细胞爬片免疫荧光实验步骤

细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤

细胞爬片固定及免疫荧光的操作步骤细胞爬片：1.埋板准备：准备含有合适培养基的细胞培养板或培养皿。

将培养基预热至适宜的温度。

2.细胞处理：将需要爬片的细胞株从库存中取出，用PBS（磷酸盐缓冲液）或无酶胰蛋白酶溶解细胞外基质粘附，用培养基洗涤细胞。

3.细胞计数：用血细胞计数板或细胞计数仪计数细胞浓度，然后根据需要调整到合适的细胞密度。

4.接种细胞：将适量的细胞接种到埋板中，根据实验要求可以采用单细胞克隆或稀释传代法。

5.培养细胞：将埋板放入细胞培养箱的适当环境中，通常为37°C、5%CO2的培养箱。

根据实验需要，培养时间可以从几小时到几天不等。

固定：1.筛选固定剂：选择适合的固定剂，常用的固定剂包括乙醛和甲醛等。

2.固定细胞：使用适当的浓度的固定剂，将培养的细胞浸泡在固定剂中，通常需要15-30分钟的固定时间。

3.洗涤细胞：使用PBS等缓冲溶液洗涤固定的细胞，去除多余的固定剂。

免疫荧光：1.孔板准备：将需要进行免疫荧光染色的细胞或组织培养在培养皿或孔板中。

2.阻断非特异性结合：用0.1-5%BSA或牛血清等蛋白质溶液阻断非特异性结合位点，减少假阳性信号。

3.一抗染色：加入适当浓度的一抗（具体浓度由厂家确定）到需要染色的细胞上，对于细胞表面的抗原，可以直接在细胞外孔板中加入一抗。

4.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤一抗残余的溶液。

5.二抗染色：加入与一抗同种小鼠或兔子抗体的特异性抗体（如荧光素、奥林染色试剂等）到孔板中，适当的浓度需根据实验所需，与一抗使用的缓冲液一致。

6.清洗：用PBS或相应的缓冲液洗涤二抗残余的溶液。

7.成图：用荧光显微镜观察样品，利用相应的激发波长和荧光滤镜观察和拍摄免疫染色的图像。

细胞爬片、固定和免疫荧光技术的步骤可以根据具体实验的要求进行调整和优化。

这些操作步骤在细胞和分子生物学研究中非常重要，可以用于检测和观察各种细胞结构和分子的表达和分布。

整个过程需要细心和耐心，并且需要严格控制各个步骤的条件以确保实验结果的准确性和可重复性。

细胞免疫荧光的方法(自己实践记录)

细胞免疫荧光I、步骤：一、固定：PBS 5min×3次振荡洗涤制作好的细胞爬片。

固定液覆盖细胞，RT 静置15min。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

二、通透化：通透液覆盖细胞，RT 静置30min。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

三、封闭：封闭液覆盖标本表面37℃孵育1h。

四、一抗孵育：一抗以合适浓度稀释PBS，覆盖标本表面。

4℃孵育过夜，第二天37℃复温1h。

PBS 5min×3次振荡洗涤。

五、二抗孵育：FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面。

37℃避光孵育<60min。

PBS 5min×3次避光振荡洗涤。

六、染核：新鲜稀释Hoechst覆盖细胞表面，RT避光静置<10min。

PBS 5min×3次避光振荡洗涤。

七、封片：在干净的载玻片上滴一滴封片剂，将爬片的细胞面扣在封片剂上。

八、镜检，4℃避光保存。

II、注：1、细胞密度要合适，状态较好。

2、从孵育二抗开始要避光（关闭室内日光灯即可）。

3、完成后最好及时镜检，照相；分别用不同波长激发荧光，在Photoshop软件下合成一张图。

III、试剂配制：1、固定液：4%多聚甲醛/PBS：4g多聚甲醛，50～80mlPBS，加热至60℃，持续搅拌至完全溶解，（通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮），定容100ml，RT保存。

2、通透液：0.5 %(v/v)TritonX-100/PBS3、封闭液：正常山羊血清稀释于PBS；或商品化封闭液成品。

4、Hoechst：Hoechst33258即可。

5、封片剂：50%(v/v)甘油/PBS。

免疫荧光步骤(精)

胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。

一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。

培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。

最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油内容仅供参考，希望对你有帮助！抗荧光淬灭剂的作用当荧光染料暴露在激发光下时，几乎都有漂白的现象（光漂白）。

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光1、吸干十二孔板中每孔中的培养基，用PBS洗三次，5min/次，注意摇床要缓慢。

2、吸干PBS，每孔加200~300μl固定液，室温固定20分钟。

3、若暂时不做荧光，吸干固定液，不洗，放-30℃保存。

4、需要做时，将十二孔板取出，稍微解冻之后，加适量的PBS，用钩针抠出要PBS洗三次，5min/次。

5、吸干PBS后，每孔加1ml的5‰Triton破膜液，室温下破膜15~20分钟。

6、吸干破膜液，室温下PBS洗3次，5min/次。

7、加BSA封闭液，30~50μl/爬片，室温下封闭30min。

8、吸干BSA封闭液，不洗，加一抗（一抗用PBS稀释比例为：1：50~1:100，浓度视具体情况而定，30~50μl/爬片）4℃过夜。

注意十二孔板保持平整，以免一抗流到爬片外。

9、第二天从4℃冰箱中取出十二孔板，PBST洗3次，3min/次，然后每孔加1:50稀释的FITC，室温下避光孵育1h。

10、PBST洗3次后，DAPI染核6分钟，30μl/爬片。

染核后PBST洗3次，5min/次。

11、载玻片上滴一滴GL YCEROL封片液，即可镜下观察。

说明：①5‰Triton破膜液：例如配20μl的Triton原液用4000μlPBS稀释。

②FTIC现配现用，用PBS稀释，比例为1：50~1:75，具体浓度依据荧光亮度来调整。

耗材：1、十二孔板2块，一块要求无菌（种细胞），另一块洁净（外用漂洗爬片）。

2、外用PBS3、固定液4、细胞爬片5、避光盒6、钩针7、5‰Triton破膜液8、BSA封闭液9、一抗10、PBST11、FITC12、DAPI13、GL YCEROL封片液。

细胞免疫荧光步骤[1](干货分享)

细胞免疫荧光步骤方法一:1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片)2.然后在4％PＦA里面室温下固定30分钟，ＰBＳ洗两次，0.1％TX—100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器（面积大,扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4.剪一片合适大小的pａrａfilm,在上面滴上稀释在1％ＢSＡ/TＢＳ中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片３0ul 足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下）,室温下孵育３0分钟，然后在PBＳ里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上ｍounting medium(大约每个玻璃片加10uｌ)，把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。

你可以先做WＢ检测一下你的抗体,看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rａbｂiｔ和rａt的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是ｄonｋｅy ａｎtｉ—rabbiｔ－FITC（绿）和doｎkey anti-ｒat-Ｔｅx－Red（红）。

2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4.封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是1０％的正常donｋey血清.5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作.方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片,还有直接在2４welｌ/12well/９6wｅll中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

细胞免疫荧光步骤

细胞免疫荧光步骤方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。

你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清。

5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

细胞免疫荧光标准操作流程

细胞免疫荧光标准操作流程
细胞免疫荧光细胞免疫荧光标准操作流程标准操作流程
20×20盖玻片清洗干净后，无水乙醇浸泡过夜，载玻片置于无水乙醇中浸泡，待用；
1. 爬片；目标细胞（如：转染24h 的细胞）胰酶消化后，用新鲜培养基吹打悬浮；取出盖玻片，酒精灯火焰灼烧至乙醇燃烧干净，盖玻片平放在6孔板内，接种细胞至六孔板，5%CO2培养箱37C 培养24h，细胞贴附在盖玻片上。

