实验一活性污泥和土壤脱氢酶活性的测定

环境生物技术
实验一 活性污泥和土壤脱氢酶活性的测定
一、实验目的
了解活性污泥脱氢酶活性的测定原理及方法
二、实验原理
活性污泥和土壤中的微生物对于有机物的降解，实质上是微生物经过一系列的酶的催化作用下的生物氧化还原反应。

参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，参加生物氧化的重要酶为氧化酶和脱氢酶二大类，其中脱氢酶类尤为重要。

其中脱氢酶类尤为重要。

其中脱氢酶类尤为重要。

其中脱氢其中脱氢酶能使氧化有机物的氢原子活化并传递给特定的受氢体实现有机物的氧化和转化。

如果脱氢酶活化的氢原子被人为受氢体接受，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，就可以通过直接测定人为受氢体浓度的变化间接测定脱氢酶的活性，表征生物表征生物降解过程中微生物的活性。

因此，脱氢酶的活性可以反映处理体系内活性微生物量以及其对有机物的降解活性，以评价降解性能。

解活性，以评价降解性能。

脱氢酶活性测定方法有MB.2H 定性分析法和TTC 比色法，目前用得较多的为氯化三苯基四氮唑（TTC ）比色法。

利用TTC 作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：作为人为受氢体，其还原反应方程式如下：
无色的TTC 受氢后变成红色的TF （三苯基甲月替），根据红色的深浅，测出相应的光密度（OD 值），从而计算TF 的生成量，求出脱氢酶的活性。

的生成量，求出脱氢酶的活性。

三、实验设备及药品
1．紫外-可见光分光光度计、分析天平、50mL 离心管、50mL 具塞三角瓶、50mL 比色管、甲醛、丙酮、4mg/mL 的TTC 溶液（2，3，5-氯化三苯基四氮唑，分析纯）、10 %硫化钠（Na 2S 分析纯）、无氧水（0.36% 亚硫酸钠，分析纯）、连二亚硫酸钠( Na 2S 2O 4 ，分析纯)、Tris （三羟甲基氨基甲烷，分析纯） 2．活性污泥悬浮液或土壤悬浮液。

．活性污泥悬浮液或土壤悬浮液。

要点：(1) 所有操作应当尽量在避光条件下进行。

脱氢酶最适反应条件, 温度温度 30～37℃ , pH 值7.4～8.5。

(2 ) 取用甲醛时要小心, 不要碰到皮肤上, 如若沾到皮肤上要迅速用自来水冲洗。

如若沾到皮肤上要迅速用自来水冲洗。

四、实验步骤
1．绘制T TC 标准曲线标准曲线
① 配制系列浓度的TTC 标准溶液。

标准溶液。

先取5 支50mL 带塞比色管, 按顺序尽快分别加入0. 36% Na 2SO 3 溶液2. 5mL, Tris-HCl 缓冲液( pH 值
7. 6 ) 7. 5mL, 再分别吸取0. 4% T TC 溶液0. 1mL 、0. 2mL 、0. 3mL 、0. 4mL 、0. 5mL, 放入5 支比色管
中, 用蒸馏水定容至50mL, 使成8μg· mL - 1 、16μg· mL - 1 、24μg · mL - 1 、32μg ·mL - 1 、40μg·mL - 1 系
列浓度。

列浓度。

同时另取一支50mL 比色管, 加入0. 36 % Na 2 SO 3 溶液2. 5mL ，Tris - HCl 缓冲溶液( pH 值7. 6) 7. 5mL ，加入蒸馏水至50mL, 作为空白对照。

作为空白对照。

② 向每支比色管中各加入少许( 十几粒) 连二亚硫酸钠( Na 2S 2O 4 ) 混匀, 使TTC 全部还原成红色的TF 。

③ 向各管滴加5mL 甲醛终止反应, 摇匀后再加入5mL 丙酮振荡摇匀, 37℃ 水浴10min 。

④ 在485nm 波长下测定吸光值A 。

⑤ 以A 值为纵坐标, TTC 浓度为横坐标, 绘制出TTC 标准曲线。

标准曲线。

( 2) 活性污泥脱氢酶活性的测定活性污泥脱氢酶活性的测定
① 活性污泥悬浮液的制备活性污泥悬浮液的制备
取50mL 活性污泥液(约1. 5～3g·3g·L
L - 1
) 放入三角瓶中, 加入数粒玻璃珠剧烈摇动将污泥打碎。

