生物工程下游技术思考题答案

⽣物⼯程下游技术思考题答案
⼀．绪论
1、从某⼀动物培养的细胞中分离某⼀抗体(⼀蛋⽩的代表）的⼀般⼯艺过程。

答：⽣物⼯程下游技术的⼀般⼯艺过程（p12）
2、分离纯化某⼀酶制剂的主要步骤和结果如下表：
（
（2）亲和层析的原理是什么？
3、产品的分离提取⼯艺应考虑那些因素？
答：⽣物分离过纯化过程的选择准则（P16）
①步聚少，成本低②次序合理③产品规格（注射，⾮注射）④⽣产规模⑤物料组成⑥产品形式固体：适当结晶，液体：适当浓缩⑦产品稳定性⑧物性溶解度，分⼦电荷，分⼦⼤⼩，功能团，稳定性，挥发性⑨危害性⑩废⽔处理
第⼆章发酵液预处理
1．沉降速度离⼼的原理。

（p15）
答：沉降速度法：主要⽤于分离沉降系数不同的物质。

2．沉降平衡离⼼的原理。

（p15）
答：沉降平衡法：⽤于分离密度不同的物质。

如梯度密度离⼼。

3．差速离⼼的概念。

（p15）
答：采⽤不同的转速将沉降系数不同的物质分开的⽅法。

4． rpm与RCF的换算关系。

5.已知某⼀离⼼机的转⼦半径为25cm，转速为1200r/min，计算相对离⼼⼒为多⼤？
第三章细胞破碎
1除去发酵液杂蛋⽩质的常⽤⽅法有那些？
答：杂蛋⽩质的除去（p6）
(1) 沉淀法：蛋⽩质是两性物质，在酸性溶液中，能与⼀些阴离⼦（三氯⼄酸盐、⽔扬酸盐）形成沉淀；在碱性溶液中，能与⼀些阳离⼦（Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等）形成沉淀。

(2) 变性法：使蛋⽩质变性的⽅法很多，如：加热，调节pH，有机溶剂，表⾯活性剂等。

其中最常⽤的是加热法。

(3) 吸附法：加⼊某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋⽩质⽽除去。

2产品的分离提取⼯艺应考虑那些因素？
答：(1) 是胞内产物还是胞外产物；
(2) 原料中产物和主要杂质浓度；
(3) 产物和主要杂质的物理化学特性及差异；
(4) 产品⽤途和质量标准；
(5) 产品的市场价格；
(6) 废液的处理⽅法等。

3发酵液过滤与分离的困难的原因及解决⽅法。

答：第⼀节发酵液过滤特性的改变
微⽣物发酵液的特性可归纳为： (P3)
①发酵产物浓度较低，⼤多为1％⼀10％，悬浮液中⼤部分是⽔；
②悬浮物颗粒⼩，相对密度与液相相差不⼤；
③固体粒⼦可压缩性⼤；
④液相粘度⼤，⼤多为⾮⽜顿型流体；
⑤性质不稳定，随时间变化，如易受空⽓氧化、微⽣物污染、蛋⽩酶⽔解等作⽤的影响。

这些特性使得发酵液的过滤与分离相当困难。

改善发酵液过滤特性的物理化学⽅法（P4）
⼀、降低液体粘度：加⽔稀释法和加热法
⼆、调整pH：等电点沉淀法
三、凝聚与絮凝：可是悬浮颗粒间连接⽽体积增⼤，便于去除
四、加⼊助滤剂：助滤剂是⼀种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增⼤。