2. 收片；细胞贴附24h 后，去除培养基，加入预冷PBS 洗片，重复一次。

3. 固定；加入1ml 预冷的4%多聚甲醛，覆盖盖玻片，冰上孵育10-15min，PBS 洗片3次。

4. 透化；加入0.5ml 遇冷的0.5%Triton-100，冰上孵育5min ，PBS 洗片3次，吸尽表面液体。

5. 封闭；常温下，加入2ml 含10%FBS 的PBS ，孵育1h ，PBS 洗片1次。

6. 一抗孵育；稍晾干盖玻片，加入100ul 稀释好的一抗，室温孵育2h ，PBS 洗涤3次。

7. 二抗孵育；同上
8. 染核；加入0.5ml DAPI 工作液（1ug/ml ，PBS 稀释），覆盖盖玻片，室温孵育5min 。

9. 封片；PBS 洗片三次后，晾干，同时晾干载玻片后，滴上30ul 封片剂，盖上盖玻片，待观察。

Long Qi 2011-11-2。

免疫荧光染色-爬片 2

这是针对细胞爬片的免疫荧光染色标准步骤：
1）实验前一天，将细胞接入铺有22×22mm（或24×24mm）盖玻片的六孔板中。

2）第二天，待细胞汇合度达到70％左右开始进行染色步骤。

3）用新鲜配制的2％（或4％）多聚甲醛固定细胞10分钟。

4）PBS洗三遍，每次5分钟。

5）用0.2-0.5％ triton X-100（PBS配制）对细胞透化处理10分钟。

6）PBS洗三遍，每次5分钟。

7）2％BSA或者10％二抗同源血清（注意一定要是正常血清）封闭30分钟，PBS 洗两遍。

8）加入1抗，室温孵育1 小时。

9）PBS洗三遍，每次5分钟。

10）加入二抗，室温孵育30-45 分钟。

11）PBS洗四遍，每次5分钟。

12）加入0.5 ug/ml DAPI（PBS配制）染色10分钟（这里也可用其它的染核染料如hoechst 33258）。

13）用PBS洗三遍，去除多余的DAPI。

14）加入20 ul封片剂封片。

15）封片好的细胞样品可于4度冰箱中存放2周以上。

注意步骤5-7在某些蛋白的染色步骤中可能不是必须的，一抗如果有多种（但注意要是不同种属的）可以同时孵育，二抗同时使用时最好是同一种属来源（如驴抗兔，驴抗羊，驴抗鼠），以避免二抗间的交叉反应。

如果是组织切片样品，可能还涉及到样品的染色前处理（比如石蜡切片的脱蜡），请参阅其它的说明，但荧光染色步骤是一样的。

如果要做细胞涂片的免疫荧光染色，需用离心涂片机将细胞固定在玻片上，再进行后续步骤。

细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤

细胞技术课堂小知识——荧光免疫实验步骤贴壁细胞免疫荧光法(1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min。

(2） 4%多聚甲醛固定细胞爬片15min。

(3） 1XPBS洗涤3 次，每次5min。

(4） 0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。

(5) 1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(6） 1%BSA室温封闭30min。

(7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。

(8) 1 ×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗。

(10) 1×PBS 洗涤3 次，每次5min。

(11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。

(12）1×PBS洗涤3 次，每次5min。

(13）用抗荧光淬灭剂封片。

(14）荧光显微镜下观察采集图像。

悬浮细胞免疫荧光法（一)(1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。

(2）离心吸去 PBS，4%多聚甲醛固定液，重悬细胞，置冰上固定30 min。

(3）离心、吸去固定液，用4℃ 1×PBS重悬细胞，离心800 g 离心5 min，去PBS，留细胞沉淀。

(4） 0.5%Triton X-100 (PBS 配制）室温通透10min。

(5）离心800 g离心5 min，去通透液，留细胞沉淀。

▲注意:步骤（4）和(5）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤(6）使用1% BSA进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

(7）离心800 g离心5 min，去封闭液，留细胞沉淀。

(8) 孵育一抗,浓度根据抗体说明书操作,4℃摇床孵育过夜(一般孵育15-16h)。

(9）用4℃ 1×PBS稀释细胞和抗体，离心，吸去PBS，以4℃ 1×PBS重悬细胞，重复1次。

免疫荧光(IF)实验操作步骤及详细说明

免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明一、试剂和溶液10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释10X PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于100ml PBS 通透液：0.1% triton-100 封闭液：PBS 配制的3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释二、实验步骤1.细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在12 孔板中，然后接种细胞，置于37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为40%-50%（做爬片的细胞一般是复苏细胞传代2 代后的细胞）；2.洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；3.固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置20min,倒掉多聚甲醛，加入适量PBS；4.冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至7）；5.解冻：常温下放置30 min；6.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；7.通透：加入适当体积的通透液室温放置10min。