4000 rpm 离心5min , 弃去上清液, 再用生理盐水补足水分, 悬浮, 洗涤, 离心, 反复三次。

最后用生理盐水补至原体积。

体积。

② 取4 个40mL 具塞离心管( 1 个对照, 3 个平行) , 分别加入Na 2 SO 3 溶液0. 5mL, Tris-HCl 缓冲液( pH 值7. 6 ) 2. 0mL, 污泥悬浮液2mL, 0. 4% TTC 液0.5mL (对照管不加TTC 液, 以0. 5mL 蒸馏水取代) , 使最终体积都为5mL, 盖紧塞子。

盖紧塞子。

③ 将离心管摇匀, 立即放入37℃水浴中培养10min ( 以显色为准)。

④ 各管分别加入0. 5mL 甲醛终止反应。

再向各管分别加入5mL 丙酮振摇数十次，37℃水浴保温10min 。

⑤ 4000 rpm 离心5min , 取上清液在485 nm 波长下测定A 值并在标准曲线上值并在标准曲线上
查出相应的TTC 浓度。

浓度。

( 3) 土壤脱氢酶活性的测定土壤脱氢酶活性的测定
① 取3 个50mL 具塞三角瓶, 分别称取通过2mm 筛的土样5g , 加入三角瓶中, 再加入5mL 0. 4% T TC 液, 另取一个50mL 具塞三角瓶加入同种土样的灭菌土5g , 也加入5mL 0. 4% T TC 液, 作为对照。

作为对照。

② 将以上4 个具塞三角瓶避光, 37℃保温培养12～24h 。

③ 培养结束后, 加入5mL 甲醛终止反应, 再分别加入5mL 丙酮振荡并在37℃保温10min , 转入离心管。

管。

④ 4000 rpm 离心5min , 取上清液在485nm 波长下测定A 值, 在标准曲线上查出相应的T TC 浓度。

浓度。

五、实验结果与讨论
1．脱氢酶活性的计算：脱氢酶活性= A BC
式中, A 为由标准曲线上查出的TTC 浓度(μg·mL - 1 ) ; B 为培养时间校正值( h ，即反应时间除以60分钟) ; C 为比色时稀释倍数, 当A 值大于0. 8 时, 要适当稀释, 使A 值在0. 8 以下。

以下。

2．影响脱氢酶活性的因素有哪些?
实验二 活性污泥耗氧速率、废水可生化性及毒性的测定
一、目的要求
掌握活性污泥耗氧速率、废水可生化性及毒性的测定方法掌握活性污泥耗氧速率、废水可生化性及毒性的测定方法 二、基本原理
活性污泥的耗氧速率( OUR) 是评价污泥微生物代谢活性的一个重要指标。

在日常运行中, 污泥OUR 的大小及其变化趋势可指示处理系统负荷的变化情况, 并可以此来控制剩余污泥的排放。

污泥的OUR 值若大大高于正常值, 往往提示污泥负荷过高,这时出水水质较差, 残留有机物较多, 处理效果亦差。

污泥OUR 值长期低于正常值,这种情况往往在活性污泥负荷低下的延时曝气处理系统中可见, 这时出水中残存有机物数量较少, 处理完全, 但若长期运行, 也会使污泥因缺乏营养而解絮。

处理系统在遭受毒物冲击, 而导致污泥中毒时, 污泥OUR 值的突然下降常是最为灵敏的早期警报。

此外, 还可通过测定污泥在不同工业废水中OUR 值的高低, 来判断该废水的可生化性及废水毒性的极限程度。

来判断该废水的可生化性及废水毒性的极限程度。

三、材料
( 1) 材料材料
① 0. 025mol·0. 025mol·L L - 1 、pH 7 的磷酸盐缓冲液。

的磷酸盐缓冲液。

② 活性污泥活性污泥
( 2) 方法方法
活性污泥耗氧速率及毒性测定法。

活性污泥耗氧速率及毒性测定法。

四、实验步骤
( 1) 测定活性污泥的耗氧速率测定活性污泥的耗氧速率
① 将250mL 广口瓶2 个, 配好橡皮塞并编号, 在其容积的一半处做一记号, 然后将饱和溶氧的自来水用虹吸的方法装之广口瓶一半处, 再用活性污泥混合液装满全瓶。

