胞中的蛋白质表达和定位，提供有关蛋白质在细胞内的空间分布和功能的信息。
不同的实验目的和需求可能会有一些细微的差异，因此可以根据具体的实验目的进行相应的调整或优化步骤。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤细胞免疫荧光技术是一种能够检测活细胞内特定蛋白质分布的技术，常用于免疫组化分析中。
该技术重点在于使用特定抗体与荧光染料结合，达到明显的荧光信号来检测活细胞内某些蛋白质标识。
以下是细胞免疫荧光技术的主要步骤：1、培养或固定活细胞首先需要对活体细胞培养或固定。
一般选择在培养皿或载玻片上将密集的细胞生长于培养液基质中，可以在日后的荧光显微镜下更加清晰的观察细胞结构及变化。
2、组织切片或钝化在一些研究工作中，如动物实验或组织切片中，可能需要先进行组织切片或尸解固定。
组织切片需要先进行固定处理，如使用琼脂糖进行完整的埋嵌固化，然后进行蜡加热染色处理，裁切成薄片。
或者可以做成冰冻切片，操作上更为简单。
另外，钝化细胞可以使用不优化溶液，其中的表面抗原质已经被消除。
这不仅可以减少非特异性信号，而且可以提高特异性状态的细胞荧光信号。
3、细胞膜的处理在进行免疫染色之前，还需要对细胞膜进行处理。
例如，可以使用牛血清蛋白或非离子界面活性剂来堵塞非特异性的结合位点。
这可以减少非特异性抗体与未知结合物的竞争，提高特异性免疫染色的精度。
4、初级抗体与荧光染料的结合细胞内需要检测的蛋白质必须有一个感兴趣的特定蛋白质抗体。
该抗体允许特定的蛋白质标记。
将特定抗体与荧光染料结合后，允许可见光下的荧光染色信号。
此类荧光染料通常具有比较好的耐用性和较高的量子产率，如荧光色素FITC和荧光色素PE等。
5、清洗和固定将免疫荧光的样品进行严格的洗涤，以去除非特异性的结合物。
洗涤过程可以在紫外光下观察到荧光信号的信噪比。
最终用4%多面固聚醛溶液对洗涤后的样品进行固定处理，以确保样品的可保存性，并且可以长时间保存参考质量以后的荧光染色结果。
6、镜下观察荧光染色的样品在显微镜下观察，可以更加清楚的去判断每个活体细胞的染色情况。
结果分为阳性（显示为荧光亮点或分布）、阴性（显示为黑色或无明显荧光）和疑似阳性（显示为劣质荧光或其他滞留现象）。
免疫细胞荧光实验步骤
免疫细胞荧光实验步骤
1.准备所需的仪器和试剂，如生物组织摊烤片机、普通冰箱、盖玻片、载玻
片、无水乙醇、3%双氧水、中性树胶、二甲苯、PBS缓冲粉、柠檬酸缓冲液等。
2.组织免疫荧光技术操作：将切片置于二甲苯中10分钟，进行脱蜡处理，然
后用100%，95%，85%和75%乙醇分别将切片置于其中，进行洗脱。
之后用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
3.热修复抗原：将切片浸入柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中，在微波炉高火加热8
分钟，冷却后用PBS缓冲液洗涤3次。
4.加入3% H2O2，室温10分钟以灭活内源性酶。
然后用PBS缓冲液洗涤3
次。
5.封闭：将切片滴加血清并放入湿盒中，室温20分钟。
然后用PBS缓冲液洗
涤3次。
6.孵育一抗：将切片滴加适当稀释的一抗，放入湿盒中，4℃孵育过夜。
7.复染核：用DAPI染色液复染核，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤方法一：1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟， PBS 洗两次， 0.1% TX-100 室温下作用 1－2 分钟使细胞膜通透。
3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。
4. 剪一片合适大小的parafilm ，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。
5. 接下来二抗孵育步骤同上。
6. 最后，在载玻片加上mounting medium （大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。
你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有杂带。
8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。
如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC （绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。
2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。
抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。
3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清。
5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光
1. 细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃PBS重悬细胞。
2. 离心吸去PBS，以1~2 ml 2%PFA固定液，或2%PFA固定液/0.1% Triton X-100重悬细胞，置冰上固定30 min。
3. 离心、吸去固定液，用15 ml 4℃PBS重悬细胞，放5 min 后，用PBS 再次洗涤细胞。
4. 稀释的第一抗体于4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，250 μl 抗体足够用于5×106细胞。
5. 离心细胞，吸去PBS，重悬细胞于第一抗体中，置4℃温育1 h。
6. 用4℃PBS稀释细胞和抗体至15 ml。
