科研Oncogenesis：在TG（Grm1）黑色素瘤小鼠模型中，CYLD的缺失加速了黑色。。。

科研Oncogenesis：在TG（Grm1）⿊⾊素瘤⼩⿏模型中，CYLD的缺失加速了

⿊⾊。。。

编译：⽯⽯，编辑：⼗九、江舜尧。

原创微⽂，欢迎转发转载。

导读

CYLD是⼀种著名的抑癌基因，在乳腺癌、结肠癌和恶性⿊⾊素瘤等多种肿瘤类型

中均下调。CYLD在⼈⿊⾊素瘤细胞中被转录抑制因⼦SNAIL 1所抑制，从⽽增加细胞

的增殖、侵袭和迁移潜能。该抑癌基因具有独特的功能，研究者构建了新的⼩⿏模型

TG(Grm 1)CYLD-/-。在此，研究者证明CYLD缺乏症会导致⿊⾊素瘤的早期发病和加

速肿瘤的发⽣。⾸先，RNA测序数据揭⽰了CYLD在调控涉及增殖、迁移和⾎管⽣成的

基因中的潜在作⽤。⽤TG(Grm 1)CYLD-/-和TG(Grm 1)CYLD+/+⼩⿏原发和转移⿊

⾊素瘤细胞株进⾏的实验证实，CYLD的丢失促进了癌细胞的增殖和迁移，以及在体外

的克隆原性。此外，通过管状形成试验、免疫组织化学和mRNA表达分析，研究者可以

发现CYLD基因敲除可以增加⾎管⽣成模拟和(淋巴)⾎管⽣成。总之，研究者的发现揭

⽰了CYLD在淋巴⾎管⽣成过程中的新功能⽅⾯，并证明了它在⿊⾊素瘤进展的早期过

程中的重要性。

论⽂ID

原名：Loss of CYLD accelerates melanoma development and progression in the

Tg(Grm1) melanoma mousemodel

译名：在TG（Grm1）⿊⾊素瘤⼩⿏模型中，CYLD的缺失加速了⿊⾊素瘤的发展和进展

期刊：Oncogenesis

IF：5.995

发表时间：2019.10

通讯作者：Anja-Katrin Bosserhoff

通讯作者单位：德国埃尔兰根-纽伦堡⼤学⽣物化学研究所、解剖学研究所

结果

CYLD的缺失加速了⿊⾊素瘤的发⽣，促进了体内肿瘤的⽣长

为了研究CYLD在体内⿊⾊素瘤发⽣中的作⽤，采⽤C57BL/6 CYLD基因敲除⼩⿏与

TG(Grm1)⼩⿏杂交。然后对⽣成的TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−⼩⿏进⾏

了发病分析。(图1A)。与TG(Grm 1)CYLD+/+对照组相⽐，TG(Grm 1)CYLD-/-⼩⿏发⽣⿊

⾊素瘤的时间明显提前。CYLD+/+⼩⿏在出⽣后18周出现肿瘤，⽽ TG(Grm1)CYLD−/−⼩

⿏10周后已经观察到了。此外，在肿瘤发⽣后9周随访⽿部、尾部和肛门⿊⾊素瘤⽣长的进展

情况。在这⾥，⼀个从最⼩到极端肿瘤⽣长的评分被⽤来量化⿊⾊素瘤的进展。结果表明，与

CYLD野⽣型⼩⿏相⽐，CYLD基因敲除⼩⿏的肿瘤⽣长速度增加(图1B)。此外，Grm1

mRNA在TG(Grm 1)C淋巴结组织中的表达将GYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−⼩⿏作为⿊

⾊素瘤细胞扩散的标记物。在此，77天龄的CYLD−/−⼩⿏淋巴结中Grm 1表达明显增强，⽽

CYLD+/+⼩⿏则未检测到⿊⾊素瘤细胞。

RNA测序显⽰CYLD相关基因调节

为了明确CYLD依赖的解除管制基因及其导致CYLD基因敲除⼩⿏肿瘤⽣长增加的潜在机

制，进⾏了RNA测序。Tg(Grm1)Cyld+/+与Tg(Grm1)Cyld−/−的原发性肿瘤组织⽤于确定基因表

达谱。RNA测序显⽰，与野⽣型组织相⽐，CYLD基因敲除组织中有398个上调基因和101个下调基因。为了确定解除管制的基因对通路调控的影响，对差异表达的基因进⾏分析，并将其分类为GO项。KEGG路径的分类这些⽅法揭⽰了许多已知的癌症解除管制的途径，例如TGF-β和Rap1(表1)。在此，研究者使⽤Smad2/3响应报告基因测定证实了与CYLD-野⽣型细胞系相⽐，在CYLD-敲除中TGFbeta信号的上调(补充图。S2）。这是⼀致的有⼏种TGFβ靶基因如BMP2K 或SMURF1的差异表达。有趣的是，根据⽣物过程进⾏的分类会产⽣细胞增殖、迁移和⾎管⽣成的调节。(表2)。