再用活性污泥混合液装满全瓶。

② 装满后向1 号瓶中迅速加入10% CuSO 4 溶液10mL, 盖紧塞, 混匀。

混匀。

③ 同时将2 号瓶盖紧塞, 不断颠倒瓶子, 使污泥颗粒保持在悬浮状态。

10min 后,向2 号瓶加入10% CuSO 4 溶液10mL, 再盖紧塞, 混匀后静止。

混匀后静止。

④ 分别测定1、2 号瓶中的溶氧浓度。

通过下式计算耗氧速率r (mg·(mg·L L - 1 · ·h h - 1 )。

r = ( a - b )×)×60/
60/t ×2 式中, a 为1 号瓶中的溶氧浓度( mg·( mg· L L - 1 ) ; b 为2 号瓶中的溶氧浓度( mg·( mg·L L - 1 ) ; t 为2 号
瓶反应时间(min)。

图2-1 耗氧速率测定装置耗氧速率测定装置
( 2) 工业废水可生化性及毒性的测定工业废水可生化性及毒性的测定
① 对活性污泥进行驯化, 方法如下。

取城市污水处理厂活性污泥, 停止曝气半小时后, 弃去少量上清液, 再以待测工业废水补足, 然后继续曝气, 每天以此方法换水3次, 持续15～60 天左右, 对难降解废水或有毒工业废水驯化时间往往取上限, 驯化时应注意勿使活性污泥浓度有明显下降, 若出现此现象, 应减少换水量, 必要时可适量增补些氮、磷营养。

必要时可适量增补些氮、磷营养。

② 取驯化后的活性污泥放入离心管中, 置于离心机中以3000r·3000r·min - 1
min - 1 离心10min ,弃去上清液。

液。

③ 在离心管中加入预冷至0℃的0. 025mol·0. 025mol·L
L - 1 、pH 值为7. 0 磷酸盐缓冲液, 用滴管反复搅拌并抽吸污泥, 洗涤污泥, 洗涤后再离心, 并弃去上清液。

并弃去上清液。

④ 重复步骤③洗涤污泥2 次。

次。

⑤ 将洗涤后的污泥移入BOD 测定瓶中, 再以0. 025mol·0. 025mol·L L - 1 、pH 值为7. 0、溶解氧饱和的
磷酸盐缓冲液充满之, 按以上耗氧速率测定法测定污泥的耗氧速率, 此即为该污泥的内源呼吸耗氧速率。

吸耗氧速率。

⑥ 按步骤①～④按步骤①～④ , 将洗涤后污泥已充氧至饱和的待测废水为基质, 按步骤⑤按步骤⑤
测定污泥对废水的耗氧速率。

将污泥对废水的耗氧速率同污泥的内源呼吸耗氧速率相比较,数值越高, 该废水的可生化性越好。

废水的可生化性越好。

⑦ 对有毒废水(或有毒物质) 可稀释成不同浓度, 按步骤①～⑥按步骤①～⑥
测定污泥在不同废水浓度下的耗氧速率, 并分析废水的毒性情况及其极限浓度。

其中并分析废水的毒性情况及其极限浓度。

其中
相对耗氧速率=Rs/Ro×=Rs/Ro×100%
100% 式中, Rs 为污泥对被测废水的耗氧速率; Ro 为污泥的内源呼吸耗氧速率。

为污泥的内源呼吸耗氧速率。

图2-2 污泥相对耗氧速率与废水的可生化性、毒性的关系污泥相对耗氧速率与废水的可生化性、毒性的关系
五、实验报告
( 1) 根据污泥的内源呼吸耗氧速率以及污泥对工业废水的耗氧速率和对不同浓度有毒废水的耗氧速率算得相对耗氧速率, 然后依据图2-2 评价该废水的可生化性或毒性,以供制定该废水处理方法和工艺时参考。

废水处理方法和工艺时参考。

( 2) 耗氧速率的实质是什么?
实验三 活性污泥微生物的显微镜观察及微型动物的计数
一、实验目的
1． 了解活性污泥絮绒体及生物相显微镜观察方法；了解活性污泥絮绒体及生物相显微镜观察方法；
2． 利用活性污泥的性质和原生动物的状态判断废水处理的运行状况。