如：硅藻⼟、纤维素、⽯棉粉、珍珠岩、⽩⼟、炭粒、淀粉等。

五、加⼊反应剂：不影响⽬的产物，可消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，提⾼过滤速率。

4、论述利⽤离⼼法和过滤法进⾏固液分离的原理、常⽤设备及优缺点。

答：⼀、离⼼分离（P8）
原理：利⽤转⿎⾼速转动所产⽣的离⼼⼒，来实现悬浮液、乳浊液的分离或浓缩。

优点：分离速率快、分离效率⾼、液相澄清度好等。

缺点：设备投资⾼、能耗⼤。

此外，连续排料时，固相⼲度不如过滤设备。

种类：多，按其作⽤原理不同，可分为过滤式离⼼机和沉降式离⼼机两⼤类。

1．瓶式离⼼机：常⽤于微⽣物菌体、蛋⽩质的分离等。

2．多室离⼼机：常⽤于抗菌素液―液萃取分离、果汁和酒类饮料的澄清等。

3．碟⽚式离⼼机：左侧：液-固分离右侧：液-液-固分离
⼆、过滤
原理：
⽬的：悬浮液———过滤介质——分离。

分为两种：
澄清过滤：过滤介质为硅藻⼟、砂、颗粒活性炭等，填充于过滤器内即构成过滤层；
也有⽤烧结陶瓷、烧结⾦属、粘合塑料及⽤⾦属丝绕成的管⼦等组成的成型颗粒滤层。

滤饼过滤：过滤介质为滤布，包括天然或合成纤维织布、⾦属织布;毡、⽯棉板、玻璃纤维纸、合成纤维等⽆纺布。

滤饼过滤按推动⼒的不同可以分为四种，即重⼒过滤、加压过滤、真空过滤和离
⼼过滤。

1．板框过滤机2过滤式离⼼机甩⼲式离⼼机(a)分批⽴式轴；（ (c)连续锥型滤⽹
5、影响细胞壁破碎难易程度的主要因素。

答：
6、发酵液预处理的⽬的是浓缩⽬标产物是否正确，为什么？（p2）
答：⽬的：分离不溶物（菌体、悬浮颗粒），除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质。

第四章萃取法
第五章沉淀法和吸附法
第六章、膜分离过程
本章知识体系
液膜的概念
★液膜的膜相组成
乳化液膜的制备
★乳化液膜的分离机制
乳化液膜分离技术的⼯艺流程
★乳化液膜技术的应⽤
1-8章习题
名词解释：
凝聚：
沉淀：
膜：两相之间的不连续区间。

是指分隔两相界⾯并以特定的形式限制和传递各种化学物质。

它可以是均相的或⾮均相的，对称型的或⾮对称型的，中性的或荷电性的，固体的或液体的。

表⾯扩散：
絮凝：
浸取：
选择：
1.⽣物⼯业下游技术是指 C 。

A “物质分离” B“产品加⼯” C “物质分离”和“产品加⼯”
2. 在过滤分离中，滤液通过滤饼的速率与其黏度成。

A 正⽐
B 反⽐ C⽆关
微⽣物代谢产物⼤多。

A 分泌到细胞外 B存在于细胞内
判断：
分离是混合的逆过程，是⼀个熵增加的过程，是⼀个⾃发的过程。

絮凝剂须有长链的线性结构，越长越好。

多级逆流萃取的特点是：萃取剂消耗少，产物收率⾼，萃取较完全。

⾼浓度的中性盐能破坏蛋⽩质、酶等的胶体性质，防⽌蛋⽩质等发⽣沉淀或絮凝现象。

分离过程，是⼀个墒增加的过程，不能⾃发进⾏，需要作功才能实现。

有机溶剂能分解细胞壁中的多聚糖。

通量和压⼒成正⽐，和粘度成反⽐。

简答：
微⽣物发酵液有那些特性？
影响吸附作⽤的因素有那些？
1、吸附剂的性质；（容量⼤、速度快、机械强度⾼）
2、吸附物的性质；（极性宜从⾮极性中吸附极性物）
3、溶液pH的影响；（⾮极性宜从酸性中吸附有机酸）
4、温度的影响；（吸附热越⼤，受温度影响越⼤）
5、溶液中其他溶质的影响。