（若蛋白为膜表达则无需此步）8.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤2 次,每次5min；9.封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置30 min；10.一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育60min；11.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；12.二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗，37℃避光孵育50 min；（如果一抗是荧光素标记的则无需此步）；13.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；14.核染色：加入适当体积及稀释比的核染料DAPI 室温反应10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至16）；15.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤3 次,每次5min；16.细胞骨架染色：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽，避光37℃孵育60 min 或4℃孵育过夜；17.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤2 次,每次5min，纯水轻微振荡洗涤5min；18.封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻片，细胞面朝下，盖在载玻片上；19.荧光显微镜观察，记录结果。

免疫荧光步骤

最近按丁香园的帖子进行免疫细胞化学染色,结果出来了。

总结如下:1. 上午做的爬片晾到下午开始染色2. PBS浸洗爬片3遍,每遍5分钟3. 用0.1%的柠檬酸钠配制0.3%Triton-X100,0.1%柠檬酸钠:0.1g柠檬酸钠+100ml蒸馏水0.3%Triton-X100:30% Triton-X100 1ml + 99ml0.1%柠檬酸钠。

4. 将0.3% Triton-X100放入修复盒中,将盒置入冰盒中,将爬片放入修复盒中孵育30分钟5. PBS浸洗爬片3次,每次5分钟6. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加0. 3%双氧水,孵育10分钟,7. PBS浸洗3遍,8. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加封闭血清,孵育15分钟9. 甩掉封闭血清,吸水纸吸去爬片周围残留血清,滴加PBS稀释的一抗,保持液体集聚在爬片上而不外流,入湿盒中置4度冰箱孵育过夜,约16小时10. 第二日取出湿盒置室温45分钟,11. PBS浸洗3遍×5分钟12. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加二抗,孵育20分钟13. PBS浸洗3遍×5分钟14. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加试剂C,孵育20分钟15. PBS浸洗3遍×5分钟16. 配制DAB显色液,1:20,先加蒸馏水,再加A液,摇匀后加B液,C液,摇匀,避光17. 取出爬片,将PBS甩掉,擦净细胞周围的PBS,保持爬片上少量液体,但不能干片,擦一张爬片滴一张爬片,滴加DAB, 10分钟左右显色。

18。

自来水洗切片,苏木素复染,固定,透明,封片。

第十一节细胞免疫荧光1)在六孔板中接种合适密度的细胞;2)提前将PBS放入4°C冰箱预冷,用预冷的PBS清洗细胞,洗三次以去掉残留的死细胞;3)提前将无水甲醇放在-20°C冰箱里预冷,向空中加入预冷的无水甲醇以穿透固定细胞,在-20°C冰箱里放置15niin;4)用枪头移去孔中的无水甲醇,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin;5)向六孔板的每个孔中加入100^il的5%山羊血清对细胞封闭,室温放置Ih;6)封闭结束后,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin;7)向六孔板的每个孔中加入80nl稀释好的一抗抗体,放入4°C冰箱过夜孵育;8) 一抗孵育结束后,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin;9)向六孔板的每个孔中加入80^1稀释好的二抗抗体,用锡纸包住六孔板避光孵育Ih;10) 二抗孵育结束后,用TBST冲洗细胞表面,共洗3次,每次lOmin;11)向空中滴加DAPI稀释液(1:1000稀释),室温放置l-2min;12)向孔中滴加TBST清洗细胞,5min;13)用荧光封片剂进行封片;14)在倒置突光显微镜下观察细胞,调节到适当视野照相。

细胞免疫荧光详细步骤

细胞免疫荧光步骤：1、细胞在盖片上生长融合到95％－100％时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4％的甲醛室温固定20－30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2％Triton X－100透化2－5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗（用1％BSA稀释）放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗（用1％BSA稀释）30分钟，闭光！！！11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95％甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光!!!11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