利用活性污泥的性质和原生动物的状态判断废水处理的运行状况。

二、实验原理
活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体。

活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体。

污泥中微生物的生长、污泥中微生物的生长、污泥中微生物的生长、繁殖、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。

因此, 在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质以外, 还可借助于显微镜观察微生物的状态来判断废水处理的运行状况, 以便及早发现异常情况, 及时采取适当对策, 保证稳定运行, 提高处理效果。

为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。

为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。

三、材料与方法
1．材料．材料 活性污泥(或生物膜) 样品。

样品。

2．方法．方法 显微镜观察和对活性污泥中的微生物和微型动物进行计数。

显微镜观察和对活性污泥中的微生物和微型动物进行计数。

四、实验步骤
1．压片标本的制备．压片标本的制备
① 取活性污泥法曝气池混合液一小滴, 放在洁净的载玻片中央( 如混合液中污泥较少, 可待其沉淀后, 取沉淀的活性污泥一小滴放在载玻片上; 如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察) 。

② 盖上盖玻片, 即制成活性污泥压片标本。

在加盖玻片时, 要先使盖玻片的一边接触水滴, 然后轻轻放下, 否则会形成气泡, 影响观察。

影响观察。

③ 在制作生物膜标本时, 可用镊子从填料上刮取一小块生物膜, 用蒸馏水稀释，制成菌液。

其他步骤与活性污泥标本的制备方法相同。

液。

其他步骤与活性污泥标本的制备方法相同。

2．显微镜观察．显微镜观察
① 低倍镜观察低倍镜观察
要注意观察污泥絮粒的大小, 污泥结构的松紧程度, 菌胶团和丝状菌的比例及其生长状况, 并加以记录和做必要的描述。

观察微型动物的种类、活动状况, 对主要种类进行计数。

污泥絮粒大小对污泥初始沉降速率影响较大, 絮粒大的污泥沉降快, 污泥絮粒大小按平均直径可分成三类: 大粒污泥, 絮粒平均直径> 500μm; 中粒污泥, 絮粒平均直径在150～500μm 之间; 细小污泥, 絮粒平均直径< 150μm 。

污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形
状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。

镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒; 与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。

絮粒中网形截然不同的称为不规则形状絮粒。

絮粒中网
状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构; 无开放空隙的称为封闭结构。

絮粒中菌胶团细菌排列致密, 絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒; 絮粒边缘界线不清的称为疏松的絮粒。

实践证明, 圆形、封闭、紧密的絮粒相互间易于凝聚, 浓缩、沉降性能良好; 反之则沉降性能差。

活性污泥中丝状菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素, 当污泥中丝状菌占优势时, 可从絮粒中向外伸展, 阻碍了絮粒间的浓缩, 使污泥SV 值和SVI 值升高, 造成活性污泥膨胀。

根据活性污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例, 可将丝状菌分成五个等级：0 级, 污泥中几乎无丝状菌存在; ± 级, 污泥中存在少量丝状菌; + 级, 存在中等数量的丝状菌, 总量少于菌胶团细菌; + + 级, 存在大量丝状菌, 总量与菌胶团细菌大致相等; + + + 级, 污泥絮粒以丝状菌为骨架, 数量超过菌胶团而占优势。

数量超过菌胶团而占优势。

② 高倍镜观察高倍镜观察
可进一步看清微型动物的结构特征。

观察时注意微型动物的外形和内部结构, 如钟虫体内是否存在食物胞、纤毛环的摆动情况等。

观察菌胶团时, 应注意胶质的厚薄和色泽、新生菌胶团出现的比例。

观察丝状菌时, 注意丝状菌生长、细胞的排列、形态和运动特征, 以判断丝状菌的种类, 并进行记录。

并进行记录。

③ 油镜观察油镜观察
鉴别丝状菌的种类时, 需要使用油镜。

这时可将活性污泥样品先制成涂片后再染色, 应注意观察丝状菌是否存在假分支和衣鞘, 菌体在衣鞘内的空缺情况, 菌体内有无贮藏物质的积累和贮藏物质的种类等, 还可借助鉴别染色技术观察丝状菌对该染色的反应。

