酶的分离纯化
酶的分离纯化讲解
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
分离纯化一种酶的方法
分离纯化一种酶的方法分离纯化一种酶是生物工程领域的一个重要研究课题，有多种方法可以用来实现这一目标。
下面将介绍几种常用的分离纯化酶的方法。
1.固定相吸附色谱法固定相吸附色谱法是最常用的酶纯化方法之一。
在这种方法中，通过对酶进行吸附，然后使用缓冲溶液洗脱的方式分离纯化酶。
为了实现这一目标，可以选择一种适合酶吸附的固定相，例如亲和树脂、离子交换树脂或凝胶等。
通过在不同的条件下洗脱，可以逐步去除非目标蛋白质，最终得到纯化的酶。
2.亲和层析法亲和层析法是常用的可以选择性地与酶相互作用的方法。
在亲和层析法中，可以通过与酶相互作用的特定亲和剂将酶从复杂混合物中分离出来。
例如，可以根据酶与金属离子的亲和性，使用金属离子柱进行层析。
亲和层析法通常需要先对亲和剂进行固定，然后通过加载样品和适当的洗脱剂来纯化酶。
3.凝胶过滤法凝胶过滤法是一种基于酶的大小差异来分离纯化的方法。
这是一种较为简单的方法，适用于分离不同分子量的酶。
在凝胶过滤法中，通过将混合物通过一系列的凝胶分离层来分离不同大小的分子。
酶分子会在凝胶中被阻止，而较小的分子可以通过凝胶透析孔隙。
通过控制凝胶的孔隙大小，可以选择性地纯化酶。
4.电泳法电泳法是一种常用的酶分离纯化方法，尤其适用于具有不同电荷的酶。
在电泳法中，通过在电场中施加电压，根据不同酶的迁移速度将酶分离出来。
根据酶的等电点和电荷性质，可以选择凝胶电泳或者等电聚焦电泳来分离纯化酶。
电泳法的一个重要应用是SDS-PAGE，它从凝胶中获得酶的纯化和分析。
5.超滤法超滤法是一种可以根据酶的分子量选择性地分离纯化酶的方法。
在超滤法中，通过将混合物通过一系列合适孔径的滤膜，可以将酶与其他较小分子分离开来。
较大分子（包括酶）会被限制在滤膜上方，而较小分子则可以通过滤膜，从而实现分离纯化酶的目的。
综上所述，分离纯化酶的方法有很多种。
选择适用的方法取决于酶的性质、目标和需求。
常用的方法包括固定相吸附色谱法、亲和层析法、凝胶过滤法、电泳法和超滤法。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
酶的分离 纯化
（2-4）
若酶的总浓度用[E]t表示，那么 [E]= [E]t－[ES]，代入式（2-4）并整理得
（2-5）
由于酶的反应速度与[ES]成正比，所以
V = k3 [ES] 将（2-5）代入（2-6），得
（2-6）
（2-7）
第一节 酶促反应动力学
当底物浓度很高时，所有酶都与底物结合生成中间产物ES，则[E]t=[ES]。此时 反应速度达到最大Vmax，即
整理上式可得 Km= [S] 由此可以看出，Km的物理意义就是当酶反应速度达到最大反应速度的一半时的 底物浓度，其单位与物质摩尔浓度单位相同，用mol/L表示。Km数值大小与酶的浓 度无关，是酶反应的特性常数。不同酶的Km值不同，且同一酶在不同的底物下，其 Km值也不同。米氏常数可由实验测得，也可用下面的公式求得：
Vmax= k3 [ES]= k3[E]t
（2-8）
（2-7）除以（2-8），并整理得
（2-9）
这就是米-曼氏方程（Michaelis-Menten equation），又称为米氏方程，式中的 Km是一常数值，称为米氏常数。在特殊情况下，当v = Vmax时，米氏方程可转化为下 式：
第一节 酶促反应动力学
第三章 酶的分离纯化
酶分离纯化的目的
酶分离纯化的目的是使酶制剂 产品达到应用所需的纯度。
分离纯化过程包括3个基本步骤：
1 抽提 2 纯化 3 制剂
Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)
