不同动物TLR7基因研究概况

不同动物TLR7基因研究概况
罗倩敏; 项勋; 林杉; 吴胜; 段纲; 常华
【期刊名称】《《动物医学进展》》
【年(卷),期】2019(040)011
【总页数】4页(P130-133)
【关键词】Toll样受体7; 多态性; 抗病毒
【作者】罗倩敏; 项勋; 林杉; 吴胜; 段纲; 常华
【作者单位】云南农业大学动物医学院云南昆明 650201
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
1998年布鲁斯·艾伦·布特勒等发现对脂多糖(LPS)耐受的小鼠体内携带一个基因与
果蝇Toll基因功能十分相像，称为“Toll样受体”(Toll-like receptors TLRs)[1]。

研究者发现TLRs家族有多个成员，各自染色体位置、基因结构和氨基酸序列不同，能识别不同分子。

TLRs是特异性免疫和天然免疫的连接桥梁，能够控制并启动炎
症反应，通过调节抗原递呈细胞，诱导特异性免疫应答的产生。

TLRs由三部分构成，分为胞内区、胞外区和跨膜区[2]。

TLR7基因于2000年发现，定位于X染色体，有3个外显子，表达于细胞内体-
溶酶体中，广泛存在于多种细胞[3]。

TLR7激活后可招募MyD88蛋白，经效应分子激活两个主要的信号通路(NF-κB和IRF)，促进前炎性细胞因子和干扰素的产生
[4]。

TLR7的主要生物学功能是识别病毒单链RNA，介导抗病毒免疫应答，对治疗各种动物及人类的病毒性感染疾病有着重要意义。

同时，TLR7还在免疫缺陷性疾病、抗肿瘤、免疫调节反应、介导细胞凋亡等方面具有重要功能。

TLR7基因主要表达于心、肺、胎盘、脾、淋巴结和骨髓等组织[2]。

不同动物TLR7基因长度不同，鸽TLR7基因序列全长3 516 bp，开放阅读框(ORF)长为3 175 bp，编码1 048个氨基酸[5]；大鲵(娃娃鱼)TLR7基因序列全长3 747 bp,ORF长为3 150 bp，编码1049个氨基酸[2]；鼠TLR7基因编码1050个氨基酸；鸡TLR7基因全长6 747 bp[6]，编码3 084个氨基酸；钞安军等[7]获得三元猪的TLR7基因序列全长3 160 bp，编码3 153个氨基酸。

1 不同动物TLR7基因单核苷酸多态性分析
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指碱基变异频率大于1%，变异由单个碱基的转换或颠换所引起的，其表现频率高，数量很大。

这种变异能形成遗传标记，通过SNP可以发现疾病相关基因的突变。

采用PCR技术，增扩含有SNP的基因组片段，能检测到SNP位点信息，发现与疾病关联的基因组突变，这种实验操作现已被广泛采用。

事实上，通过SNP发现疾病相关基因突变要比统计家系遗传表现更加准确、方便。

有些SNP不直接表达疾病基因，但与疾病基因相邻，成为标记，因此也具有实验操作意义。

由于SNP的二态性，检测SNPs只需+/-的分析，对规模化种畜禽养殖场来说，SNP检测适合于快速、规模化筛查突变基因组，可以采用SNP来检测疾病易感性。

梁田等[8]对萨福克羊TLR7基因SNP进行分析，在343、350、1244位氨基酸产生错义突变，分别是Lys突变为Gln,突变频率高达45%；Asn突变为Ser，突变频率12.0%和A1244G，Glu突变为Arg，突变频率5.8%，这有可能会影响TLR7的结构或功能，改变疾病的易感性，说明SNP与抗病力之间是有关联的。

研究表明，TLR7基因研究可以用于家禽的抗病育种，根据TLR7基因是否对特定
病毒介导特异性免疫应答，产生抗病性，筛选培育出对特定疫病具有抵抗力的优良品系。

毛兴家等[6]用79个鸡来检测TLR7基因的多态性位点，与遗传进行关联分析，4个多态性位点于LRR(胞外区均有19～25个富含亮氨酸的重复序列)，其中3个位点较为接近，c.3809G>A是非同义突变，Val突变为Ile；c.3851A>T也是非同义突变，Thr突变为Ser；c.3817A>G是同义突变，分析认为该区域的遗传变异可能会影响TLR7配体识别功能的改变。

