7祝勇

将纯化好的OECs继续培养，在纯化的第3、5、 继续培养，在纯化的第 、 、 将纯化好的 继续培养 10、15、20天观察细胞并进行细胞爬片，随即进 天观察细胞并进行细胞爬片， 、 、 天观察细胞并进行细胞爬片 行免疫细胞化学染色测定P 行免疫细胞化学染色测定P75阳性细胞所占的百分 比。
1.4.5细胞爬片步骤 1.4.5细胞爬片步骤
②将取下的嗅球迅速 置于4ºC的D-Hanks平 置于 的 平 衡盐溶液中， 衡盐溶液中，解剖显 微镜下用眼科剪和眼 科镊彻底除去软脑膜， 科镊彻底除去软脑膜， 仔细剥离嗅球外层组 置于D-Hanks平 织，置于 平 衡盐溶液中。 衡盐溶液中。
用虹膜剪直接将嗅球外层组织剪碎， ③用虹膜剪直接将嗅球外层组织剪碎，剩余的片 状组织块转移至另一试管内， 液洗涤2 状组织块转移至另一试管内，D-Hanks液洗涤 液洗涤 胰酶37ºC消化 分钟，连同机械分散的组织 消化20分钟 次，胰酶 消化 分钟， 匀浆移至全培养液中， 匀浆移至全培养液中，轻轻吹打组织块使之形成 细胞悬液。 细胞悬液。
1.4.4纯化 1.4.4纯化
将培养好的细胞弃去培养基， 差速贴壁法 :将培养好的细胞弃去培养基，PBS 将培养好的细胞弃去培养基 洗2次，然后用胰酶消化 次 然后用胰酶消化3-5min，消化时在倒置 ， 相差显微镜下观察，待细胞突起回缩， 相差显微镜下观察，待细胞突起回缩，细胞胞体 变圆，立刻加入20%FCS的培养基终止胰酶消化， 的培养基终止胰酶消化， 变圆，立刻加入 的培养基终止胰酶消化 轻轻吹打制成单细胞悬液， 轻轻吹打制成单细胞悬液，接种于六孔培养板中 二氧化碳培养箱中继续培养， 于37℃，5%二氧化碳培养箱中继续培养， ℃ 二氧化碳培养箱中继续培养 30min后，将培养上清连同未贴壁细胞进行转种， 后 将培养上清连同未贴壁细胞进行转种， 再过30min重复上一步骤。 重复上一步骤。 再过 重复上一步骤
将培养皿中的上清液弃去， 将培养皿中的上清液弃去，用PBS洗2次，1ml胰 洗 次 胰 蛋白酶消化，显微镜下观察细胞变圆（ 分钟） 蛋白酶消化，显微镜下观察细胞变圆（约2-3分钟） 分钟 加入DMEM/F12+FCS终止消化，并吹打成单细胞 终止消化， 加入 终止消化 悬液，移入离心管，离心5分钟 分钟（ 悬液，移入离心管，离心 分钟（800r/min），弃去 ） 上清，再加入1mlDMEM/F12+FCS，吹打均匀，移 上清，再加入 ，吹打均匀， 入载玻片，培养24-48小时。 小时。 入载玻片，培养 小时
1.4.3培养 1.4.3培养
将细胞悬液细胞计数，调整至密度为 将细胞悬液细胞计数，调整至密度为1x106/ml ， 接种于经多聚赖氨酸包被的直径60mm培养皿中， 培养皿中， 接种于经多聚赖氨酸包被的直径 培养皿中 二氧化碳培养箱中进行培养， 于37℃ 、 5%二氧化碳培养箱中进行培养，培养 ℃ 二氧化碳培养箱中进行培养 3天后进行半量换液，再培养 天用 天后进行半量换液， 天用20%FCS的培 天后进行半量换液 再培养2天用 的培 养基进行换液。 天后进行纯化 天后进行纯化。 养基进行换液。1-2天后进行纯化。
图 1 O E C s 经过纯化后随培养时间延长纯度的变化
2结果
2.1嗅鞘细胞的形态学观察 嗅鞘细胞的形态学观察
原代培养第2天 原代培养第 天，大部分细胞呈 圆形，有呈三角形细胞（ 圆形，有呈三角形细胞（X100） ）
原代培养第4天 原代培养第 天，部分细胞呈 或三极形态，（ ，（X100） 双极 或三极形态，（ ）
原代培养第6天 原代培养第 天，细胞逐渐 已伸出突起（ 长开 ，已伸出突起（X100） ）
纯化培养第20天，P75免疫 细胞化学染色（HRP×100）