7. 离心，吸去PBS，以4℃PBS重悬细胞，重复1次。
8. 第二抗体4℃用微量离心机以13 500 g 离心2 min，5×106细胞用250 μl 抗体足够。
9. 吸去PBS，以第二抗体重悬细胞，4℃温育1 h，重复步骤6及步骤7。
10. 除非立即观察细胞，否则在进行细胞浓缩的下一步操作之前应以铝萡包裹离心管并冷藏。
11. 离心细胞并以少量PBS重悬（勿用水），将细胞悬液滴于多聚-L-赖氨酸覆层的载玻片上，加上盖玻片，尽可能马上观察结果。
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤
活细胞免疫荧光染色实验步骤如下：
1.细胞培养：在无菌条件下，将细胞种植在适宜的培养基中，进行细胞培
养。
2.固定：在适宜的时机，弃去培养基，用冷的PBS清洗两次，然后使用适当
的固定剂（如4%多聚甲醛）进行固定。
3.透膜处理：在固定后的细胞中加入0.1% Triton X-100的PBS进行透膜处
理，以使荧光染料能够进入细胞。
4.抗体孵育：根据实验需求，选择适当的特异性抗体，加入细胞中，室温孵
育一定时间，使抗体与细胞内的目标蛋白结合。
5.洗涤：在抗体孵育后，用PBS洗涤细胞，以去除未结合的抗体和其他杂
质。
6.荧光标记：选择适当的荧光染料标记二抗，加入细胞中，室温孵育一定时
间，使二抗与结合的特异性抗体结合。
7.洗涤：再次用PBS洗涤细胞，以去除未结合的荧光染料和其他杂质。
8.观察：在荧光显微镜下观察染色后的细胞，观察目标蛋白的分布和定位情
况。
请注意，具体的实验步骤可能因不同的实验需求和条件而有所差异。
在进行实验前，建议仔细阅读相关文献和实验指南，以确保实验的准确性和可行性。
细胞免疫荧光 详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4％的甲醛室温固定20－30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。
2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。
注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。
洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。
2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。
2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。
通常在室温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。
3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。
浓度通常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。
4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。
预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。
具体方法应根据需要选择。
5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中，使其与抗原结合。
抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。
6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。
7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。
荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。
根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。
8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。
常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。
9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。
可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。
补充说明：2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。
正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。
通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。
3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。
因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。
4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。
通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。
总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。
细胞免疫荧光实验原理
细胞免疫荧光实验原理
细胞免疫荧光实验是一种常用的技术手段，用于研究特定分子在细胞中的位置和分布情况。
该实验基于免疫荧光染色原理，利用荧光标记的抗体或其它特异性标记物，绑定到目标分子上，并利用荧光显微镜观察荧光信号的分布情况。
细胞免疫荧光实验的基本步骤包括：