2 TLR7基因免疫调控作用研究
在病原微生物侵入机体时，不同的TLRs可以诱导相应的树突状细胞(DC)成熟，产生抗原递呈作用[1]。

为了验证TLR7基因免疫调控作用研究，研究者会用到TLR7激动剂(敏化Nanog蛋白和Imiquimod)。

激动剂能促进、兴奋TLR7免疫反应，激动剂能够降低TLR7与TLR8之间的竞争性抑制作用，以提高机体对病原分子的识别，诱导多种细胞因子，达到抗病原体的作用[9]。

刘侃[10]用敏化Nanog蛋白(TLR7激动剂)来分析小鼠睾丸胚胎癌与TLR7激动剂之间的关系，与TLR7偶联后增强Nanog蛋白免疫原性，介导免疫反应增强。

TLR7激动剂使用后MyD88通路下游干扰素与促炎性因子的表达量上升，促进免疫反应产生。

漆育林[11]使用激动剂R848(对应TLR7、8)、Imiquimod(对应TLR7)，验证鹅TLR7免疫学特性，用激动剂处理鹅脾脏和外周血淋巴细胞，通过RT-PCR方法测定TLR7、干扰素和促炎性因子在受到刺激后表达水平是否上调，最后通过比较发现，R848和Imiquimod可增强鹅TLR7的表达，调控下游IFN-α、IFN-λ、IL-6和IL-1β表达水平明显升高。

在今后的研究中，将TLR7激动剂作为一种免疫佐剂来增强机体对疫苗的免疫反应，具有广阔的应用前景。

3 不同动物TLR7基因抗病毒应用
3.1 禽TLR7基因参与抗病毒作用
当新城疫病毒(NDV)感染家禽时，研究者探索TLR7基因的抗病毒作用机制，检测
TLR7基因在各组织中的表达量，结果发现TLR7基因表达量增加，表明TLR7参
与NDV的抗病毒免疫反应。

曾胜强等[12]用中等毒力的NDV感染原代DF-1细胞，用定量PCR检测发现TLR7、MyD88、IFN-α、IL-6等表达量显著升高。

孟
巍[13]用NDV感染鸡胚成纤维细胞(CEF)后，用RT-qPCR方法检测，发现TLR7
表达量有显著变化，说明TLR7参与NDV感染的早期过程。

为了解NDV感染细胞后，TLR7如何进行免疫应答，选取MyD88、IL-2(诱导T细胞、NK细胞增殖
和活化B细胞)、IFN-α(免疫调节、抗病毒及抑制细胞增殖)为研究对象，发现
TLR7通过激活MyD88信号通路，调节IL-2、IFN-α表达来介导免疫应答，发现信号通路中MyD88、IL-2、IFN-α在不同时间段的表达量与TLR7一致[14-15]。

张婷婷[16]用鸡与鸭的NDV强毒对SPF鸡进行攻毒，用RT-qPCR方法检测各个组织的病毒载量，发现TLR7在肺脏与肾脏中的表达量增加，两组之间表达量有差异。

程洋[17]用NDV中等毒株与强毒株分别接种14日龄的SPF鸡，在感染后的
不同时间点取组织测定TLRs的表达量。

结果表明两组新城疫毒株的TLR7在脾脏
表达量升高，在第4天时均开始降低。

闫冰[18]对幼鹅人工感染H9N2禽流感病毒(AIV)和鹅细小病毒(GPV)，测定组织
中TLR7的表达量，发现感染H9N2 AIV病毒后，鹅TLR7在肺脏中的表达水平显著提高；而GPV感染后，TLR7没有明显变化。

在体外感染试验中，用H9N2
AIV和GPV刺激外周血单核细胞，感染后TLR7表达量明显增加；GPV感染后，TLR7表达量无明显差异。

经两组比较可发现TLR7参与抗H9N2 AIV的免疫反应，并促进抗病毒小分子产生，在抗GPV中没有产生免疫反应。

高梦莹[19] 用鸽副黏病毒Ⅰ型(PPMV-1)感染鸽子后，用RT-qPCR技术检测攻毒后各器官中的病毒载量，发现攻毒后TLR7在气管中的表达量明显升高，同时气管中的IL-6表达量也
明显上升，由此可见经病毒感染后，TLR7的表达量变化明显，说明TLR7在鸽体
内抗 PPMV-1中有重要作用。