第一节 酶促反应动力学
对许多酶的性质的观察和研究得知，在低的底物浓度[S]下，反应速度（v）直接 与底物浓度[S]成正比；在高底物浓度[S]下，速度趋向于最大值（Vmax），此时反应速 度与底物浓度[S]无关（如图2-1）。
第三章 酶的分离纯化
• 更多的用于其他沉淀方法的一个
组合条件。如用于除去杂蛋白。
• 如：纯化血清胆碱酯酶时，调pH 到2.8-3.0以除去酸性杂蛋白。
2、蛋白质的盐溶和盐析
采用加入中性盐的方法使蛋白质沉淀的方 法称为盐析法。 实际常用的盐溶液是硫酸铵，硫酸钠，磷酸 钾，硫酸镁，氯化钠，磷酸钠等。 稀盐溶液浓度为0.02－0.5mol/L
3、化学破碎法 4、酶学破碎法
高 压 细 胞 破 碎 机
JY92-II D超声波细胞粉碎机
细 胞 破 碎 珠
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
细胞破碎方法及其原理
机械破碎 通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。 捣碎法 研磨法 匀浆法
物理破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 有机溶剂： 甲苯、丙酮 丁醇、氯仿 表面活性剂： Triton、Tween 自溶法 外加酶制剂法
本章 目录
化学破碎
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
酶促破碎
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
1、机械破碎法
（1）有机溶剂处理：常用的有机溶剂有： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等等。有机 溶剂可破坏细胞膜的磷脂结构，从而 改变细胞膜的通透性，再经提取可使 膜结合酶或胞内酶等释和细胞膜中的磷脂及脂蛋
白相互作用，使细胞膜结构破坏， 增加膜的通透性。尤其对膜蛋白 酶的提取特别有效在实验室及生 产中均已应用。
（3）匀浆法：利用匀浆器所产生的剪切 力将组织细胞破碎。匀浆器一般有硬质 磨砂玻璃或硬质塑料或不锈钢等制成， 通常用来破碎那些易于分散、柔软细小
酶的分离纯化
三浓缩 1蒸发 2超过滤 3胶过滤 4反复冻融
三酶的纯化原理与方法
1根据溶解度的不同进行的纯化 A盐析法 B有机溶剂沉淀法 C共沉淀法 D选择性沉淀法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2按照分子大小进行的纯化
A胶过滤（层析）法 B 超过滤法 C超离心法
三根据电学解离性质进行纯化
酶的分离纯化与制剂
一酶分离纯化工作的基本原则 酶分离纯化工作包括三个基本环节： 1抽提（extraction） 2纯化（purification） 3制剂（preparation）。
抽提是要将酶从原料中抽提出来作 成酶溶液；
纯化则是要将酶和杂质分离开来，或者选 择地将酶从包含杂质的溶液中分离出 来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出 去； 制剂则是要将纯化的酶作成一定形式的制 剂。
为了能够成功地进行酶的分离纯化， 应注意以下问题。
1防止酶变性失效 2选择有效的纯化方法 3酶活性的测定贯穿纯化过程的始终
二酶的抽提
一预处理和破细胞 二抽提 1pH 首先应考虑的是酶的酸碱稳定性，选 择的pH不能超过酶的稳定范围。 2盐 抽提液一般采用等渗盐溶液，最普通的 有0.020~0.050mol/L的磷酸缓冲液， 0.15mol/LNaCl溶液等。 3温度 抽提温度一般控制在0~4℃.
