微生物育种资料名词解释1．富集培养目的微生物含量较少时，根据

微生物育种资料
名词解释
1．富集培养：目的微生物含量较少时，根据微生物生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利生长条件，是目的微生物在最适环境下迅速生长繁殖，数量增加，由劣种变为优势种，以利用分离所需要的菌种。

2．营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养（氨基酸、维生素、核酸等）的能力，只有在基本培养基中补充所缺失的营养因子才能生长。

3．常规杂交育种：通过接合、转化、转导、溶源转化和转染等方式来获得重组体的杂交育种方法。

4．原生质体融合育种：通过酶解破除细胞壁后，制备微生物原生质体，然后诱导原生质体融合杂交，双亲本不受亲和力限制，甚至可以打破种属间遗传障碍。

获得远缘杂交重组体的特殊方式。

5．原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正变菌株。

6．原生质体诱变育种：以微生物原生质体为育种材料，采用物理或化学诱变剂处理，然后分离到再生培养基中再生，并从再生菌落中筛选高产突变菌株。

解答
1．工业生产的微生物菌种的特性
①在遗传上必须是稳定的②易于产生许多营养细胞、包子或其他繁殖体②必须是纯种，
不应带有其他杂菌及噬菌体④种子的生长必须旺盛、迅速⑤产生所需要的产物时间短⑥比较容易分离提纯⑦有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强⑧能保持较长的良好经济性能⑨菌株诱变处理较敏感，从而可以选育出高产菌株⑩在规定时间内，菌株必须产生与其数量的目的产物，并保持相对地稳定
2．工业微生物的发展史
（1）诱变育种。

以人工诱变手段诱发微生物基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选，从多种多样的变异体中筛选出产量高、性状优良的变异株，并找出发挥
这个变株最佳培养基和培养条件，使其在最是环境条件下合成有效产物。

（2）杂交育种。

使双亲或多亲的遗传物质重新组合，以获得综合双亲优良性状的新品种的育种方法。

（3）代谢控制育种。

进行内因改变，通过定向选育某种特定的突变型，以达到大量积累由于产物的目的，定向选育包括改变代谢代谢通路；降低支路代谢终产物
产生或切断支路代谢途径及提高细胞膜通透性。

（4）基因工程育种。

一微生物本身为出发菌株，利用基因工程方法进行改进而获得工程菌，或者是将微生物甲的基因导入微生物乙中，使后者具有前者的某些性
状或者表达前者的基因产物而获得新菌株。

（5）分子定向进化育种。

属蛋白质（酶）非理性设计的主要范畴，不需要了解蛋白质的空间结构和催化机制，实验室人为创造特殊进化条件，模拟自然进化机制，
在体外进行酶蛋白基因的改变，并定向选出所需要的特性突变蛋白。

（6）高通量筛选技术。

首先根据目的样品的特性开发出合适的筛选模型，将样品特性转化为光信号或电信号，而再通过移液、接种、清洗等操作的自动化设备来
进行筛选。

（7）菌株分离。

将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所
需要卫生的过程。

3．含微生物样品的采集
（一）从土壤中采样：
（1）根据土壤特点采样:
①土壤有机质含量和同期状况。

细菌、放线菌在耕作土、菜园土、近郊土；霉菌、
酵母菌在森林土（土层不宜过深，5-25cm）
②土壤酸碱度和植被状况。

偏碱（PH7.0-7.5）细菌、放线菌；偏酸（PH7.0以下）
霉菌、酵母菌（如苹果园—酵母菌，豆科植物—根瘤菌）
③地理条件。

南方高温、温暖季节长、雨量多相对湿度高，植物多，有机质丰富
④季节条件。

冬季少，春节开始增多，秋季采样土壤最为理想。

（2）采样方法：取样铲取5-25cm上层土壤10-25g,装入塑料袋内，编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间、环境条件等，一般取后马上分离，若比较远则用选择性培养基做好试管斜面（取3-4g撒到试管斜面）。