2.3胞爬片利用OLYMPUS CX41图象采 将染色的细胞爬片利用 图象采 集显微镜和Smartscape2002生物显微图象分析 集显微镜和 生物显微图象分析 系统进行采集和分析图象，随机选取5个视野 个视野， 系统进行采集和分析图象，随机选取 个视野，计 个细胞中的阳性细胞数， 数200个细胞中的阳性细胞数，计算出阳性细胞 个细胞中的阳性细胞数 所占的百分比并取12例胚胎的平均值 例胚胎的平均值， 所占的百分比并取 例胚胎的平均值，从而得到 嗅鞘细胞的百分比，这种百分比即为OECs的纯 嗅鞘细胞的百分比，这种百分比即为 的纯 度。
1.4.6NGFRp75免疫细胞化学实验
• • • • • • • 1.滴加 －3滴过氧化物酶封闭液（PBR）5分钟 滴加1－ 滴过氧化物酶封闭液 滴过氧化物酶封闭液（ 滴加 ） 分钟 2.用PBS(buffer)漂洗样本 分钟 漂洗样本5分钟 用 漂洗样本 3.滴加 －3滴血清封闭液 ，15分钟后轻轻擦掉。 滴加1－ 滴血清封闭液 滴血清封闭液G， 分钟后轻轻擦掉 分钟后轻轻擦掉。 滴加 4.滴加 －3滴亲和素封闭液 分钟 滴加1－ 滴亲和素封闭液 滴亲和素封闭液15分钟 滴加 5.在buffer中漂洗，擦掉多余的 中漂洗， 在 中漂洗 擦掉多余的buffer 6.滴加 －3滴生物素封闭液 分钟 滴加1－ 滴生物素封闭液 滴生物素封闭液15分钟 滴加 7.在buffer中漂洗，擦干 中漂洗， 在 中漂洗
1.4． 1.4．具体实验方法
1.4.1消毒 消毒 将胚胎断头后浸入盛有0.1% 新 将胚胎断头后浸入盛有 洁尔灭溶液的大烧杯中20分钟 分钟， 洁尔灭溶液的大烧杯中 分钟， 再用大量D-Hanks平衡盐溶液 再用大量 平衡盐溶液 冲洗。 冲洗。 1.4.2取材 取材 自颈后皮肤纵向、 ①自颈后皮肤纵向、向上剪至前 额发迹，向两侧分离， 额发迹，向两侧分离，充分暴 露颅骨，自颅骨矢状缝、 露颅骨，自颅骨矢状缝、冠状 缝剪开，暴露大脑实质。 缝剪开，暴露大脑实质。在颅 前窝将端脑额叶实质向后翻起， 前窝将端脑额叶实质向后翻起， 暴露出双侧嗅球， 暴露出双侧嗅球，见嗅球紧帖 在额叶下面，减断嗅丝， 在额叶下面，减断嗅丝，取下 嗅球。 嗅球。
OECs以它独具一格细胞学特性使得 以它独具一格细胞学特性使得CNS再生潜 以它独具一格细胞学特性使得 再生潜 力得以发挥， 力得以发挥 ， 已有研究表明移植在中枢神经损伤 处的OECs能形成细胞桥引导神经突起生长 ， 并 能形成细胞桥引导神经突起生长， 处的 能形成细胞桥引导神经突起生长 向远距离延伸，使中枢神经损伤得以修复。 国内外通过大量实验证明:移植培养的 移植培养的OECs能促 国内外通过大量实验证明 移植培养的 能促 进脊髓损伤部位神经纤维的生长， 进脊髓损伤部位神经纤维的生长 ， 使再生的神经 纤维通过脊髓损伤部位而重新长入损伤远端，从 纤维通过脊髓损伤部位而重新长入损伤远端， 而 促 进 感 觉 、 运 动 功 能 的 恢 复 。
多聚赖氨酸PLL 多聚赖氨酸 磷酸缓冲液（ 磷酸缓冲液（PBS） ） D-Hanks液 液 DMEM/F12细胞培养液 细胞培养液 EDTA
武汉博士德公司 内医临床医学研究中心 内医临床医学研究中心 武汉博士德公司 武汉博士德公司
1.3 主要仪器
CO２培养箱HF90 ２培养箱 生物净化工作台HFsafe-900 生物净化工作台 TDSA-WS台式低速离心机 台式低速离心机 倒置相差显微镜 解剖显微镜 眼科显微器械 培养瓶 24孔及 孔培养板 孔及96孔培养板 孔及 培养皿 上海力申科学仪器公司 上海力申科学仪器公司 长沙湘仪离心机仪器公司 Olympus公司 公司 Olympus公司 公司 Sigma 公司 Corning 公司 Corning 公司 Corning 公司