A吸附层析法 B离子交换层析法 C电泳法 D聚焦层析法 E快速液相层析法 F疏水层析法
四利用专一亲和作用进行纯化
1亲和层析法 2亲和电泳法 3融合蛋白亲和分离法 4其他相关的亲和分离法 A金属螯合层析法 B共价层析法
实验8-酶的分离纯化
酶促反应速度的测定与酶的活力单位
1、测定酶促反应的速度必需测初速度 2、酶活力
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
C
OH
COOH
H3C
COOH H3C
OH
A BC
A BC
乳酸脱氢酶
图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性
目录
主要内容
➢ 单底物酶处反应动力学 ➢ 酶的分离纯化
[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图 法，v未取倒数。前者对等距离 [S]增值所测数据 作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下 测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。
三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该 法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在 纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一 簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。
k1
ES
[ES]生成速度：v 1 k 1 E t ES S ，[ES]分解速度：v 2 k 1 E S k 2 ES
米
当酶反应体系处于恒态时： v1 v2
氏 方 程 的 推 导
即： k 1 E t E S S k 1 E k 2 S E S EtSE E SSSk1k 1k2
酶的分离纯化
第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。
一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1. 防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。
一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。
常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。
二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1. 细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。
2. 抽提3. 纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。
一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。
1. 机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。
常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。
此法在实验宝和生产规模均可采用。
通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。
物理破碎法包括如下几种方法；1. 温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。
即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。
酶的分离纯化
mol催化活性(Molar Catalytic Activity)表示在单位时间内，酶 分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程：
Vmax=Ko[E] Ko=Vmax/[E] Ko即为转换率(也用Kcat表示),如果每一个酶分子只有一个催 化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子 有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n. 每种酶的转换率不同.下表列出了几种酶的转换率:
测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同 的仅是在加入缓冲液后再加入10 μl待测样品即可。酶活力计 算方法：
单位体积活力（u/ml）=｛ （[（0.07—样品速率）/0.07] ×100%）/50%｝×反应 液 总体积×（反应液稀释倍数/样液体积）
总活力=单位体积活力（u/ml）× 原液总体积
连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸 收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测 反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便， 一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能 用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、 旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光 度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪 的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 下表即是几种连续法的例子：
是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量， 从而计算出酶的活性.
优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活 性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。
缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪， 并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误 差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。 1.4.2 连续反应法(Continuous Method)
酶主要的分离纯化方法
酶主要的分离纯化方法。
1、根据酶分子大小和形状的分离方法。
(1)离心分离。
许多酶往往富集于某一特定的细胞器内，先通过离心得到某一特定的亚细胞成分，然后再对某一特定的酶进行纯化。
包括一般离心、差速离心、密度梯度离心。
(2)凝胶过滤。
酶蛋白分子大小不同，大于凝胶孔径的被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中移动，速度较快；小于凝胶孔径的可自由出人凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动缓慢。
这样通过一定长度的凝胶层析柱后，大小不同的酶蛋白分子就被分开了。
(3)透析与超滤。
通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
超滤指在一定压力下，将溶液强制通过一定孔径的滤膜以达到分离纯化的目的。
2、根据酶分子电荷性质的分离方法。
(1)离子交换层析。
根据不同的蛋白质与离子交换剂的亲合力不同而达到分离目的的方法称为离子交换层析。
(2)层析聚焦。
层析聚焦层析聚焦类似于等电聚焦，但其连续的pH梯度是在固相离于交换载体上形成的。
(3)电泳。
在外电场作用下，由于蛋白质离于所带净电荷的大小和性质不同，因而其泳动方向和速率也不同，从而达到分离的目的。
酶的分离纯化
细胞破碎方法及其原理
机械破碎
通过机械运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。
物理破碎 化学破碎
通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使 溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙 醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子 间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜 的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破 坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等
基本原理
➢ 有机溶剂沉淀主要是降低水溶液的介电常数，减小溶剂的极 性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋 白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。
➢ 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋 白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子 的水膜，因而发生沉淀作用
1、中性盐沉淀
➢ 中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所 以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜， 暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水 胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
➢ 优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操 作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作 用。