1. 固定细胞：将要研究的细胞进行固定处理，常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。
固定细胞的目的是保持细胞形态和防止细胞膜的破裂。
2. 渗透处理：细胞具有完整的细胞膜，为了使抗体或标记物能够穿透细胞膜与目标分子结合，需要进行渗透处理。
常用的渗透处理方法包括使用洗涤剂（如0.1% Triton X-100）或酶（如胰蛋白酶）等。
3. 阻断非特异结合：为了避免非特异性结合，需要使用一定的阻断剂。
常用的阻断剂包括牛血清蛋白（BSA）等。
4. 抗体处理：将特异性抗体或标记物加入到样品中，使其与目标分子发生特异性结合。
抗体可以选择荧光标记的一抗或二抗，也可以选择其他特定标记的抗体，如荧光素酶（HRP）标记的抗体。
5. 洗涤：为了去除未结合的抗体或标记物，需要进行多次洗涤步骤。
洗涤的目的是减少非特异性结合，提高信号与噪音比。
6. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察荧光信号的分布情况。
荧光显微镜具有高度灵敏度和分辨率，能够观察到细胞内特定分子的位置和分布情况。
细胞免疫荧光实验的原理是基于特异性抗体与目标分子的结合，并利用荧光标记物的荧光信号来检测目标分子的位置和分布。
通过该实验，可以了解细胞内特定分子的表达情况、定位以及相互作用等重要信息。
细胞免疫荧光步骤
细胞免疫荧光步骤This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020细胞免疫荧光步骤【原理】用特异性抗体（第一抗体）与细胞中的相应抗原反应，洗去未与抗原结合的抗体再用荧光标记的第二抗体与结合在抗原上第一抗体结合，形成抗原-抗体-荧光抗体复合物由于荧光素在荧光显微镜下经过特定波长的光照摄激发后能发射出荧光，借此可对抗原定位和定量。
【材料】培养细胞【试剂】①4%的多聚甲醛。
②PBSPH≌：NaCl18克，克，NaH2PO4,2H20克溶于2000m蒸馏水。
③封闭血清：与二抗同种来源属性的非免疫血清。
④第一抗体：xxx。
⑤第二抗体：与一抗种属性匹配TRITC标记的，（中杉金桥公司，ZF-0313GoatAnti-MouseIgG(H+L),）。
⑥DAPI：（碧云天公司，）染核。
⑦抗荧光淬灭封片剂:碧云天公司【器材】冰箱，载玻片，盖玻片（做正面标记），微量移液枪，移液枪枪头，吸管，湿盒，指甲油，DOCK笔，EP管，吸水纸，六孔板，摇床，振荡器。
【配制液体等】①%-Triton：(PBS+由于Triton比较粘，配前先在室温放会儿,磁力搅拌器搅匀可分装储存)②10%正常封闭血清：(用PBS-Triton稀释，振荡器上振荡充分混匀，临用前配制)。
③%-Tween；用PBS稀释Tween。
【步骤】1取出生长48小时的细胞爬片，移入一个干净的六孔板冷PBS浸泡不超过3分钟（事先在六孔板的第一排三个孔分别标记)。
2每个玻片滴加4%的多聚甲醛冰上固定14分钟。
注意，要水平，覆盖均匀。
（准备封闭血清用PBS-Triton稀释1:10振荡器上振荡混匀）。
3冷PBS,5分钟X2次摇床150rpm缓慢洗净，PBS-Triton透膜5min。
（如果是胞浆，核或膜内表面表达需要这一步，如果是膜外表面表达的则不需要透膜）4擦干爬片边缘，用DOCK笔在爬片四周边沿画圈（以防止爬片上所加试剂因失去张力流失，导致干片）。
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的位置和表达水平的常用技术。
下面我将从步骤和经验总结两个方面来回答你的问题。
免疫荧光实验步骤：
1. 样本制备，首先，收集细胞或组织样本，然后进行固定和切片处理，以确保样本的完整性和稳定性。
2. 抗原修饰，样本经过透化处理后，使用适当的抗原修饰方法，如热处理或酶解，以增强抗体的结合效率。
3. 抗体孵育，将样本与特异性的一抗（一般为多克隆抗体）孵育，使其与目标蛋白结合。
4. 荧光二抗孵育，将荧光标记的二抗孵育，使其与一抗结合形成复合物。
5. 染色与显微镜观察，样本经过洗涤后，使用荧光显微镜观
察，检测目标蛋白在细胞或组织中的分布和表达水平。
免疫荧光实验经验总结：
1. 选择适当的抗体，选择具有高亲和力和特异性的抗体至关重要，可以通过文献综述或试验验证来确定抗体的适用性。
2. 优化实验条件，包括抗原修饰、抗体浓度、孵育时间等实验条件的优化，以确保信号强度和特异性。
3. 合理的阳性和阴性对照，使用已知表达目标蛋白的阳性对照和不表达目标蛋白的阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 注意样本处理，样本处理的温和和一致性对实验结果至关重要，避免因处理不当导致假阳性或假阴性结果。
5. 数据分析和图像获取，在实验结束后，对荧光图像进行合理的获取和分析，避免图像处理过度或不足，确保结果的客观和准确。
以上是免疫荧光实验的步骤和经验总结，希望能够对你有所帮助。
如果还有其他问题，欢迎继续提问。
细胞免疫荧光的操作流程
细胞免疫荧光的操作流程一、准备实验材料1、抗体：根据需要使用的抗體，可以选择合适的抗體。
2、细胞：根据实验需要，选择合适的细胞进行实验，并在37℃5%CO2的培养箱条件下保持培养，直到实验需要。
3、用于洗涤细胞的生理盐水或PBS缓冲液：使用无菌的生理盐水或PBS缓冲液洗涤细胞，可以保护细胞免受外界环境影响。
4、收集细胞：如酶标记或其他标记，获得细胞膜丰度，收集细胞进行数目统计，以确定最终实验细胞数量。
5、荧光染料：根据需要，选择合适的荧光染料，按指定的比例混合，配制成荧光染料溶液备用。
二、实验流程1、制备抗体溶液或小分子染料溶液：将所需抗体或小分子染料放入适当的溶剂中，搅拌均匀，配制成抗体溶液或小分子染料溶液备用。
2、洗涤细胞：在冷藏室中，将培养好的细胞离心至10000g，去除培养液，改用生理盐水或PBS缓冲液洗涤2次，以去除残留在细胞表面的培养液及细胞垢。
3、添加抗体溶液：在离心完的洗涤细胞的PBS缓冲液中添加抗体溶液，搅拌均分，放入37℃5%CO2条件的培养箱中掺匀体外培养2小时。