（二）根据微生物生理特点采样
（1）根据微生物的营养类型。

森林——利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌；肉类
加工厂、饭店排水沟——蛋白酶、脂肪酶产生菌；蜂蜜、甜果及含糖量高的植物汁
液——以糖质为原料的酵母菌；油田——利用碳氢化合物为碳源的菌株。

（2）根据微生物的生理特性。

南方、温泉、火山爆发处——高温酶产生菌；南北极、冰窖、深海——低温酶产生菌；海洋底部——耐压菌；甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处
——耐高渗透压酵母菌。

（三）特殊环境下采样
海洋：表层为好氧异养菌，底层为厌气性腐败菌，中间层为紫硫菌；
极端微生物：高温，低温，高酸碱，高盐高辐射下存在的微生物。

4．好氧微生物的分离
粗放型：只达到“菌落纯”，有稀释涂布法、划线分离法、组织分离法；细化型：“菌株纯、细胞纯”，单细胞或担孢子分离。

（一）稀释涂布法和划线分离：
稀释涂布法：把土壤样品以十倍差稀释，取适量涂于分离培养基上，长出单菌落，
挑菌落移到斜面培养基进行培养。

划线分离法：用接种环取部分样品或菌体在培养基平板上划线，长出单菌落，在进
行斜面培养。

（二）利用生化反应分离
（1）透明圈法：加入溶解性较差底物使培养基浑浊，能分解底物的微生物在菌落周围产生透明圈，用于水解酶产生菌（脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶），有机
酸产生菌，培养基加CaCO3（酸水解CaCO3）
（2）变色圈法：加入指示剂或显色剂。

果胶酶产生菌——刚果红溶液染色——绛红的水解圈；谷氨酸产生菌——球百里酚蓝（酸碱指示剂）——菌落周围为黄色。

（3）生长圈法：（分离营养缺陷型）——在缺少所需营养物的平板上培养——产生营养物的菌生长（如氨基酸、核苷酸、维生素产生菌）。

（4）抑菌圈法：用于抗生素产生菌的分离筛选，工具菌采用抗生素的敏感菌，被检测菌能分泌某些抑制菌生长的物质如抗生素等，便会在菌落周围形成工具菌不
能生长的抑菌圈。

（二）组织分离法：（有一些有病组织或特殊组织中分离菌种）
①对一般有病组织的分离方法：切除小块含有菌组织，洗净消毒后移到平皿培养上，
光差确认后挑入斜面培养基中培养。

②食用菌孢子分离法：多包子分离——组织分离；单孢子分离法——单孢子稀释。

（四）单细胞或担孢子分离法：①小滴分离纯化方法（滴一滴与盖玻片，盖在含1滴培养液的凹破片上）②滤纸片法（滤纸浸入培养液后放入空皿，滴加包子悬液）
（五）通过控制营养和培养基条件进行分离
1．培养基的成分：以淀粉为碳源的培养基可鉴别淀粉酶产生菌，用酪蛋白为有机氮源的培养基——蛋白酶产生菌。

2.培养基的PH：（NH4）2SO4生理酸性无机氮源；硝酸钠生理碱性氮源；缓冲剂磷酸
盐。

3．排除不需要的菌类：加入专一性的抑制剂，分离放线菌时加SDS，抑制细菌生长。

4．控制培养温度：①高温微生物，50-60℃；②中温微生物，20-40℃；③低温微生物，15℃或更近。

5．野生型目的菌株的筛选和菌株鉴定
（1）初筛
①平板筛选：平皿快速检测法。

将化学侧测定改为肉眼可见的显色或生化反应。

②摇瓶发酵筛选：摇瓶振荡培养更接近于发酵罐的培养条件，效果比较一致。

（2）复筛：一个菌株重复3-5个瓶，培养后的发酵液采用精确分析方法测定（筛选活性高、性能稳定的菌株）。

（3）菌株鉴定
步骤：①获得该微生物的纯种培养物；②测定一系列必要坚定指标（生理生化：碳源、氮源、碳同化、氮同化；形态：菌落——颜色、光滑度，个体——芽孢、
鞭毛、革兰氏性）；③根据权威性坚定手册进行菌种鉴定。