应。

3．微型动物的计数．微型动物的计数
① 取活性污泥法曝气池混合液盛于烧杯内, 用玻棒轻轻搅匀, 如混合液较浓, 可稀释成1∶1 的液体后观察。

的液体后观察。

② 取洗净的滴管1 支(滴管每滴水的体积应预先测定, 一般可选一滴水的体积为1/ 20mL 的滴管) , 吸取搅匀的混合液, 加一滴到计数板的中央方格内（见图4-13）。

然后加上一块洁净的大号盖玻片, 使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。

使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。

③ 用低倍镜进行计数。

注意所滴加的液体不一定布满整个100 格小方格。

计数时，只要把充有污泥混合液的小方格挨着次序依次计数即可。

要把充有污泥混合液的小方格挨着次序依次计数即可。

观察时观察时, 同时注意各种微型动物的活动能力、状态等。

若是群体, 则需将群体上的个体分别计数。

则需将群体上的个体分别计数。

④ 计算。

设在一滴水中测得钟虫50 只, 样品按1∶1 稀释, 则每毫升混合液中含钟虫数
应为: 50 只×20×20×2 = 2000 2 = 2000 只。

只。

五、实验结果与讨论
1．将观察结果填入表4-5 , 在符合处打“√” 表示。

表示。

2．试比较生活污水中活性污泥与工业废水处理系统中的活性污泥性状以及微型动物的种类、数量等有何差异
3．怎样通过了解微型动物种类或数量变化来反映废水处理情况?
实验四 处理生活污水的活性污泥微生物总DNA 的提取
一、实验目的：
1．掌握环境样品DNA 提取技术。

提取技术。

2．掌握琼脂糖电泳的检测原理和方法。

．掌握琼脂糖电泳的检测原理和方法。

二、实验原理
活性污泥是一种以好氧性细菌为主体的微生物和水中的悬浮物质、胶体物质混杂在一起形成的肉眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主体。

形成的肉眼可见的絮状颗粒，它是废水生物处理过程的主体。

环境样品的微生物总DNA 的提取和纯化方法主要由两部分组成：1.温和裂解细胞及溶解DNA 的技术，包括物理、化学或酶解作用裂解细胞，是DNA 释放出来。

2.在环境样品DNA 得到充分释放后，得到充分释放后，通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、通常采用几种化学和酶学方法中的任一种来去除杂蛋白、RNA 及其他的大分子。

他的大分子。

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA 分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

不同DNA 的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA ，主要是利用分子筛效应使不同大小的DNA 分子分离，把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

溴化乙锭（EB ）在紫外光照射下发射荧光，EB 可与DNA 分子形成EB-DNA 复合物。

三、实验仪器和试剂：
仪器：核酸电泳系统，凝胶成像分析系统，离心机，移液器，水浴锅，涡旋振荡器，EP 管。

试剂：试剂：
1、0.1%磷酸钠缓冲液（PH 8.0）100ml ：1M Na 2HPO 4 93.2ml 、1M NaH 2PO 4 6.8 ml ，加热配制。

配制。

2、溶菌酶。

、溶菌酶。

3、20% SDS 100ml ：20g SDS 加灭菌水定容至100ml ，加热。

，加热。

4、70%乙醇：70ml 无水乙醇，加灭菌水30ml 。

5、TE 缓冲液（PH 8.0）：1M Tris-cl 500ul ，
0.2M EDTA 250ul ，灭菌水49250ul 6、异丙醇，、异丙醇，
7、8mol/LKAc 溶液：392.56g KAC 加灭菌水500ml ，121℃灭菌20min 。

8、1kb DNA 分子量标准。

分子量标准。

9、1%琼脂糖：0.5g 琼脂糖加5ml 10×5ml 10×TBE TBE ，45ml 水。

水。

10、10×10×TBE TBE ：
Tris-base 54g 、Boric Acid 27.5g 、Na 2EDTA 4.65g 加蒸馏水定容至500ml ，用HCL 调PH 8.3
11、核酸上样缓冲液：10×10×ladder ladder 四、实验方法：
1． 取1g 活性污泥，离心12000rpm 3min 去上清，灭菌水洗涤2次，
10000rpm 3min,去上清。