➢ 在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低，这称为盐析 现象。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
酶的分离纯化
酶的分离纯化提取原则a. 相似相溶。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
酶的提取方法酶的分离方法1沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。
其中以硫酸铵最为常用。
在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。
主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等2离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。
蛋白质分子在离心時，其分子量、分子密度、组成、形状等，均会影响其沉降速率，沉降係系数即用來描述此沉降性质；其单位为S (Svedberg unit)。
每一种的沉降系数与其分子密度或分子量成正比。
不同沉降系数的蛋白质，可利用超高速离心法，在密度梯度中作分離。
3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。
过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。
酶工程3 第三章：酶的分离纯化
3.3.1 细胞破碎的方法
机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 P72-73
3.3.2酶提取的方法
根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。
盐溶液提取法 酸溶液提取法 碱溶液提取法 有机溶剂提取法 p76
3.3.3影响酶提取的主要因素
1 提取目标:提高提取率减少酶活损失。 1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－
1 分离过程中新设备、新技术的应用会取得 事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。 采用膜分离技术等。
2. 浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失 活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。
3.4 沉淀分离
沉淀分离方法： 盐析沉淀 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 复合沉淀 选择性变性剂沉淀
收集沉淀
10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提 取。
2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH 不宜过高或过低，防止酶失活。
3) 提取液用量：用量增加，提取率增加但分离 成本提高。一般为原液的3-5倍
4) 添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶 或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损 失。
提取时的注意事项
N－末端分析 只适用于一条肽链
免疫技术 高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦
3.3分离与纯化
分离（提取）：在一定条件下，用适当的
溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。
纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法
（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶， 再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一 性，将酶纯化。
过滤
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质 膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
3.5 离心分离
借助于离心机旋转所产生的离心力，使 不同大小密度的物质分离的技术。
第三章 酶的分离纯化
Partially Purified (50~90% pure)
Crude Protein (1% pure)
A 纯化阶段 B 分析方法
Material Background knowledge about Material
Protein / Activity assay
Extraction
(1) 粗蛋白
球 (glass bead)， 超声波振荡,
目标蛋白质是否确实抽取出來？
Juang RH (2004) ECX
■ 细胞打破之后：
(1) 降低温度 (2) 快速纯化 (3) 避免氧化 (4) 避免吸著 (5) 避免污染
Juang RH (2004) ECX
■
酶 纯 化 阶 段 及 分 析 方 法
Homogeneous (>99%)
● 抽取膜蛋白时須添加 Triton X 等表面活性劑
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.8
极性 非极性
■ 植物材料之特殊问题：
● 细胞壁： 较难打破 ● 叶绿体： 特有的酶 ● 液 泡： 有许多干扰物质
■ 植物的细胞壁问题：
较老组织的細胞壁很难打破
Buchanan et al (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants p.54
■ 植物色素在纯化上的问题：
● 色素经常吸附在胶体上难以去除
Scientific American
第五章 酶的提取与分离纯化
仅适用于细胞壁较脆弱的细胞，或者细胞壁预先用酶 处理，或者在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素 等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
对革兰氏阳性菌不适用,为什么？ 由于革兰氏阳性菌的细胞壁由肽多糖组成，可以
承受渗透压的变化，而不致细胞破碎。
3、超声波破碎法
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需反复 多次。
冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
细胞干燥法：如气流干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷 冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变细胞 的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞 进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。
2、酸溶液提取
有些酶在酸性条件下溶解度较大，且稳定性较好， 宜用酸溶液提取。
如：从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可用 0.12mol/L的H2SO4。
提取时要注意溶液的pH值不能太低，以免使酶变 性失活。
3、碱溶液提取
有些酶在碱性条件下溶解度较大，且稳定性较好， 宜用碱溶液提取。 注意事项:
操作时要注意pH值不能过高，以免影响酶的活性。 加碱液的过程要一边搅拌一边缓慢加进，以免出现
局部过碱现象，引起酶的变性失活。
4、有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多 的酶难溶于水、稀盐、稀酸或稀碱中，常用不同比 例的有机溶剂提取。
常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等，这些溶剂 可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂 性。
二、物理破碎法
各种物理因素：
温度、压力、声波等的作用，使组织细胞破碎
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，热胀冷缩的作用使细胞破碎。 对那些较脆弱、易破的细胞破碎效果好，但在酶的
酶的分离与纯化
酶的分离纯化方法简介生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。
酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。
酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(3)酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选 择适当方法和条件提供 直接依据。在工作过程中，从原料开 始每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度 提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。
1 酶活性测定
酶活力(Enzyme Activity)也称酶活性，履指酶催化一定化 学反应的能力.酶活性是研究酶的特性、分离纯化以及酶制 剂生产和应用时的一项不可缺少的指标。酶活力是用在一 定条件下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。酶反 应速度(指初速度)可用单位时间内单位体积中底物的减少 量或产物的增加量来表示.其单位为mol/s。 1.1 酶的活力单位 1.2 摩尔催化活性\分子活性和转化率(催化中心活力)
目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、 停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排 成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在 对化学分析法必须作出新的评价。 （3）放射性化学法 是由具有放射性的产物上测出全放射量，再算出产物量， 从而计算出酶的活性.