黄莉等[20]研究发现，鸡感染禽呼肠病毒(ARV)后，TLR7的表达水平上调显著。

提示TLR7在ARV的识别以及宿主免疫应答的激活过程中发挥关键作用。

近年来研究表明，禽类TLR7基因在NDV、H9N2 AIV、PPMV-1和ARV中有较好的抗病毒活性，有助于疾病的防控。

家禽与人类生活息息相关，有的禽类病毒变异毒株已能感染、威胁人类(如H5N1和H7N9 AIV)。

因此，禽类TLR7基因的研究具有重要意义。

3.2 猪TLR7基因参与抗病毒作用
猪感染猪瘟病毒(CSFV)Shimen株和C株后用荧光定量(PCR)检测猪肺泡巨噬细胞中TLR7、TLR2、TLR4和TLR3的表达量，结果发现TLR2、TLR3和TLR7表达量升高，而TLR4的表达量受到抑制[21]。

根据表达量的上升，说明TLR2、TLR3和TLR7可能介导CSFV抗病毒产生免疫反应。

从35日龄的健康仔猪中得到完整的肺脏，分离肺泡巨噬细胞，进行细胞培养，之后用猪流感病毒(SIV)感染猪肺泡巨噬细胞，间接免疫荧光结果显示SIV可以在原代猪肺泡巨噬细胞中增殖[22]。

提取RNA后用荧光定量方法检测TLRs的表达水平，结果TLR3、TLR7等的表达量显著提高，同时TNF-α和TNF-β等表达水平升高。

因此，可以推断出TLR3、TLR7参与SIV抗病毒免疫反应，表明TLR7基因在CSFV和SIV感染过程中有抗病毒活性。

从近年疫情发生来看，病毒变异引起的高致病性传染病，已成为养猪业重大威胁，现有疫苗的保护已落后于疫病的发生，TLR7的研究探索有助于新型疫苗的研发。

同时，SNP筛查也便于养猪场采取针对性防控措施。

3.3 鱼TLR7基因参与抗病毒作用
对于鱼TLR7基因的抗病毒作用研究相比家禽和猪的研究较少。

苏娟娟等[23]使用PCR-RFLP技术在草鱼TLR7基因中发现有11个单核苷酸多态性位点，当感染草鱼呼肠孤病毒(GCRV)后进行检测分析，发现TLR7在脾脏中的表达量与GCRV抗性呈正相关，TLR7在GCRV先天免疫中有正向调控作用。

韦信贤等[24]用RT-
qPCR检测经鲤春病毒血症病毒(SVCV)攻毒后每组的TLRs的表达情况，结果显示，在攻毒后TLR2、TLR3和TLR7的表达水平与对照组相比显著提高，随着病毒量的增加，这几个TLRs的表达量也在提高，表明TLR2、TLR3和TLR7均参与SVCV 抗病毒免疫反应。

因此，TLR7基因在鱼类的GCRV和SVCV感染过程中有抗病毒活性。

4 展望
TLR7基因SNP与遗传、生长性状等很多因素有关，研究表明通过SNP分析机体抗病力，也可根据SNP研究疾病的易感性。

SNP的遗传变异可能会影响TLR7受体识别功能的改变。

通过SNP研究可分析多态性位点，还能经SNP来分析与疾
病发病机理间的关系，具有重要的病理意义。

TLR7在不同动物中具有抗病毒作用，也有研究表明TLR7在抗细菌感染中也有着
重要作用，研究者用柱状黄杆菌株感染草鱼，采用半定量RT-PCR方法来检测组
织中TLRs的表达情况，结果发现TLR3、TLR7和TLR22在组织中的表达量明显
升高，由此可见TLR7也参与柱状黄杆菌抗细菌感染的免疫反应[25]。

目前，TLR7在抗病毒方面的研究较为广泛，而在抗菌方面的涉及较少，以后应进一步加强
TLR7在抗菌方面的研究。

TLR7基因功能研究为进一步了解畜禽感染病毒后抗病毒机制研究提供保证。

目前较多集中于家禽和家畜TLR7基因的功能研究，但关于野生动物尤其是野生鸟类TLR7基因功能研究还未有报道，如将其作为研究突破口，可以为野生鸟类先天免疫系统的深入研究奠定理论基础。

