绿色荧光蛋白

绿⾊荧光蛋⽩
绿⾊荧光蛋⽩（GFP）的转化表达及免疫印迹检测
王媛0811142
南开⼤学⽣命科学学院⽣物技术08级
⼀、摘要：
本实验利⽤酶切⽅法检测载体中所含GFP⽚段后，通过转化的⽅法把绿⾊荧光蛋⽩（GFP）外源基因转⼊⼤肠杆菌进⾏表达，通过免疫印记杂交⽅法（western blotting）分析GFP在⼤肠杆菌中的表达，在分离检测的全过程中（转化平板，细胞裂解，电泳，电转移），均可通过紫外灯清晰地检测到颜⾊亮丽的绿⾊荧光蛋⽩。

关键词：绿⾊荧光蛋⽩免疫印记杂交
⼆、引⾔：
绿⾊荧光蛋⽩是⼀种源于⽔母(Aequorea Victoria)等海洋⽆脊椎动物的蛋⽩，分⼦量为26.9KD。

GFP的开放阅读框架长度约为740bp，编码238个氨基酸残基。

GFP表达后折叠环化，在氧存在下，由65～67位的氨基酸残基环化，形成发⾊基团，⽆需添加任何酶和底物，在长紫外或蓝光激发下就能发荧光，荧光性质稳定，可保持10分钟。

GFP能在不同的细胞内稳定表达，⽆种属、组织和位置特异性，对细胞⽆毒性且检测⽅法简单，将其作为报告基因已⼴泛应⽤于细胞⽣物学和分⼦⽣物学领域。

免疫印记⼜称蛋⽩质印记，是在凝胶电泳技术和固相免疫测定技术基础上发展起来的⼀种免疫检测技术。

其原理是将膜与胶放在中间，上下加滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电的蛋⽩质向阳极转移，即膜侧连接阳极或⾯向阳极，从⽽将电泳分离的蛋⽩从凝胶转移⾄固相载体上。

三、实验材料、仪器及⽅法：
3.1 实验材料
3.1.1 菌种
E.coli DH5α(pETH)菌株 E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 E.coli BL21菌株 E.coli BL21
(pETH)菌株E.coli BL21 (pETH-GFP）)菌株
3.1.2 试剂与材料
LB培养基（⾃⼰配置灭菌）Amp（100mg/ml）IPTG(10mg/ml) CaCl2(1M) 50*TAE Acry/Bis 贮存液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液泳动缓冲液（5*）上扬缓冲液（5*）转移缓冲液PBS 1.5%
A.P.S 质粒⼩量提取试剂盒Eco RI限制性内切酶DNA Maker Protein Maker pH试纸
3.1.3 仪器
紫外检测仪、超声波细胞粉碎机、垂直板式电泳系统、半⼲式蛋⽩质印迹电转移系统等。

3.2 实验⽅法
1、配置LB培养基，包括液体、固体培养基后灭菌；分别接种pETH-GFP/DH 5α（LA 4ml）⼀⽀，pETH/DH 5α(LA 4ml)⼀⽀，BL21（LB 4ml）四⽀
2、按照protocal,利⽤tiangen质粒提取试剂盒分别提取pETH-GFP/DH 5α、pETH/DH 5α质粒后，按照酶切体系混匀后，⾄于37℃温箱酶切2h。

3、制备0.8%琼脂糖凝胶，20ml每块，加⼊适量EB，按照点样顺序点样后，60V恒压电泳，约0.5~1h.后，凝胶⾃显影拍照（胶图见后⾯实验结果）
4、取40µlBL21菌液接种于4mlLB，37℃，200rpm，约2.5h,此时OD600=0.3~0.5，利⽤氯化钙法制备感受态细胞，制备完成⾄于冰上备⽤。