（⼀般使吸附量下降）
与⽬的产物混合的杂质主要包括那些成分？
答：1. 副产物； 2. 剩余的原料3. ⽣产过程中加⼊的化学试剂；4. ⽣产设备材料物质。

乳化液膜的优点？
溶解过程的能量变化分那三个过程？
柠檬酸钙盐沉淀提取法的化学反应式
论述：
影响蛋⽩质⽴体构象的环境因素？
⼀个良好萃取溶剂要满⾜的要求？
论述反渗透、超滤、微孔过滤、纳⽶过滤的特点？
外加压⼒差⼤于渗透压，就会发⽣溶剂倒流，⾼浓度溶液进⼀步浓缩，反渗透。

使不溶物浓缩过滤的操作为微过滤；分离溶液中微粒和⼤分⼦的膜分离操作为超滤；从溶液中分离出溶剂的膜分离操作为反渗透。

第七章电泳技术
1名词解释
电泳：带电粒⼦，在⼀定电场强度下移动的现象——电泳。

电渗：在电场的影响下，带电荷的液体对携带相反电荷的固定介质进⾏相对运动的现象。

/指在电场作⽤下液体(通常是⽔)相对于和它接触的固定的固体相作相对运动的现象（百度）
免疫电泳：免疫电泳（immune electrophoresis）是将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合起来，⽤于分析抗原组成的⼀种定性⽅法。

（百度）
迁移率：单位电场强度下的泳动速度。

不连续凝胶电泳：在⼀个凝胶电泳系统中不同部位的pH、离⼦强度、缓冲液成分或凝胶孔隙⼤⼩不同的凝胶电泳。

其⽬的在于提⾼电泳分离的范围和分辨率。

（百度）
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
答：影响迁移率的因素 (1) 样品 a.电荷 b．⼤⼩ c. 形状(2)电场 a．电流 b．电压 c.电阻(3) 缓冲液成分浓度 pH (4) ⽀持介质(5)其它
3 ⼀个质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳上跑电泳时结果应为⼏条带？阐述原因。

答：
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
答：
5 不连续电泳样品压缩成层原理。

答：
6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。

答：⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，是解离剂，蛋⽩质分⼦变性（解离）电泳结果是
其亚单位
SDS的作⽤*：⼀、使蛋⽩质解离成亚基；
⼆、电荷屏蔽作⽤，消除电荷对迁移率的影响；
三、消除了形状的影响：结合SDS后蛋⽩变成短棒状，不同蛋⽩短轴⼀样，
长轴不同，只与分⼦量有关。

7 采⽤电泳技术如何测定蛋⽩质分⼦量？如何测定蛋⽩质等电点？
答：分⼦量测定 SDS-PAGE
测定蛋⽩质等电点：等电聚焦电泳(IEF)
8．聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基本原理及缓冲液的选择⽅法。

答：⼀、原理
单体：丙烯酰胺(Acr)，聚合成链状物
双体：甲叉双丙烯酰胺(Bis)（交联剂）交联成⽹状
催化剂：过硫酸铵(Ap)——化学催化；
光照下，核黄素也能催化称光催化。

加速剂：N,N,N′,N′-四甲基⼄⼆胺(TEMED)
⼆、缓冲体系的选择
在选择缓冲系统时可主要从下列三⽅⾯来考虑： pH范围、离⼦种类和离⼦强度。

选择的pH值偏离蛋⽩质的等电点。

9．何为连续体系与不连续体系？
答：连续体系
指电泳槽中缓冲系统的pH、离⼦浓度与凝胶中的相同或整个胶⾯的孔径⼤⼩相同。

不连续体系
指槽中与凝胶中的缓冲系统pH值、离⼦浓度是不同或整个胶⾯的孔径⼤⼩不同。

不连续系统可将样品浓缩成极薄的带从⽽提⾼分辨率。

10．琼脂糖凝胶电泳在核酸分析中的作⽤？
答：主要⽤于分离、鉴定、纯化DNA⽚段，⽤溴⼄锭（简称EB）染⾊。

12．何为免疫电泳？
答：将琼脂(或琼脂糖)作⽀持介质的区带电泳和专⼀性免疫沉淀反应相结合的免疫化学⽅法称为凝胶免疫电泳。

12．等电聚焦的原理。

答：在电泳槽中放⼊载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成⼀个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋⽩质放进此体系时，不同的蛋⽩质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上。