细胞免疫荧光实验步骤

细胞免疫荧光实验步骤细胞免疫荧光实验步骤简单实验步骤如下:1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时.2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟3.PBS洗净:3min＊34.1%Triton: 30min. 配成50ultriton+5mlpBS5.PBS洗净:2＊5min6.羊血清封闭：３７度，２０分钟７.一抗，his1；400 ４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时８.４度PBS洗净，３min＊５次９.二抗３７度小于一小时加入5ug/ml的FITC-鬼笔环肽（100ug/ml储存液）室温染色30-60分钟１０.３７度PBS洗净，３＊５minDAPI 1：200凉干封片（封闭液ＰＨ８.５）我的实验检测X射线照射鼻炎癌细胞后γH2AX的数量变化预实验步骤：1）辐照结束后，弃去旧培养液，4%多聚甲醛4℃固定15分钟。

2）PBS洗涤，5分钟×3次。

3）体积分数为0.2%Triton-X 100 4℃破膜15分钟。

4）PBS洗涤，5分钟×3次。

5）羊血清工作液室温封闭2小时。

6）PBS洗涤，5分钟×3次。

7）0.21µg/ml一抗（梯度1:500 1:750 1：1000）37℃孵育细胞2小时。

8）PBS洗涤，5分钟×3次。

9）2.1µg/ml 二抗（1：200）37℃避光孵育细胞1小时。

10）PBS洗涤，5分钟×3次。

11）1µg/ml DAPI染色15分钟，使用时避光。

12）PBS 洗涤，5分钟×3次。

13）以及分数90%甘油封片，盖玻片细胞面朝下。

14）荧光显微镜下观察。

活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备（一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃ 30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)（二）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。

细胞免疫荧光实验步骤.docx

第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次,每次3 min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加正常山羊血清,室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒,4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中20-37℃孵育1h,PBST浸洗切片3次,每次3min；注意：从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。

7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体,用含抗荧光淬灭剂的封片液封片,然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基,放爬片,接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。

10000-30000左右2.给药处理24h。

3.PBS洗三遍。

4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟,PBS洗三遍,每次5min,摇床。

（避光）5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min,PBS洗三遍,每次5min,摇床。

6.5%BSA（牛血清白蛋白,PBS配）封闭60分钟,不用洗。

7.加一抗孵育（5%BSA配）,4℃摇床过夜。

8. 收集一抗,PBS洗三遍,每次5min,摇床。

孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）9. 回收二抗,PBS洗三遍,摇床,每次5min。

10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配,2滴/ml）染核15min。

（避光）11. PBS洗三遍,每次5min,摇床。

细胞免疫荧光步骤（仅供参照）

细胞免疫荧光步骤（仅供参照）方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。

3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5.接下来二抗孵育步骤同上。

6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7.抗体很重要，不能有非特异性结合。

你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清。

5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

三种细胞免疫荧光染色操作步骤

三种细胞免疫荧光染色操作步骤三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下:1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注:4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致:1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

细胞免疫荧光详细步骤

细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。

一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。

培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。

最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。

同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。

注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片2.5% DABCO (w/v)抗淬灭封片剂50mM Tris(pH8.0)90%甘油0.25g DABCO9ml甘油0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存0.5ml ddH2O。