鉴定技术水平：①细胞形态和习性水平；②细胞组分水平（红外光谱、气相色谱、质谱）；③蛋白质水平（氨基酸序列、凝胶电泳、血清反应）；④基因或ＤＮＡ
水平（核酸分子杂交，Ｇ＋Ｃ％值测定）。

６.微生物诱变育种的优点（用途）
①提高有效产物的产量；②改善菌种的特性，提高产品质量；③简化工艺条件；④开发
新品种。

７．诱变育种的实验设计和准备工作
（1）诱变前对出发菌株的了解；
(2)全面了解菌种的特性及其与生产性能的关系；
（3）了解影响菌种生长发育的主要因素：培养基、斜面培养技术、移种的密度、温度、湿度、药品与材料质量等。

（4）了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系；
（5）建立一个准确、简便、快速检测产物的方法；
（6）研究最佳的菌种保藏培养基的培养条件。

8．诱变育种的步骤与方法
（1）出发菌株的选择；（2）出发菌株纯化；（3）单孢子（或单细胞）菌悬液的制备；（4）诱变剂及诱变剂量的选择；（5）诱变的处理方法（单因子处理和复合因子处理）；（6）纯化分离。

9．突变株的常规分离与筛选
（1）随机筛选。

也称摇瓶筛选，诱变处理后的菌体分离在琼脂板上，培养后随机挑选菌落，一个菌落移入一个斜面，一个斜面的菌体接入一只锥形三角瓶，振荡培养，根
据测定产物的活性的高低决定取舍。

（2）平板菌落预筛
方法：①根据形态筛选变株；②根据平板菌落生化反应筛选菌株（透明圈、呈色圈、抑制圈、浑浊圈）；③采用冷敏感菌（低温下不生长不死亡）筛选抗生素变株。

先在20℃培养，抗生素产生菌形成了菌落，而冷敏菌不生长，再移到37℃时，
冷敏菌生长，而在抗生素产生菌菌落周围，形成抑菌圈。

④浓度梯度法：先
倒入加抗生素的培养基，使平皿倾斜，凝固后平放，加入无抗生素的培养基；
⑤应用复印计数快速筛选变株；⑥琼脂快大通量筛选变株。

摇瓶液体培养：通气量充足，荣养好，培养条件接进发酵罐，易推广，分初筛和复筛，一个君主接入一个锥形瓶，在进行活力测定，1个菌株3-5个瓶。

产物活力测定：
方法：①琼脂平板活性圈法：琼脂快打好孔后，加发酵液，观察圆孔周围的
抑菌圈成水解圈；②纸片法：取小圆片覆于琼脂板上，第发酵液，测量水解
圈的大小；③琼脂薄层纸片法：孢子悬液和培养基混合制成薄板，滤纸片要
覆于其上，加发酵液出现抑菌圈。

变种的特定研究与鉴定：菌种纯度、遗传特性、菌落类型、群体形态、生活能力、保藏方法、碳源利用情况、菌丝生长速度、PH值、温度等。

10．微生物代谢调节控制育种的育种措施
（一）组成型突变株的选育
组成型突变株：操纵基因或调节基因突变引起酶合成诱导机制失灵，菌株不经诱导也能合成酶，或不受终产物阻遏的调节突变型（没有诱导子也能正常合成诱
导酶）。

方法：
①限量诱导物恒化培养。

低浓度诱导物的恒化器中，诱导型野生菌株不能生长，
而组成型能生长。

②循环培养。

移到含有诱导物和不含诱导物的培养基上胶体循环培养，组成型逐
渐占优势。

③鉴别性培养基的利用。

培养基中加入某种物质使出现颜色反应或其他易判断的
变化。

④筛选。

含诱导能力低、但能作为良好碳源的诱导物的培养基上，突变株生长，
野生型不生长。

（二）抗分解调节突变株的选育
抗分解调节突变是指抗分解阻遏和抗分解抑制的突变。

(1)解除碳源调节突变株的选育方法：①循环培养法：快速利用的碳源和慢速利用
的碳源培养基上交替培养，突变株生长；②鉴别性培养基：有颜色反应的物质；
③特殊氮源：葡糖糖为碳源，受阻的底物作为唯一氮源配成培养基，可选出突
变株）；④葡糖糖结构类似物：只能作为移植物而不能最为碳源。