13．电泳染⾊的⽅法有哪些？
答：1．氨基⿊/ 2．考马斯亮蓝R－250/3、考马斯亮蓝G－250/4．荧光染⾊法/
5、银染⾊法 /
6、酶活性染⾊法/
7、专⼀性与配体结合检测法
8、⽤荧光标记的抗体检测
14．如何鉴定出来我们提取出的酶是否有活性，举例说明。

答：
15．核酸分离鉴定有哪些⽅法？
答：
16．要配制聚丙烯酰胺凝胶T为30％，C为6.7％50ml，需丙烯酰胺多少g，甲叉双丙烯酰胺多少g？
答：
17.样品缓冲液中为何加⼊溴酚蓝和⽢油（或蔗糖）？
答：溴酚蓝：前沿指⽰剂
⽢油和蔗糖：增加黏度，防⽌扩散，便于样品在加样孔中沉积
第⼋章层析技术
1.凝胶过滤层析技术的原理。

（P5）
答：⼀、原理
被分离物流经凝胶层析柱时，进⾏着两种不同的运动：垂直向下的移动和⽆定向的扩散运动。

分离原理：它主要根据分⼦⼤⼩不同来分离蛋⽩质及测定其分⼦量。

2．离⼦交换层析的原理及缓冲液如何选择？（P25）
答：分离原理：根据被分离物带电性不同来分离的。

层析缓冲液的选择：（P34）
缓冲液的种类和pH⼤⼩，决定于在此缓冲液的情况下待分离组分的稳定性和
溶解度。

阴离⼦交换剂，选阳离⼦型缓冲液（ Tris 胺盐、吡啶）
阳离⼦交换剂时，选阴离⼦型缓冲液（磷酸、醋酸）
根据交换剂上交换基团的pK值确定所⽤pH
（回忆等电点的概念回答）
⽤阴离⼦交换剂时，pH < pK，带正电
⽤阳离⼦交换剂时， pH > pK，带负电
同时保证被分离组分不失活，有⾜够⼤的溶解度
缓冲液绝不能⼲扰洗脱液的测定。

在⽤紫外吸收法测定蛋⽩质时，不能使⽤带苯环的缓冲离⼦；
在215m～225nm范围内测定肽键含量时，则不能⽤含有羧基的缓冲液。

离⼦强度增加洗脱：缓冲液的浓度尽可能不提⾼的情况下洗脱，可加⼊⾮缓冲
盐如NaCl、KCl等。

尽可能不⽤pH梯度，
改变pH蛋⽩质易变性
同时也会降低溶液的缓冲能⼒。

3.亲和层析的原理。

（P41）
答：通过将具有亲和⼒的两个分⼦中⼀个固定在不溶性基质上，利⽤分⼦间亲
和⼒的特异性和可逆性，对另⼀个分⼦进⾏分离纯化。

被固定在基质上的分⼦称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的
固定相，称为亲和吸附剂。

4．吸附层析的原理。

（P38）
答：吸附是表⾯的⼀个重要性质之⼀。

任何两个相都可以形成表⾯。

其中⼀个相的物质或溶解在其中的溶质在其表⾯密集现象称为吸附。

能够将其它物质聚集在⾃⼰表⾯上的物质，都称为吸附剂；
吸附过程和脱附过程可同时进⾏(可逆的)
同⼀吸附剂对不同物质吸附⼒不同，对同⼀物质的吸附⼒也会因条件的改变⽽改变。