5、铺制平板，1块LB，4块LA，冷却凝固后于37℃倒置烘⼲备⽤。

其中两块LA平板上⾯涂布IPTG（100µl+100µl⽔），正置备⽤。

6、按照阴性对照、空⽩对照、GFP基因转化表达、GFP基因的转化四组分别进⾏转化，涂板，37℃倒置过夜培养，紫外灯下观察，呈绿⾊荧光的单菌落即为转化⼦。

记录各板菌落数
7、配置泳动缓冲液（5*）100ml*2, 转移缓冲液100ml*4,洗涤制胶槽，装好后备⽤，按照SDS-PAGE 分离胶浓缩胶的配⽅，
按照现配分离胶，然后浓缩胶制胶，凝固后保鲜膜包好，4℃过夜。

接种发荧光的单菌落BL21于4mlLB，37℃，200rpm过夜，同时接种BL21（pETH）作为阴性。

8、诱导表达发荧光及阴性对照后，利⽤超声破碎制备细胞裂解液。

9、按照样品-Maker-阴性对照的点样顺序上样，恒压电泳，40-45V，电泳结束后取下凝胶浸泡于蒸馏⽔下，紫外灯下检测。

10、⽯墨板（+）上依次放置3张浸泡转移缓冲液滤纸--硝酸纤维素膜-凝胶-3张滤纸，不可有⽓泡，盖上⽯墨板
（—），0.8mA/cm2,15min,转膜结束关闭电源，取出膜，紫外灯下检测。

四、实验结果
4.1 核酸胶凝胶⾃显影图像
上样顺序：
1、pETH质粒DNA
2、P质粒DNA
3、pETH质粒DNA经Eco RI酶切
4、pETH-GFP质粒DNA经Eco RI酶切
5、DNA 分⼦量Maker。

*Maker从下到上分别表⽰
500bp,1000bp,2000bp,3500bp,5500bp，
7000bppETH-GFP质粒DNA
*Maker 从下到上分别表⽰
500bp,1000bp,2000bp,3500bp,5500bp，7000bp。

4.2 转化计算
本组转化实验A、B、C三个对照实验均没有长出菌落，D组阴性对照涂于LB的板上⽣长出⼤约5768个菌落，LA板上也没有⽣出菌落。

故转化⼦总数0，感受态细胞总数5768*10000*1000/200=2.884*108。

因板上没有菌落故转化效率，感受态细胞转化率均不可算。

4.3 电泳转膜
电泳，转膜后⽤紫外灯检测均可看见颜⾊亮丽的绿⾊荧光。

五、实验结果分析
5.1 核酸胶凝胶⾃显影图像分析
已知，pETH-GFP质粒DNA经Eco RI酶切后分为5400bp和740bp两个⽚段种源于⽔即为第四道所⽰。

因为酶切后质粒呈线性，故载体较第2道完整pETH-GFP质粒DNA略偏后。

第1道空载载体分⼦量偏⼤，且酶切后两个⽚段（第3道）⼤概的分⼦质量相加为空载，怀疑所接种菌不是带有pETH质粒DNA的菌落。

5.2 转化分析
估计原因是外源⽚段没有转进去或感受态细胞制备并不成功。

即使LB板上长出了许多的菌落，但是并不能说明这些都是感受态细胞，可能绝⼤部分细胞并没有得到成功的处理。

怀疑，可能制备时不够轻柔或者可能有杂菌污染（板上菌落多，没办法看清），或没能保持持续低温。

实验中还应注意：1、BL21接菌于LB培养基⼀定不能接在LA否则不⽣长；2、提取质粒时应注意平衡柱⼦，动作轻柔，溶液混匀；3、酶切反应，注意严格按照酶切体系来，酶试剂注意低温，不要污染；4、诱导的关键是IPTG的加⼊，因它可以与阻遏蛋⽩相结合，使得转录得以继续；5、制备细胞裂解液要注意冰浴，以保证蛋⽩质的活性；6、电泳转移操作时，确保滤纸、膜、凝胶其间⽆⽓泡存在。

六、参考⽂献
杨慧敏，李⽂刚，吴⾼峰，魏娟，王鑫绿⾊荧光蛋⽩的研究进展中国畜牧兽医V ol.35, NO.8。