(2)解除氮源分解调节突变株的选育（氮源分解调节值含氮底物的酶受快速利用的
氮源阻遏）。

(3)解除磷酸盐调节突变株的选育
11．杂交育种的基本程序
选择原始亲本→诱变筛选直接亲本→直接亲本之间亲和力鉴定→杂交→分离到基本培养基或选择培养基上培养→筛选重组体→重组体分析鉴定
12．放线菌杂交育种
杂交原理：通过供体向受体转移部分染色体，经过遗传物质交换，最终达到基因重组，
获得重组体，有一部分杂交过程中形成异核体，复制过程中染色体不发生交
换，表现为原养型。

杂交过程：（1）接合。

两个基因型不同的直接亲本混合培养发生部分染色体进行转移和遗传信息交换；
（2）杂合系和重组体杂合系。

杂合系：部分结合子形成后，在繁殖过程中，
两种不同基因型的染色体进行一次交换，交换后的染色体不是封闭的环状而
是呈线状，并且末端有串联的重复体。

重组杂合系：复制过程中，开口的环
状染色体上基因再一次交换，由于位置不同而成为咋和状态，产生各种基因
行不通重组体。

（3）重组体：杂合系或重组杂合系在进一步繁殖过程中，杂合状态染色体不
同区还要交换几次，形成一系列基因型的环状染色体细胞即重组体。

杂交技术：
混合培养法：
（1）直接亲本是杂交配对菌株，
（2）斜面混合接种（杂交前取两亲株成熟孢子或菌丝重选接种到完全培养基斜面）
（3）单孢子子悬液的制备：刮下斜面孢子倒入生有玻璃珠的无菌三角瓶内制
成但孢子悬液。

(4)重组体的检出。

养型重组体的检出：基本培养基上生长的为重组体（还包
括回复突变和互养杂合系菌株）；异养型重组体的检出：选择性培养基（基
本培养基中不加两亲本所要求的营养物质）。

(5)杂合系分析。

组体鉴别：鉴别培养基的影印法。

玻璃纸法：
原理：两亲本都是营养缺陷型，一个亲本要筛选抗性标记，另一亲本对此药物是敏感的，基本培养基上加入此药物变为选择性培养基。

具体方法：两亲本混合接种到完全培养基上的玻璃纸表面，再转移到加入str的基本培养基上，杂合系生长。

分离的检出和鉴别：完全培养基上滴一滴无药的水，挑取杂合系菌丛于水滴中即可生长出分离子。

平板杂交法：适合大量菌落与一个共同实验菌株配对测定致育能力，将多个A亲本点种法分别接种到完全培养基上，将B的孢子悬液接到有限培养基上，将A的
平板影印到B的平板上，则了检出重组体分离子。

13．原生质体融合育种
优势：（1）大幅度提高亲本之间重组频率；（2）扩大重组的亲本范围；（3）原生质体融合时，亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲本的
优良特性。

步骤：（1）直接亲本及其遗传标记选择；（2）双亲本原生质体制备与再生；（3）亲本原生质体诱导融合；（4）融合体再生；（5）融合重组体（标记为融合子）分离；（6）
遗传特性分析与测定。

14、基因组改组育种
概念：传统育种方式与改组相结合，涉及多个亲本之间的重组，从而产生复杂子代组含库，从而快速选育微生物的方法。

基本原理：将诱变育种和原生质体融合育种相结合，首先对出发菌株进行人工诱变，选择目标性状超过出发菌株的正突变体，构成一个由各种变异体组成的突变库。

接
着把这些正向变异菌株制备成原生质体，按等比例混合后，进行多亲本原生质体
融合，之后全基因组交换重组，从中筛选出性状优化的重组体，构成重组体库。

就完成了一转基因组改组
15、基因工程在微生物育种的应用
（1）通过基因工程方法生产药物（2）通过基因工程方法提高菌种的生产能力（3）通过基因工程方法改进传统发酵工艺（4）通过基因工程方法提高菌种抗性
基因工程步骤：（1）目的基因的获得（2）载体的选择与准备（3）目的基因与载体连接或重组DNA（4）重组体的筛选
16、基因工程的主要步骤
（一）DNA的制备
质粒DNA的制备：细菌培养物的生长，细菌的收获和裂解，质粒DNA纯化。