4、添加荧光染料溶液：将荧光染料溶液添加到毒化细胞中，在培养箱中持续掺匀体外培养1小时。
5、收集细胞：收集培养的细胞，用荧光酶标尿素酸染色法检测细胞内蛋白质的表达，用流式细胞术检测细胞的荧光强度，并分析各个细胞株。
6、数据处理：将实验数据存储，进行数据处理，绘制各细胞株荧光强度分布图，统计出各细胞株的平均荧光强度，便于评价实验效果和分析。
7、分析评价实验效果：对实验效果进行评价，进行分析，根据数据比较，判断实验结果及影响因素的影响，从而探讨获得的可靠结论。
细胞免疫荧光详细步骤
细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。
爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。
一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。
培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。
最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。
爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。
同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。
将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。
注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。
2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。
抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步骤
1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。
10000-30000左右
2.给药处理24h。
3.PBS洗三遍。
4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
（避光）
5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
6.5%BSA （牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。
7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。
8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,
室温60min（避光）
9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。
10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。
（避光）
11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。
12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。
All steps for IF
1) Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 minutes)
2) Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical)
3) Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2% Triton X-100 in PBS for 30 minutes)
4) Wash well in PBS
5) (optional: Block for non-specific dye binding using the Image-
iT FX Image Enhancer Solution, I36933)
6) Block for non-specific antibody binding 30-
60 minutes (a common blocking solution would be 3-
6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial blocking reagents like our BlockAid, product B10710)
7) Incubate in primary antibody for 30-
60 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concentrati ons vary, but usually between 0.5-10ug/mL)
8) Wash well in PBS
9) Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-
6% bovine serum albumin / PBS (a good starting antibody concentration is 5 ug/ mL) 10) Wash well in PBS
11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306)
12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a goo
d antifad
e solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gold, S3 6937)。