加1ml 0.1mol/L PH8磷酸钠缓冲液,漩涡震荡器震荡20min 。

2． 加溶菌酶5mg ，使终浓度为2.5mg/ml ，振荡5min,37℃水浴30min 。

3． 加120ul20%SDS 轻柔振荡15min ，6000rpm 离心10min 。

4． 取上清液加0.2倍体积冰冷的8MKAc ，颠倒混匀1min ，12000rpm 离心10min 。

5． 吸取上清液移到新的EP 管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀1min ，室温下放
置10min ，12000rpm 离心10min 。

6． 去上清，加1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀，12000rpm 离心2min ，去乙醇后于37℃干燥℃干燥
10min 。

7． 重复做第6步
8． 每管加100 ul TE+400ul 灭菌水+0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min ，
12000rpm 离心10min 。

9． 弃上清液，将沉淀定容于200ulTE 缓冲液中，加0.2倍体积8M KAC ，颠倒混匀，室温
静置5min ，12000rpm 离心10min 。

10． 吸取上清液移到新的EP 管中，加0.6倍体积冰冷的异丙醇，颠倒混匀，室温静置
10min ，12000rpm 离心10min 。

11． 弃上清液，用1ml 70% 乙醇洗涤DNA 沉淀、12000rpm 离心10min ，干燥，溶于
200 ul TE 缓冲液中。

缓冲液中。

12． 吸取20ul DNA 溶液，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳，检测DNA 提取效果。

加上
1kbMaker 作为DNA 大小的标准。

大小的标准。

五、实验报告
把在1%琼脂糖凝胶观察到的现象记录下来，进行分析。

琼脂糖凝胶观察到的现象记录下来，进行分析。

六、思考题六、思考题
①SDS 和乙酸钾的作用?
②不同浓度的琼脂糖凝胶电泳的分辨率
实验五 微生物总DNA 中的16SrDNA PCR 扩增技术
一、实验目的
1．了解以通过引物进行16S rDNA PCR 扩增的基本原理扩增的基本原理
2．掌握从活性污泥微生物总DNA 中进行16S rDNA PCR 扩增的方法扩增的方法
二、实验原理
RCR 是一种选择性体外扩增DNA 的方法，类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依
赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物PCR 由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。

延伸三个基本反应步骤构成。

在本实验中，PCR 扩增的模板是从活性污泥中提取的微生物总DNA ，扩增的目的序列
是微生物16SrDNA 的V3区。

采用的引物是细菌的一对通用引物，正向引物338F:5’338F:5’-CGC
-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCG CGG GGG GAC TCC TAC GGG
AGG CAG CAG-AGG CAG CAG-3’3’。

反向引物518R ：5’5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG--ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’。

其中，正向引物
338F 的5’端连接有40bp 的GC 发夹，以增加DNA 解链区的GC 含量，提高解链温度。

含量，提高解链温度。

三、实验仪器和试剂
1．样品：从活性污泥中提取得到的微生物总DNA 。

2．仪器及相关用品：PCR 扩增仪，琼脂糖凝胶电泳所需的设备，凝胶成像分析系统，移液
枪及吸头，PCR 管，高速离心机。

管，高速离心机。

3．试剂：Taq DNA 聚合酶，10×10×PCR PCR 反应缓冲液，MgCl 2 25mmol/L,四种dNTP 混合物各为
2.5mmol/L 。

引物：正向引物及反向引物（浓度为25pmol/L ），灭菌的去离子水。

模板：从
活性污泥中提取得到的微生物总DNA ，用灭菌的去离子水稀释10倍后用作模板进行PCR
扩增。

1kbDNA 分子量标准：1.0％琼脂糖；核酸上样缓冲液。

％琼脂糖；核酸上样缓冲液。

四、实验方法
1. 建立PCR 扩增反应体系扩增反应体系
PCR 扩增反应体系总体积为50ul ，向PCR 反应管中依次加入以下试剂：10×10×PCR PCR 反应缓冲
液5ul ；dNTPs 2ul ；MgCl 25ul ；引物各1ul ；模板1ul ；Taq DNA 聚合酶2.5U; 去离子水35ul 。