质粒纯化：氧化铯—溴化乙锭梯度平衡离心法，离子交换层析，凝胶过滤层析，分级沉淀法。

原理：质粒DNA是分子量小的闭环超螺旋DNA，细胞用碱裂解时线性DNA变性而环状DNA不变性，高盐下将裂解液恢复至中性时，变性DNA交织成网沉淀。

离心，质粒DNA位于上清液。

（二）目的基因的产生与分离
（1）基因文库法：基因组DNA限制酶消化成大小不等的片段，将所有片段与载体连接，进行噬菌体包装与转染或质粒DNA转化，构建含基因组全部遗传信息的文库。

（2）CDNA文库法：以mRNA为模板，在反转录酶作用下形成互补DNA，这种DNA与载体连接后进行噬菌体包装与转染或质粒DNA转化而构建CDNA文库。

（3）PCR法：模板DNA（单链DNA）在引物（p）的引导下在DNA聚合酶的作用下复制出互补DNA链。

优点：灵敏度高，简便，快速，对标本纯度要求低。

引物设计：（1）序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列；（2）引物长15—40pb；（3）G-C含量50%—60%；（4）引物内部避免形成二级结构；（5）两引物间避免有互补序列；（6）3’端为关键碱基，5’端无严格控制。

（三）DNA的连接：形成重组体
目的基因连接方式：（1）粘性末端连接；（2）平头末端连接；（3）人工接头法；（4）同源多聚连接法。

（四）重组体导入大肠杆菌（克隆）（1）转化：以质粒作载体（2）以病毒作载体（3）以噬菌体作载体
感受态细胞：特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源DNA的能力。

（五）含重组质粒的细菌菌落的鉴定
（六）目的基因的表达
鉴定方法：（1）平板筛选（2）限制酶切图谱筛选（3）PRC筛选重组体（4）原位杂交技术DNA复制、目的基因转录、蛋白质的翻译、宿主菌的选择
基因定位诱变：先克隆待诱变的目的DNA片段并将它与载体重组，在体外对环状重组体进行定位诱变，再将诱变后的DNA片段导入受体细胞使其表达目的产。

此方法可以使目的基因按人们所希望的目标加以改造。

方法：删除法、插入法、取代法、低聚核苷酸有变法。

17、分子定向进化中对蛋白酶的改造方法（理性设计和非理性设计）
（一）理性设计：需要知道目标蛋白质的编码序列以及对应的空间结构、功能和机制等详细
资料，再依据所测的催化部位和催化机理，对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计，然后通过取代、插入或缺失核苷酸序列等方法来改变蛋白质分子中特定的氨基酸，从而获得与酶特性相关的关键残基和结构元件。

表现形式为定点突变或区域性突变。

（1）寡核苷酸引物介导的定点突变
利用合成的含突变碱基的寡聚核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制，该寡聚核苷酸引物作为新合成DNA子链的一部分，所产生的新链具有突变的碱基序列。

（2）PCR介导的定位突变
设计引物时在5’端加入合适的限制性内切酶位点，为PCR产物后续的克隆提供便利，同时可以通过改变引物中的部分碱基而改变基因序列，为有目的的改造基因序列，研究蛋白质结构和功能之间的关系奠定了基础。

（1）重叠延伸PCR（2）大引物突变法
（二）非理性设计：在不了解酶分子结构信息、结构和功能之间的关系的情况下，通过对酶基因的随机突变和基因片段的重组等方法来构建酶的突变库。

然后通过高通量筛选来获得有益突变的方法。