优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，也可用于体内酶活 性测定，特别适用于低浓度的酶和底物的测定。 缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应过程无法连续跟踪， 并且同位素对人体有损伤作用。此外，辐射淬灭会引起测定误 差，如3H发射的射线很弱，甚至会被纸吸收。 1.4.2 连续反应法(Continuous Method) 连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸 收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测 反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便， 一个样品可多次测定，且有利于动力学研究，但很多酶还不能 用该法测定。 （1）一般的连续法：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、 旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光 度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪 的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 下表即是几种连续法的例子：
1.3比活力
比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度，即指：单 位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数，一般用IU/mg蛋 白质来表示。一 般来说，酶的比活力越高，酶越纯.
1.4酶活力的测定方法
酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂、抑 制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测 定可用终止反应法或连续反应法。 1.4.1终止反应法(Stopped Method) 终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应 物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形 成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放 射化学法。 使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也 可用SDS）使酶失活或加热使酶变性等。
mol催化活性(Molar Catalytic Activity)表示在单位时间内，酶 分子中每个活性中心转换的分子数目。根据米氏方程： Vmax=Ko[E] Ko=Vmax/[E] Ko即为转换率(也用Kcat表示),如果每一个酶分子只有一个催 化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性.如果一个酶分子 有几个催化中心,那么催化中心活性等于摩尔催化活性除以n. 每种酶的转换率不同.下表列出了几种酶的转换率:
第二章 酶的分离纯化 知识点:
1.酶活性测定 2.酶溶液制备 3.酶分离纯化的基本过程 4.根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 5.调节溶解度的分离方法 6.按电荷的正负性设计的分离方法 7.根据亲和作用建立的纯化方法 8.根据稳定性的差异建立的分离纯化方法 9.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法
醛缩酶以l—P—甘油脱氢酶 为指示酶的偶联测定酶活性法
1.4.3酶活力测定中应注意的几个问题 酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进 行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物 以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除 了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的— 些特点。 首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度才 与底物浓度成正比.初速度的确定一般指：底物消耗量在5 ％以内，或产物形成量占总产物量的15％以下时的速度。 其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度(即过饱 和)，否则，底物浓度本身是—个限制因子，此时的反应 速度是两个因素的复变函数。第三，反应必须在酶的最适 条件(如最适温度、PH和离子强度等)下进行。此外，测定 酶活性所用试剂中不应含有酶的激活剂、抑制剂；同时底 物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度( E)作图，应 得一条通过原点的直线，即v为（E）的线性函数。
学习目标和要求:
1.掌握酶活性测定和酶溶液制备方法. 2.掌握根据分子大小轻重建立的分离纯化方法和按 电荷的正负性设 计的分离方法及.根据亲和作用建 立的纯化方法 3.熟悉酶分离纯化的基本过程 4. 了解调节溶解度的分离方法、根据亲和作用建 立的纯化方法、.根据稳定性的差异建立的分离纯 化方法及.蛋白质(酶)的高效液相色谱分离分析法