• 15.滴加 －5滴新配的 滴加1－ 滴新配的 滴新配的DAB溶液覆盖样本，作用 溶液覆盖样本， 滴加 溶液覆盖样本 作用3 分钟， － 10分钟，在镜下观察控制反应时间 分钟 • 16.在蒸馏水中漂洗一下，再换水洗 分钟 在蒸馏水中漂洗一下， 在蒸馏水中漂洗一下 再换水洗5分钟 • 17.苏木精复染 分钟，PBS冲洗反蓝 苏木精复染15分钟 苏木精复染 分钟， 冲洗反蓝 • 18.梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片 梯度酒精脱水， 梯度酒精脱水 二甲苯透明， • 19.用明视野和相差显微镜观察，随机选取视野计 用明视野和相差显微镜观察， 用明视野和相差显微镜观察 数阳性细胞数并计算阳性百分率。
纯化培养第3天 纯化培养第 天，细胞 生长锥样结构（ 生长锥样结构（X100） ）
纯化培养第5天 纯化培养第 天，细胞伸出较 长伪足较以前明显（ 长伪足较以前明显（X100） ）
纯化培养第15天 纯化培养第 天，出现 较多成纤维细胞（ 较多成纤维细胞（X100） ）
2.2免疫细胞化学染色 2.2免疫细胞化学染色
• 8.加一抗，过夜 加一抗， 加一抗 • 9.在buffer中漂洗，洗三次，每次15分钟，擦掉 在 中漂洗， 分钟， 中漂洗 洗三次，每次 分钟 多余的buffer 多余的 • 10.滴加 －3滴生物素化二抗 分钟 滴加1－ 滴生物素化二抗 滴生物素化二抗30分钟 滴加 • 11.在buffer中漂洗，洗三次，每次15分钟，擦干 11.在buffer中漂洗 洗三次，每次15分钟 中漂洗， 分钟， • 12.滴加 －3滴HSS-HRP30分钟 滴加1－ 滴 滴加 分钟 • 13.在buffer中漂洗，洗三次，每次 分钟，擦掉 中漂洗， 分钟， 在 中漂洗 洗三次，每次2分钟 多余的buffer 多余的 • 14.在1滴DAB中加入 中加入1ml buffer，将DAB显色剂 在 滴 中加入 ， 显色剂 显色剂的buffer混合在一空瓶中 与DAB显色剂的 显色剂的 混合在一空瓶中
人胚胎嗅鞘细胞的体外培养
导师： 刘斌 导师： 2005 2005级研究生 祝勇
前言
神经再生的问题一直是困扰着神经科技工作者的 难题。近年来，随着神经细胞生物学、 难题 。 近年来 ， 随着神经细胞生物学 、 分子生物 神经生理学、神经移植的飞速发展， 学 、 神经生理学 、 神经移植的飞速发展 ， 使得中 枢神经系统（ 枢神经系统（ CNS）损伤与再生的研究有了突破 ） 性的进展。嗅神经鞘细胞（olfactory ensheating glia cell， OECs） 作为一种具有 ， ） CNS星形胶质细胞、少突胶质细胞和外周神经系 星形胶质细胞、 星形胶质细胞 统（PNS）雪旺氏细胞特性的特殊细胞类型 已被 ）雪旺氏细胞特性的特殊细胞类型,已被 广泛用于神经系统（ ）损伤的细胞移植研究。 广泛用于神经系统（NS）损伤的细胞移植研究。
我们从人胚胎的嗅球取材， 我们从人胚胎的嗅球取材，结合嗅球组织的细胞 生长和细胞学等特性得出了一种简单、 生长和细胞学等特性得出了一种简单、快捷的培 养方法， 养方法，为进一步研究和进入临床实验奠定了基 础。
1材料与方法
1.1研究对象: 1.1研究对象: 研究对象 个月自然流产或水囊引产的胚胎（ 3－6个月自然流产或水囊引产的胚胎（由附院及 内蒙古妇幼保健院妇产科提供15 15例 内蒙古妇幼保健院妇产科提供15例) 主要试剂: 1.2 主要试剂: 小鼠抗人NGFRp75 NGFRp75单克隆抗体 Chemicon公司 小鼠抗人NGFRp75单克隆抗体 Chemicon公司 HRP-DAB免疫组化试剂盒 RnD公司 HRP-DAB免疫组化试剂盒 RnD公司 Gibco公司 特级胎牛血清 Gibco公司 Gibco公司 胰蛋白酶 Gibco公司
纯化培养第3天 纯化培养第 天，P75免疫 免疫 细胞化学染色（ 细胞化学染色（HRP×100） × ）
纯化培养第5天 纯化培养第 天，P75免疫 免疫 细胞化学染色（ 细胞化学染色（HRP×100） × ）
纯化培养第10天，P75免疫 细胞化学染色（HRP×100）
纯化培养第15天，P75免疫 细胞化学染色（HRP×100）