9 亲和色谱

然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
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这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
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经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
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配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
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目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
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9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
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9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
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作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
9
亲和色谱
亲和色谱（亲和层析）是利用生物分子对之 间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分 离纯化的技术。 在该技术中亲和分离过程是通过引入亲和配
基得以实现的。
亲和配基：对生物分子具有专一性识别或特 异性相互作用的物质。
1
生物亲和作用（bioaffinity)简称亲和作用 （affinity)，是生物分子间特异性相互作用。 利用生物亲和作用的高度特异性与其他分离技术如 膜技术、双水相萃取、反胶团萃取、沉淀分级和电泳 等相结合，出现了亲和膜分离、亲和过滤、亲和分配、 亲和反胶团萃取、亲和沉淀等亲和纯化技术。 在众多亲和分离技术中，亲和色谱分离技术是应 用最多、分离效率最好的技术。
糖结合配基和蛋白质结合配基）、染料配基、氨基酸类亲
和配基、核苷酸及核苷酸类似物配基和仿生配基等几类。 11
在亲和层析中，作为固定相的一方称为配 基。配基必须偶联于不溶性母体上。 母体又称为载体或担体，一般采用琼脂糖 凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和纤维素 等。 当用小分子化合为作为配基时，由于空间
定化；
⑤抗微生物和酶的侵蚀；
⑥最好为粒径均一的球形粒子。
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常用的载体有 葡聚糖、聚丙烯酰 胺等，近年来 多孔硅胶 和 合成高分 子化合物 载体正在被开发应用于亲和
层析。
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载体的选择 可被应用的载体（基质）：（按性能优劣排序）
琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、 纤维素。 最常用的是琼脂糖，Sepharose 1B到10B
分离有生物活性与失去生物活性的蛋白质。
44
9.5 亲和色谱的应用
9.5.1 t-PA的纯化—酶的抑制剂为亲和配基
组织纤维溶酶原激活物
45
9.5 亲和色谱的应用
9.5.2 干扰素的纯化—免疫亲和色谱
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9.5 亲和色谱的应用
9.5.3 脱氢酶的纯化—色素亲和色谱
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9.5 亲和色谱的应用
9.5.4 淀粉酶抑制剂的纯化—固定化金属离子亲和色谱
选择 根据欲分离物质特性 配基 选择 根据配基分子大小及基团特性 载体 偶联 亲和层析剂
2）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。
包括：非专一性洗脱和专一性洗脱
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非专一性洗脱：
改变温度
改变pH值
改变离子强度
专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制
剂、底物类似物）
被吸附物质结合
竞争性地与
配体结合
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• 当亲和作用很大，用通常的方法不能洗脱 目标产物时，可用尿素或盐酸胍等变性剂 溶液使目标产物变性，失去与配基的结合 能力。但应注意目标产物变性后能否复性。
• • 洗脱结束后，亲和柱仍需继续用洗脱剂洗 涤，直到无亲和物存在为止，再用平衡缓 冲液充分平衡亲和柱，以备下次使用。
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操作：
1） 层析前：制备亲和层析剂
2
9.1 生物亲和作用
• • • • 生物体内相互作用的分子对： (1) 酶—底物或抑制剂或辅酶 (2) 抗原—抗体。 (3) 激素—受体。 (4) 糖蛋白与凝集素。 (5) 生物素—生物素结合蛋白等
9.1.1 亲和作用的本质：钥匙和锁孔的关系 相互作用静电作用配位键 Nhomakorabea氢键
弱共价键
疏水性相互作用
许多生物大分子化合物具有与其结构相对应的专 一分子可逆结合的特性。 如蛋白酶与辅酶、抗原和抗体、激素与其受体、 核糖核酸与其互补的脱氧核糖核酸等体系，都具有这 种特性，生物分子间的这种专一结合能力称为亲和力。
9
亲和层析
依据 生物高分子物质 能与相应专一配基
分子可逆结合的原理，采用一定技术，把与
目的产物具有特异亲和力的生物分子固定化 后作为固定相，则含有目的产物的混合物 （流动相）流经此固定相后，可把目的产物 从混合物中分离出来，这种分离技术称为亲 和层析。
位阻作用，难于与配对的大分子亲和吻合，常
在母体与配基之间引入适当长度的连接臂。
12
•
要使不溶性母体与配基偶联或通过连接臂 与配基偶联，必须先使母体活化。
•
即通过某种方法(如溴化氰法、叠氮法等)， 使母体引入某一活泼的基团，才能以共价键与 配基偶联。
•
活化后的不溶性母体已有商品出售。商品
名为偶联凝胶。
3
•
凝集素（Lectin）是指一种从各种植物，无脊椎动 物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白，因其能 凝集红血球（含血型物质），故名凝集素。
•
常用的为植物凝集素（Phytoagglutin，PNA），
通常以其被提取的植物命名，
• 如刀豆素A（Conconvalina，ConA）、 • 麦胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、 • 花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）和 • 大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，凝集素 是它们的总称。
4
亲和配基： 生物特异性配基：如抗体 拟生物亲和配基：染料、金属离子 亲和配基应具备的条件： ① 结合是可逆的 ② 结合常数要适当
③ 可化学改性
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亲和配基分类：
单专一性小分子：激素、金属离子
基团专一性小分子：酶的辅因子
专一性大分子：小扁豆凝集素
免疫亲和：抗原、抗体
基团专一性大分子：与核苷酸结合的蛋白
清洗操作目的是洗去介质颗粒内部和 颗粒间空隙中的杂质，一般使用与吸附时 相同的缓冲液。
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9.4 亲和色谱过程分析
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特 异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具 有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲 和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标 产物。
非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离 子强度、离子种类或温度等降低目标产物的 亲和吸附作用。 36
图7-14 间隔臂的作用
26
27
9.3 亲和色谱介质
9.3.2 亲和吸附剂及其制备方法
偶联（亲和吸附剂的制备）
配体一定，改造载体（基质）
1）基质活化：
不同的载体活化需要不同的活化剂。
常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、
戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。
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溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。
Often need spacer arm
Spacer arm
AC ver 990326 30
but watch out for adsorption to the spacer!