邻苯三酚在一定条件下发生自氧化反应，产生的超氧阴离子 自由基可通过自氧化速率来表示。加入SOD，可抑制自氧化速 率，由此计算出酶活力。SOD单位定义为：一定的实验条件下 （见操作），抑制率达到50%时.2的50mmol/L Tris-HCl缓冲液 4.5ml，于25℃保温20min，然后加入预热的45mmol/L连苯三 酚溶液（对照管用10mol/L HCl代替）10μl，迅速迅速摇匀倒 入1cm比色杯，每隔30s在325nm处测一次光吸收值，即可测 定出连苯三酚的自氧化速率，一般要求自氧化速率控制在 0.070OD/min。
（2）偶联的连续法 是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或 间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必 须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示 酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。 如醛缩酶(Aldolase)催化1，6—二磷酸果糖生成3-P—甘油 醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出.用磷酸 丙糖异构酶(Triose Phosphate lsomerase))来作偶联酶 (Coupling Enzyme)， 甘油—1—P—脱氢酶(Glycerol-1Phosphate Dehydrogenase)来作指示酶依据NNADH变成 NAD+的光谱变化来算出醛缩酶活性。 如下图：
（1）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分 光光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例 如葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖+O2→葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧 化物酶和木酚，使发生下列反应:
由于4—甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只 要测定A435，就可知4—甲氧联酚的量，可得H202的量，从而 可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶)必须过 量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5 倍以上。
测酶或粗酶液活力时，方法同测自氧化速率相同，所不同 的仅是在加入缓冲液后再加入10 μl待测样品即可。酶活力计 算方法：
单位体积活力（u/ml）=｛ （[（0.07—样品速率）/0.07] ×100%）/50%｝×反应 液 总体积×（反应液稀释倍数/样液体积）
总活力=单位体积活力（u/ml）× 原液总体积
1.4.4酶活性测定实例
(1)超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 这是一类专门清除体内超氧阴离子的酶,催化反应为:
﹣ ﹣ O2· +O2· +2H+→H2O2+O2
﹣ 由于O2 · 在溶液中极不稳定,给酶活性测定带来许多不便. 目前 ﹣ ﹣ 已有根据O2· 的物理性质测定O2· 的歧化量,从而直接测定SOD 活力的方法.如电子顺磁共振波谱法(ESR)、核磁共振法 （NMR）、紫外分光光度法等，这里只介绍化学法测定酶活力。 以邻苯三酚法为例：
初速度的确定是在底物浓度([S])足够的条件下，通过[E]的 变化来确定 如下图.由图可见，当分别采用不同的酶浓度时， 测得反应量对时间的变化.
求得几个适当时间的反应速度(反应量／反应时间)。再用反应 速度对酶量作图 。由图可见．其中，5min时测得的数据可用 于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏低。
2 酶溶液制备 酶溶液制备包括三个过程的工作，材料预处理和破碎细胞、 抽提、抽提液的浓缩。 2.1材料预处理及破碎细胞 酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：—是释放到细胞 外的酶，叫胞外酶；二是游离在细胞内的酶．叫溶酶；三是 牢固与膜或细胞颗粒结合在—起的，叫结酶，后二者合称胞 内酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差异。微生物胞 外酶，用盐析，或单宁沉淀.有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀 酶，制成酶泥。胞内酶需收集菌体，经破细胞后提取，其中 结酶还有个打断酶蛋白和细胞颗粒结合的问题。动植物细胞， 也有打破细胞的问题，对动物材料，应剔除结缔组织、脂肪 组织等；对植物材料如种子应去壳．以免单宁等物质着色污 染。 进行预处理后，就是破碎细胞。细胞破碎有物理和化学方法 两大类:
2.1.1物理粉碎法 (1)研磨 手磨法是实验室内常用的方法。用石英砂或氧化铝作 助磨剂来制备无细胞 抽提液。此法简单但效率低，制备量少。球磨法，将干菌体放 人球磨机，经数小时研磨，用水或缓冲液抽提。石磨法是选择 坚硬的石磨，装上动力研磨。细菌磨也是在实验室中使用较好 的方法。 (2)机械捣碎 匀浆器和高速组织捣碎器等对细胞作机械破碎. (3)高压法 在结实的圆柱体容器内装上菌体与助磨剂，在2— 15℃下，于活塞上加压冲击，以破碎细胞。 (4)爆破性减压法 将菌体悬浮在N2／C02高压下平衡，37℃振 荡数分钟，然后突然减压，使细胞壁、膜破碎. (5)专用波振荡 专用波振动通过液体时形成局部减压，叫空化 作用，旋涡生成与消 失时，产生很大压力，从而使细胞破碎。 (6 )快速冰冻融化法 由于突然冰冻，使胞内水形成结晶及胞内 外浓度突然改变，可使某些细胞破碎。
用这种方法测酶活力时，应注意由于连苯三酚和被测样液的加 入量只有10ul，在整个反应系统中可忽略不计，故反应液总体 积按4.5计算。