在做上述实验的同时，以去离子水代替扩增模板做一次阴性对照。

在做上述实验的同时，以去离子水代替扩增模板做一次阴性对照。

2．设置PCR 反应条件反应条件
95℃（5min ）→ ｛ 95℃（1min ）→55℃（1min ）→72℃（1min ）｝35个循环→72℃（10min ）
→4℃备用℃备用
3.电泳检查结果
电泳检查结果
PCR反应结束后，取5ul反应液在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，检测扩增产物。

DNA上样
产物大小的参照物。

时，加上DNA分子量标记作为判断PCR产物大小的参照物。

五、实验报告
1. 简述通用引物进行16SrDNA PCR扩增的基本原理
扩增的基本原理
2. 进行结果和观察、记录与分析。

进行结果和观察、记录与分析。

六、注意事项
在配制PCR反应体系的过程中，应在加入dNTP混合物后再加入Taq DNA 聚合酶，因为有些酶的3’→5’外切酶的活性较强，如果反应体系中不含dNTP，可能导致引物分解。

，可能导致引物分解。

1. 应对吸头和PCR管进行高压灭菌，每次操作前必须更换吸头，以免试剂相互污染。

管进行高压灭菌，每次操作前必须更换吸头，以免试剂相互污染。

七、思考题
1. 以细菌通用引物进行16SrDNA PCR扩增的目的是什么？
扩增的目的是什么？
2. 影响PCR扩增效率的因素有哪些？
扩增效率的因素有哪些？
3. 如果出现非特异性的DNA条带，可能的原因有哪些？
条带，可能的原因有哪些？
实验六 细菌淀粉酶和过氧化氢酶定性测定
一、实验目的 1．了解过氧化氢酶试验的反应原理和用途。

．了解过氧化氢酶试验的反应原理和用途。

2．了解淀粉酶试验的反应原理和用途。

．了解淀粉酶试验的反应原理和用途。

3．通过对淀粉酶和过氧化氢酶的定性测定，加深对酶和酶促反应的感性认识。

二、实验原理
酶是微生物机体内生物合成的一种生物催化剂，它是高分子蛋白质，具有催化生物化学
反应加速进行，反应加速进行，并具有传递电子、并具有传递电子、原子和化学基团的作用。

原子和化学基团的作用。

微生物的酶按它所在细胞的部位微生物的酶按它所在细胞的部位
分为胞外酶、胞内酶及表面酶。

本实验对胞外酶中的两种即淀粉酶和过氧化氢酶(亦叫接触
酶)进行定性测定。

进行定性测定。

细菌淀粉酶能将遇碘呈蓝色的淀粉水解为遇碘不显色的糊精，并进一步转化为糖，淀粉
被酶催化分解后用碘检测不到其变色现象；过氧化氢酶能将过氧化氢快速分解为水和氧气，
能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。

能用肉眼很容易的观测到产生的气泡。

三、实验仪器和试剂
1．试管(15mm-150mm)5支、试管架1个、培养皿(90mm)3套、接种环。

套、接种环。

2．肉膏胨淀粉琼脂培养基(1L) : 蛋白胨蛋白胨 10g 、Nacl 5g 、牛肉膏、牛肉膏 5g 、 可溶性淀粉可溶性淀粉
2g 、 琼脂 15g 、 蒸馏水定容到1000ml 121℃ 灭菌20min 。

3．4％淀粉溶液1滴瓶:4g 可溶性淀粉加水至100ml
4．革氏碘液1滴瓶:碘1g 、KI 2g 、蒸馏水300ml （将I 与KI 先行混合，加入蒸馏水少许充先行混合，加入蒸馏水少许充
分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml 。

5．9％过氧化氢1滴瓶：30％过氧化氢％过氧化氢 30ml 蒸馏水蒸馏水
70ml 6．枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。

．枯草杆菌和大肠杆菌斜面各一支。

7．活性污泥．活性污泥
四、实验方法
(一)生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的测定生活污水活性污泥混合液中淀粉酶的测定
①取3支干净的试管，按1、2、3对照编号。

放在试管架上备用。

对照编号。

放在试管架上备用。

②在1号、2号试管内分别加入号试管内分别加入
5ml 、10ml 的活性污泥混合液，再在1号和2号试管中分别加10 ml 和5 ml 蒸馏水。

在对照管内加15 ml 蒸馏水。

蒸馏水。