参考文献:
【相关文献】
[1] 郭晓强.Toll样受体的发现及其意义[J].生物学教学,2012,37(3):59-60.
[2] 黄莉莉.大鲵TLR7和MyD88基因结构、表达特征和功能的初步研究[D].上海：上海海洋大学,2016.
[3] 李静,戎庭军,张铭键,等.TLR7的研究进展[J].浙江临床医学,2015(2):315-317.
[4] 熊丹.鸽Toll样受体7基因的克隆及其免疫生物学功能研究[D].江苏扬州：扬州大学,2016.
[5] 韩翡,焦培荣,韦良孟,等.鸽TLR7基因的克隆、鉴定及表达分析[J].华南农业大学学
报,2014(3):18-23.
[6] 毛兴家.鸡TLR7基因SNP筛选及遗传多态性分析[D].湖南长沙：湖南农业大学,2009.
[7] 钞安军,吴宇阳,李坤,等.猪TOLL样受体7全基因的扩增、克隆及生物信息学分析[J].华北农学报,2013,28(1):112-116.
[8] 梁田,杨霞,张勋,等.绵羊Toll样受体7基因多态性分析[J].江苏农业科学,2017,45(8):26-29.
[9] 王晨晨.TLR7激动剂Loxoribine抑制肿瘤生长的免疫学机制研究[D].上海：上海交通大学,2015.
[10] 刘侃.TLR7激动剂敏化Nanog蛋白对小鼠睾丸胚胎癌的免疫杀伤效应研究[D].广东深圳：深圳大学,2015.
[11] 漆育林.鹅TLR7和TLR21的分子克隆、生物信息学分析及其免疫学特性研究[D].四川雅安：四川农业大学,2015.
[12] 曾胜强,冯泽清,刘益平,等.TLRs信号通路和促炎症细胞因子基因在鸡胚成纤维细胞感染新城疫病毒过程中的表达分析[J].四川农业大学学报,2014,32(4):436-441.
[13] 孟巍,刘新雷,王杲强,等.NDV感染的鸡胚成纤维细胞TLR7mRNA表达的动态变化[J].中国兽医科学,2012(6):622-626.
[14] Parmar S,Platanias L C.Interferons:mechanisms of action and clinical
applications[J].Curr Opin Oncol,2003,15(6):431.
[15] Curtsinger J M,Valenzuela J O,Agarwal P,et al.Type I IFNs provide a third signal to
CD8 T cells to stimulate clonal expansion and differentiation.[J].J
Immunol,2005,174(8):4465-4469.
[16] 张婷婷.两种不同来源新城疫病毒的感染对鸡免疫作用的分子机制[D].黑龙江哈尔滨：东北农业大学,2015.
[17] 程洋.感染不同毒力新城疫病毒后鸡免疫器官Toll样受体及炎症相关基因的表达差异[D].四川雅安：四川农业大学,2014.
[18] 闫冰.鹅TLR7和TLR21抗病毒免疫学特性及功能初探[D].四川雅安：四川农业大学,2016.
[19] 高梦莹.人工感染鸽源禽Ⅰ型副粘病毒对鸽免疫机能的作用机制[D].黑龙江哈尔滨：东北农业大学,2016.
[20] 黄莉,谢芝勋,蓝元喜,等.禽呼肠孤病毒感染对SPF鸡外周血淋巴细胞中天然免疫相关基因转录的影响[J].畜牧兽医学报,2017,48(1):116-123.
[21] 郑敏萍.猪瘟病毒结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答的调控[D].陕西杨凌：西北农林科技大学,2016.
[22] 张金秋. 猪流感病毒感染中线粒体蛋白MAVS介导的宿主天然免疫效应[D].江苏南京：南京农
业大学,2016.
[23] 苏娟娟.草鱼TLR7和TLR8基因单核苷酸多态性与草鱼出血病的关联研究[D].陕西杨凌：西北
农林科技大学,2017.
[24] 韦信贤.鲤鱼TLRs功能及鲤春病毒血症病毒感染后免疫相关基因应激表达机制的研究[D].上海：上海海洋大学,2016.
[25] 隗黎丽,吴华东,熊六凤.柱状黄杆菌对草鱼TLRs基因表达水平的影响[J].大连海洋大学学
报,2013,28(4):378-382.。