5．⽤分⼦筛法测定分⼦量与SDS－PAGE测定分⼦量在原理和⽅法上有何不同？
答：凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法
6．以含有肽聚糖为载体的填料分离溶菌酶属还是吸附层析，理由何在？
答：亲和层析
7．凝胶过滤层析分离蛋⽩质时的洗脱⾏为可⽤什么来表⽰？是如何表⽰的，范围⼀般在多少？答：分配系数，(实验)
8．凝胶过滤层析的分辨率如何表⽰？要想使⼏个组分分开，分辨率应为多少？
答：(实验)
9、以含有Oligo dT为载体的填料分离mRNA属什么层析技术，理由何在？
答：亲和层析，mRNA
10、以羟基磷灰⽯为填料分离DNA属什么层析技术，试说明其原理？
思考与讨论
哪些因素会影响层析的效果？
答：
第九章核酸的分离纯化与检测技术
1．核酸含量测定有哪些⽅法?
答：⼀、紫外光吸收法⼆、定磷法三、定糖法
2. 核酸提取的注意事项有哪些？
答：RNA的提取注意事项
1．溶液的处理
⼆⼄基焦碳酸（DEPC）处理，
但含Tris的溶液不⽤DEPC处理
2．玻璃和塑料器⽫的处理
玻璃器⽫可在300℃烘烤4⼩时，
塑料制品可⽤氯仿冲洗，
不耐氯仿的可⽤0.2%的DEPC溶液浸泡然后⾼压，
不耐⾼压的需⽤DEPC处理过的⽔反复冲洗。

3．进⾏RNA操作时必须戴⼿
套，因为⼿上有极丰富的RNA酶。

第三节核酸提取中的注意事项
⼀、低温操作，防⽌核酸酶降解核酸.
⼆、加⼊EDTA螯合⾦属离⼦，防⽌核酸酶降解核酸.
三、组织DNA提取时，为了防⽌⼀些⾊素有机酸的⼲扰，可加⼊⾼氯酸、⼄醇除去。

四、防⽌核酸酶的降解（主要指植物中DNA酶对DNA的降解），提取时加⼊柠檬酸盐。

五、防⽌DNA被打断，加⼊冰⼄醇要缓慢加⼊。

3．DNA的浓缩有哪些⽅法？
答：
4、在DNA提取中加⼊氯仿、苯酚、SDS和⼄醇等试剂，说明其作⽤。

答：SDS:蛋⽩质的变性剂。

/酚：使蛋⽩质变性，使变性的蛋⽩质溶在其中。

/氯仿：蛋⽩质变性剂，可去除脂质，并且能促进两相分离。

/⼄醇：核酸在⼄醇溶液中溶解度很低，⼄醇有沉淀核酸的作⽤。

5、如何证明DNA中含有杂质RNA?
答：
6、如何证明RNA中含有DNA杂质？
答：电泳
第⼗章蛋⽩质的分离与测定技术
1、蛋⽩质纯化从原理上分可有哪⼏种⽅法？
答：溶解度不同：如盐析、有机溶剂分级沉淀法
分配系数不同：如分配层析法
吸附性不同：如吸附层析法
在电场中运动速度不同：如电泳法
沉降系数或密度不同：如离⼼法
分⼦量不同：如凝胶过滤层析法、SDS－PAGE法
⽣物学特性不同：如亲和层析法
以上提取纯化⽅法的适当结合，在多数情况下，⾜以获得纯化的蛋⽩质。

2、蛋⽩质分离提取的⼀般步骤及注意事项。

答：(1)材料的选择和预处理；
(2)破碎⽣物组织(原料是细胞外分泌物时⽆需此步)，并⽤适当的缓冲液将蛋⽩
质提取出来；
⑶⽤离⼼法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎⽚与溶液分开；
(4)应⽤盐析法或有机溶剂法将有关蛋⽩质组分沉淀下来；
(5)进⼀步应⽤层析法或电泳法使各种蛋⽩质分开；
(6) 结晶或制成冻⼲粉。