表1 KEGG分析

表2 GO分析

TG(Grm 1)⿊⾊素瘤细胞系的构建

在RNA测序结果的基础上，进⼀步了解CYLD在恶性⿊⾊素瘤中的抑癌作⽤，并进⼀步了解tg(Grm 1)CYLD通配型和tg(Grm 1)CYLD-基因敲除⿏细胞株在恶性⿊⾊素瘤中的抑癌作⽤。为此，从尾部和⽿部分离出原发⿊⾊素瘤组织的⿊⾊素瘤细胞，以及淋巴结转移的⿊⾊素瘤细胞（图1c）。由于所有细胞系在⼏代后⾊素沉着消失(图1d)，通过电⼦显微镜观察到所有被测细胞系的⿊⾊素体，证实了⿊⾊素细胞的起源（图1e）。此外，qRT-PCR分析显⽰，培养的

TG(Grm 1)细胞系与⼩⿏⼩脑(阳性对照，设为1)具有相当的Grm 1 mRNA表达⽔平，⽽⼩⿏b16⿊⾊素瘤和⿊⾊素A细胞株(阴性对照)Grm 1却表达极低(图1F)。此外，GRM 1在CYLD-野⽣型和CYLD-基因敲除细胞系中的表达是相当的。这表明，具有相同遗传背景的GRM1产⽣的细胞携带并表达由dct启动⼦控制的Grm 1转基因，因此它们具有⿊素细胞起源。

图1 ⿊⾊素瘤在体内的发⽣和进展以及TG(Grm 1)⿊⾊素瘤细胞系的产⽣。

1a:⿊⾊素瘤发病于TG(Grm 1)CYLD−/−(n=15)和TG(Grm 1)CYLD+/+⼩⿏(n=18)。

1b:肿瘤发⽣后CYLD基因敲除⼩⿏与CYLD野⽣型⼩⿏的肿瘤进展⽐较。评价尾部、⽿部和肛周区肿瘤⽣长进展的分级系统在肿瘤发作后的9周内，如前⾯所述

1c. 从TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−⼩⿏中分离培养⼩⿏原发⿊⾊素瘤(⽿、尾)⿊⾊素瘤细胞及转移性⿊⾊素瘤组织(淋巴结)。

1d: 在⼏个通道之后观察到细胞系的⾊素沉积损失。

1e: ⽤透射电镜观察原发肿瘤细胞株和CYLD+/+和CYLD−/−⼩⿏转移细胞系的球体，可见⿊⾊素⼩体(箭头)。

1f: ⽤qRT-PCR法检测10株TG(Grm 1)细胞株Grm 1 mRNA的表达，并与⼩⿏⼩脑对照(设置为1)进⾏⽐较。使⽤Melana和B16作为阴性对照，β-actin作为参考基因。

1g: 采⽤western blot⽅法检测CYLD蛋⽩⽔平，确定CYLD基因型。以GAPDH为加载对照。(*p<0.05)

CYLD-缺乏症可促进⿊⾊素瘤细胞株的增殖、集落形成和迁移

在从TG(GRM1)CYLD-野⽣型和TG(GRM1)CYLD基因敲除⼩⿏中产⽣⿊素瘤细胞系后，⽤体外功能分析法对细胞进⾏鉴定。⾸先，使⽤XCELLigence系统体外实时增殖试验测量增殖，这⼀分析表明，转移性tg(Grm 1)CYLD−/−细胞与原代肿瘤细胞相⽐，其倍增时间明显缩短，⽽原代肿瘤细胞的增殖潜能则明显降低，⽽有或不表达CYLD的原发肿瘤细胞的增殖潜能是基本相当的。(图2A)。

图2 ⿊⾊素瘤的扩散和迁移能⼒。（a-c增殖）

a，迁移。

b.与TG(Grm 1)CYLD+/+⼩⿏细胞系相⽐，原发肿瘤和转移性TG(Grm 1)CYLD−/−细胞的迁移明显增加。

c.⽤TG(Grm 1)CYLD+/+和TG(Grm 1)CYLD−/−系统对原发⿊⾊素瘤组织(PT)和转移淋巴结(LN)