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9.2 亲和色谱原理
图 亲和色谱操作示意图
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9.2 亲和色谱原理
把具有特异 亲和力的一 对分子的任何一方作为配基， 在不伤害其生物功能的情况 下，与不溶性载体结合，使 之固定化，装入层析柱中。
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亲和层析的层析剂可分为3个部分: （1）载体，载体起支架作用，一般是偶联凝胶或多孔 玻璃珠。
（2）间臂，由于生物大分子的空间位阻作用，需加一
间臂，其长度具有重要作用。太长则增加了非特异性疏水
吸附作用，太短则起不到应有的作用。
（3）配基，这是亲和层析的核心物质，在分离中起特
异性吸附欲分离物的作用。配基一般分为天然配基（包括
42
亲和层析最初用于蛋白质特别是酶的 分离和精制上，后来发展到大规模应用于 酶抑制剂、抗体和干扰素等的分离精制上。 在生物化学领域，主要用于各种酶、 辅酶、激素和免疫球蛋白等生物分子的分 离分析。
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应用
1）纯化大分子物质
如：纯化糖蛋白用凝集素（能可逆性地结合碳
水化合物的蛋白质），Lectin-Sepharose 4B 2) 研究酶的结构与功能：
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亲和色谱（Affinity chromatography）
载体活化、配基连接、吸附、洗脱
Steric considerations & spacer arms
Small ligand (<1,000)
Risk of steric interference with binding between matrix and target molecule
如用CNBr 作用于葡聚糖和琼脂糖的糖羟基
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2）引入连接臂（space arm） 又称手臂（spacer）
“接臂” 的目的：
克服影响配基与生物大分子的结合的空间障碍。 “接臂”的途径：
常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。
目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。
如：AH-Sepharose 4B。
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• 一般杂质的非特异性吸附与其浓度、性质、 载体材料、配基固定化的方法以及流动相 的离子强度、pH和温度等因素有关。
•
为了减小吸附操作中的非特异性吸附， 所用的缓冲液的离子强度要适当，缓冲液 的pH应使配基与目标产物及杂质的静电作 用较小。
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料液流速是影响层析速度和效果的重 要因素。 提高流速虽可加快分离速度，但会降 低柱效。此外，琼脂糖容易受压变形，压 力过大反而流速降低。
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9.3 亲和色谱介质
9.3.1 亲和配基 酶的抑制剂 A蛋白 辅酶和磷酸腺苷 过渡金属离子 抗体 凝集素 色素配基 组氨酸
肝素 （一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的
多聚体，在体内外都有抗凝血作用。）
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间隔臂
当配基的分子量较小时，将其 直接固定在载体上，会由于载 体的空间位阻，配基与生物大 分子不能发生有效的亲和吸附 作用，如图7-14a所示。 如果在配基与载体之间连接间 隔臂，可以增大配基与载体之 间的距离，使其与生物大分子 发生有效的亲和结合。
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9.5 亲和色谱的应用
9.5.5 基因重组融合蛋白的纯化
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Affinity chromatography
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Competitive elution
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9.5 亲和色谱的应用
亲和层析的优势： 专一性高，操作条件温和，过程简单。 纯化的倍数可达几千倍级。 能有效地保持生物活性物质的高级结构的 稳定性，其回收率也非常高。 对含量极少又不稳定的生物活性药物的分 离极为有效。 它是一种专门用于分离纯化生物大分子的 层析分离技术。
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手臂
1、作用：减少亲和作用空间位阻
2、连接：通过化学反应与活化基团连接 3、手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 6-氨基已酸 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH • 环氧氯丙烷 • 1，4- 丁二醇缩水甘油醚
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9.4 亲和色谱过程分析
亲和层析包括进料吸附、清洗、洗脱和介质再生几 个步骤。 吸附操作要保证吸附介质对目标产物有较高的 吸附容量，杂质的非特异性吸附要控制在尽可能低 的水平。