3、举例说明沉淀分离蛋⽩质的⽅法。

答：盐析法有机溶剂法
4、蛋⽩质含量测定的⽅法有哪⼏种?原理如何?
答：⼀、双缩脲法
原理:是铜离⼦与蛋⽩质的肽键结合，形成紫红⾊络合物，此物质在540nm处有最⼤吸收，可以⽐⾊测定，
⼆、Folin—酚试剂法(Lowry法)
原理:在碱性条件下，蛋⽩质与碱性铜溶液中的铜络合使得肽键伸展，暴露出的酪氨酸和⾊氨酸与磷钼钨酸反应，产⽣深蓝⾊,500nm处⽐⾊
三、紫外吸收法测定蛋⽩质含量
是利⽤物质在紫外光区（200～400nm）特有的吸收光谱
1.280nm紫外吸收法/2．280nm和260nm处的吸收差法/3．215nm
和225nm的吸收差法
四、考马斯亮蓝染⾊法（Brodford法）
蛋⽩质通过范德华键与染料考马斯亮蓝G—250结合，引起染料最⼤吸收峰的改变（颜⾊由棕红⾊变为蓝⾊），从465nm变为595nm处的光吸收值增加，即可进⾏定量。

五、凯⽒定氮法
被测样品与浓硫酸共热时分解产⽣氨，氨和硫酸结合⽣成硫酸铵。

硫酸铵在强碱作⽤下分解产⽣氨。

⽤⽔蒸⽓蒸馏法将氨收集于过量的硼酸中，然后⽤标准酸溶液滴定。

根据所测得的含氮量，利⽤蛋⽩质中氮的含量约为6.25％，计算样品的蛋⽩质含量。

5、蛋⽩质纯度鉴定的⽅法有哪⼏种？
答：⼀、电泳法/⼆、通过层析性质的检测/三、免疫化学法 /四、蛋⽩质化学
结构分析法 /
6、蛋⽩质结晶的⽅法有哪⼏种？
●答：盐析法
●有机溶剂法
●等电点结晶
●温差结晶
●脱盐结晶
●⾦属离⼦
7、蛋⽩质⼲燥的⽅法有哪⼏种？
答：常压吸收⼲燥/冷冻⼲燥/真空⼲燥/喷雾⼲燥/滚筒⼲燥/红外线⼲燥/微波⼲燥/⾼压静电⼲燥
8、某学⽣分离提取得到某⼀个酶，测定其活性发现没有活性，分析其可能原因。

答：
9、向⼀蛋⽩质溶液中加⼊有机溶剂，该蛋⽩沉淀下来，该蛋⽩的活性是否受到影响？为什么？
答：
10、⼀个蛋⽩质的提取物，SDS-PAGE后发现有多条带，试分析可能原因。

答：
11、欲使1L溶液的硫酸铵饱和度从20％升到75％，需加⼊饱和硫酸铵多少？
答：
12.某⼀蛋⽩经SDS-PAGE后在标准蛋⽩的13000～36000D间出现了⼀条带，加⼊巯
基⼄醇和碘⼄酸处理后，发现SDS-PAGE后仍然为⼀条带，且带的位置在13100D处，试推断⼀下该蛋⽩的可能结构。

（碘⼄酸可以结合在巯基上）
答：
13. 叙述从培养的细胞中提取纯化⽬的蛋⽩的基本程序。

答：(1)材料的选择和预处理；
(2)破碎⽣物组织(原料是细胞外分泌物时⽆需此步)，并⽤适当的缓冲液将蛋⽩
质提取出来；
⑶⽤离⼼法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎⽚与溶液分开；
(4)应⽤盐析法或有机溶剂法将有关蛋⽩质组分沉淀下来；
(5)进⼀步应⽤层析法或电泳法使各种蛋⽩质分开；
(6) 结晶或制成冻⼲粉。