细胞免疫荧光步骤

方法一：1.首先需要把细胞养在玻璃片上悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟,PBS洗两次,% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透;3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器面积大,扁平状的,比如大的培养皿里面,放一张用水打湿的滤纸,以保持湿度;4.剪一片合适大小的parafilm,在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗稀释倍数依具体抗体而定,每个玻璃片30ul足够,把玻璃片盖在上面细胞面朝下,室温下孵育30分钟,然后在PBS 里洗三次;5.接下来二抗孵育步骤同上;6.最后,在载玻片加上mounting medium大约每个玻璃片加10ul,把玻璃片放上去细胞面朝下,37度30分钟,然后就可以在荧光显微镜下观察了;7.抗体很重要,不能有非特异性结合;你可以先做WB检测一下你的抗体,看看有没有杂带;8.双标的话,可以把两个一抗一起加或者分别标记两次可以都试一下看看那种方法合适;如果一个抗体需要二抗,一个是直接荧光标记的,可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加;方法二：1.选取一抗时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,二抗则是不同荧光信号标记的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC绿和donkey anti-rat-Tex-Red红;2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育;抗体浓度、孵育时间要仔细摸索,我感觉一抗4度孵育过夜比较好,背景比较清晰;3.我的阳性对照用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物;4.封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是10%的正常donkey血清;5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作;方法三：1.片子的制作：可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染色2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上;4.其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的;5.固定：用PBS洗去培养液,用固定液如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精;;;固定细胞;6.内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做;7.通透胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做,一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时;8.封闭：洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉;封闭结束后千万不要洗,直接上一抗;9.一抗：具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....;选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的;时间一般是4度过夜或者37度1小时;一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体;10.洗去一抗;11.上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了;二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了;二抗的时间一般是37度半小时;12.底物显色选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显色时间可能需要摸索,以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做13.洗去二抗,染核14.DAPI或者Hoechst染核15.洗去染核液,加PBS,上镜观察;方法四：(1)细胞准备;对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次；对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤1000rpm,5min2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片;(2)固定;根据需要选择适当的固定剂固定细胞;固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月;PBS洗涤3×5 min;(3)通透;使用交联剂如多聚甲醛固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位;选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质;通透的时间一般在5-15min;通透后用PBS洗涤3×5 min;(4)封闭;使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min;(5)一抗结合;室温孵育1h或者4℃过夜;PBST漂洗3次,每次冲洗5min;(6)二抗结合;间接免疫荧光需要使用二抗;室温避光孵育1h;PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次;(7)封片及检测;滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查;方法五：1．漂洗血清蛋白,37度PBS 2小时.2．-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥10分钟3．PBS洗净：3min34．1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5．PBS洗净：25min6．羊血清封闭：37度,20分钟7．一抗,4度过夜,一般要大于18小时或者37度1-2小时8．4度PBS洗净,３min5次9．二抗37度小于一小时10．37度PBS洗净,33min11．凉干封片封闭液细胞免疫荧光步骤：1.细胞爬片；首先是玻片的处理,普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块,先用洗衣粉洗干净,用水冲静烤干,然后泡酸过夜,捞酸后流水洗净,烤干,置于器皿中高压灭菌,然后再烤箱中大约8小时烤干备用;爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可,我选择在培养皿中爬;一为节约经费培养皿可以重复利用二来觉得培养皿口大,操作比较方便;培养皿消毒同上,消毒时记得消两把镊子具体操作是：用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成单细胞悬液注意：这一点很重要,关系到将来爬出来片子的质量取出消毒的培养皿,可以先加少量培养基以使玻片与培养皿紧密接触,将玻片小心放入摆放其中,然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上;最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养,根据细胞生长状况,24小时或更长时间适时取出爬片;爬片置于37度PBS中洗三次,每次3到5秒钟,然后在4％多聚甲醛中固定15分钟,然后再用37度去离子水将甲醛冲干净,注意手法轻柔,要不然掉片很厉害;同时操作过程中注意玻片的正反面,要不然真的是前功尽弃;将做好的爬片置于滤纸上晾干,然后用中性树胶粘在载玻片上;注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验,要不然玻片会掉下来的,就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用,具体能保存多长时间不太清楚,当然尽量早用;%多聚甲醛固定10min固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮；漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min丙酮固定法不用透化处理；漂洗2次,每次5min；%BSA封闭30min；7.加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2h；漂洗2次,每次5min；9.加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1h；漂洗2次,每次5min；ml DAPI染色2min；12.抗淬灭封片剂封片;抗淬灭封片剂:% DABCO w/v50mM Tris90%甘油细胞免疫荧光细胞爬片4%多聚甲醛固定10min固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮PBS漂洗5min% Triton 穿孔15min丙酮固定法不用透化处理PBS漂洗2次,每次5min1%BSA封闭30min加入1%BSA稀释的一抗,于37℃杂交2hPBS漂洗2次,每次5min加入1%BSA稀释的二抗,于37℃杂交1hPBS漂洗2次,每次5min5ug/ml DAPI染色2min抗淬灭封片剂封片% DABCO w/v抗淬灭封片剂50mM Tris90%甘油0.25g DABCO9ml甘油1M Tris 70℃溶解,-20℃保存ddH2O。