第四章-细胞融合及其应用

2.意义
❖ 克服物种间杂交不亲和或不能受精或胚胎早期 败育，为遗传物质广泛重组提供新途径。 如：薯番茄、番茄薯
3. 细胞融合的类型
1978年，德国科学家梅罗帕斯博士向世界宣 告，他用马铃薯与番茄相结合，得到了地上部 分结青色果实的“薯番茄”，但地下尚未结出 马铃薯的块茎。
后来，美国堪萨斯州立大学的科学家，把番茄 和马铃薯的细胞部分融合在一起，培育出了地 上结黄色果实、地下长白色薯块的“番茄薯”， 据说番茄的产量很高。
2. 融合方法
诱导融合的方法种类：
化学诱导
离子诱导融合法； 高钙-高pH法； PEG（聚乙二醇）法。
物理诱导
离心振荡 显微操作 电融合
生物法
仙台病毒法
2.1 化学法
2.1.1离子诱导融合法：
• 常用的盐类离子有硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、
氯化钙等。
• 钠离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝 聚的原生质体得质膜紧密接触，促进细胞融合。 （1970年，Power用硝酸钠使玉米和燕麦根尖细胞原生质体
PEG诱导融合原理
PEG含有醚键而具有负极性，与水、蛋白质和碳 水化合物等一些正极化基团形成氢键。当PEG分子 足够长时，可作为邻近原生质体表面之间的分子 桥而使之粘连。
PEG也能连接Ca2+等阳离子。Ca2+可在一些负 极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连;
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可 被洗脱，引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原 生质体融合;
进行了融合;1972年,Carlson也用硝酸钠作融合剂，获得第一个 烟草种间体细胞杂交植株。）
• 该方法异核体形成频率低，0.1-4%。
2.1.2 高钙-高pH法：
首先用于人和鼠的动物细胞杂交，后来引用在植 物原生质体的融合，并利用这种融合方法获得了 烟草体细胞杂种（1973年，50mmol/L钙离子、 pH值10.5）。
杂种细胞可以区分
4）利用生长特性筛选法： ➢ 利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选
择杂种细胞。 ➢ 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源
激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素， 在培养基上不需加激素。
II、动物细胞筛选方式
1、利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏 感性差异筛选杂种细胞。
❖ 创造细胞质杂种
某些农艺性状如：细胞质雄性不育、 除草剂抗性等都是由细胞质控制的。
有性杂交中雄配子携带细胞质极少， 难以产生细胞质杂种；
细胞融合的杂种细胞质能够选择某 一亲本的叶绿体，但线粒体可实现双 亲重组。
❖ 为遗传学研究提供新的手段。
如：核质相互关系、基因作用与定位、肿瘤的 发生等。
二、基本原理 ❖细胞融合的基本原理是什么？ ❖简述细胞融合的大致过程。
第二节 细胞融合技术应用
一、动物细胞融合和单克隆抗体制备 （一）动物细胞融合研究简史 （二）动物细胞融合技术主要应用 （三）单克隆抗体制备 二、植物原生质体融合培育新品种 （一）研究简史 （二）融合程序 三、微生物原生质体融合构建新菌株
一、动物细胞融合和单克隆抗体制备
（一）动物细胞融合研究简史 生物界自发细胞融合： 1838年，Muller发现分散性肿瘤细胞能自发融 合产生多核细胞。后来人们发现了多种体内细 胞合并现象。
培养，而亲本细胞均会死亡。
3、温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养 细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏 感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此 筛选杂种细胞。
亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右 生长。
亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。
杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生 长。
电融合时，加入少量CaCl2,可维持电导率，保护细胞；交 变电流强弱、处理时间长短及电脉冲的大小影响融合率。
添加促融合剂，可提高融合率。
3.2 动物细胞融合 亲本细胞表面性质影响大：表面覆盖绒毛且不规则的较容
易；表面光滑的不易融合； 细胞种类不同，融合效果不同：腹水癌细胞易融合，淋巴
细胞或血球细胞不易融合。 融合时温度和运动状态：仙台病毒诱导腹水癌细胞融合，
亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长
2、营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营 养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。 利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂 种细胞。
亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上
➢ 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上 不能超过50个世代；
➢ 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生 长；
➢ 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长， 而亲本和其它细胞死亡。
3）利用物理特性筛选法： ➢ 根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电
泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。 如： ➢ 亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记 ➢ 亲本2：碱性蕊香红荧光素标记 ➢ 在荧光显微镜下，亲本1为绿色，亲本2为红色，
第一节 细胞融合概述
什么是细胞融合？ 为什么要进行细胞融合？ 简述细胞融合的研究历史。
一、细胞融合的概念和意义
1.概念 细胞融合（cell fusion) 又称体细胞杂交 （somatic hybridization)，即在自然条件下 或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个 或两个以上的细胞合并形成一个细胞或使之分化 再生、形成新物种或新品种的技术。
高Ca2+高pH清洗增加了质膜的流动性，大大提 高了融合频率。
蟾蜍血细胞融合实验
2.2 物理诱导融合
• 物理诱导融合包括离心振荡、显微操作和电 融合
显微操作：显微操作将大熊猫体细胞注入去 核兔卵母细胞卵周隙中。
•电融合
原理：细胞处于不均一的交变电场，细胞极化
成为偶极子，排列成串珠状，再施加瞬间强脉冲 使质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合。
缺点: 仙台病毒不稳定，制备过程繁琐，易 失活，容易对细胞产生干扰；
3. 影响融合的因素
3.1植物细胞融合： 植物原生质体融合无种属特异性，融合效率只与外界条件 有关。
PEG诱导关键是处理时间，过长损伤原生质体，过短不融 合；PEG的规格和纯度，分子量多为4000－6000。
电融合，与原生质体密度有关，最适密度为2×104－8 × 104
１９５７年，日本大阪大学微生物研究所的岗田善雄 首次发现仙台病毒能使相邻细胞粘在一起，并使膜产 生一些断裂，两个细胞核会通过裂口融合在一起；
不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血 性。在鸡胚、各种动物肾脏培养细胞的细胞质中增殖。
病毒囊膜上有许多刺突（spike)，刺突上都是一 个单价血细胞凝集素；
2、基因转移与性状表达
由于染色体的部分丢失，常常使某个亲本的部 分或个别基因与另一亲本的染色体发生整合， 其结果是实现了亲本间的基因转移。基因转移 通常是在后代中某些性状得以表达，有时由于 基因的重组也可能产生双亲均没有的新性状。
3、体细胞杂种遗传上的不稳定性
体细胞杂种后代在遗传上常常不稳定，这可能涉 及到多方面的因素，如亲缘关系的远近、培养过 程中的染色体变异、细胞核、细胞质遗传物质的 重组等。
➢ 2000年10月，澳大利亚和美国 的两家生物公司把人体细胞和猪 细胞融合在一起，并向欧洲专利 局申请专利。环保人士指责这些 科学家是“弗兰肯斯坦式的科学 家” ---创造怪物的人最终受到 怪物的伤害 ，所造出的是令人恐 惧的“半人半猪怪物”。
➢ 目前，融合技术已迅速发展到动 物间、动植物间及人体细胞和动 植物细胞间。
• 在融合仪控制下的融合小室内进行。各种指标 都可精细调节控制，融合效率高（zimmermann1981,
融合频率达60%） 。
• 优点：融合效率高、操作简单、重复性强、无 毒性、可在显微镜下直接观察细胞融合过程。
2.3 生物法—病毒法
疱疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒
仙台病毒：亦称HVJ（Hemagglutinating virus of Jap－an的缩写），乙型副流感病毒。属副黏液 病毒属，RNA病毒。（M．Kuroya），（1953）。
体外培养细胞融合：
❖ 1958年，日本人冈田发现仙台病毒具有诱发艾 氏癌细胞相互融合的效应。
❖ 1365年，冈田等利用仙台病毒诱导两种不同动 物细胞融合，产生第一个种间异核体。
❖ 1978年，瑞士科学家和美国科学家将人的纤维 肉瘤细胞与小鼠的畸胎瘤细胞融合，获得含人 体染色体的小鼠。
人畜细胞融合引发激烈争论
狮头、羊身、蛇 尾的吐火怪兽
（二）动物细胞融合技术主要应用 1、染色体的基因定位
植 物 细 胞 融 合 过 程
人 造 小 鼠 培 育 过 程 示
意
图
三、细胞融合方法 ❖ 细胞融合方法有哪些பைடு நூலகம்试述其原理。
1. 融合材料
1.1植物或微生物原生质体的制备
1.2动物单个细胞的获得 首先获得动物组织，然后经消化液消化获得单 细胞。常用消化液：胰蛋白酶适于细胞间质较 少的软组织；胶原酶适于消化胶原和细胞间质 丰富的纤维组织、癌组织等。
37度、振荡。 需氧量大，缺氧常不融合。 需要Ca 2+，最适浓度为0.1mol/L。 最适pH值为7.4－7.8。
四、杂种细胞的筛选和鉴定
（一）体细胞杂种的遗传特性 1、细胞分裂与染色体丢失
如果细胞分裂而核不发生融合，在以后的发育 过程中就会有两种结果，一是细胞分裂几次以 后即停止生长从而导致死亡；二是在发育过程 中某一亲本的细胞核部分或全部丢失。如果这 样就会产生几种情况：A细胞＋B细胞质；A细 胞＋B细胞质和部分染色体或基因。
（二）融合细胞的筛选
I、植物细胞筛选方式 1、遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能
正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种 细胞表现正常。 如：
亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融 合细胞长成植株呈绿色，并能成长。
（2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对 抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择 杂种细胞。
钙离子浓度决定着细胞膜的稳定性和可塑性，影响原生质体膜的结 合；高pH值能改变质膜的表面电荷，有利于细胞融合。
该方法高pH值对原生质体有害。 异种融合效率达10-35%(高国楠,1974)
2.1.3 PEG（聚乙二醇）法
• PEG是一种多聚化合物，分子量在200－ 20000之间，毒性小易操作。 • 用PEG法与高钙-高pH法结合:制备两亲本的 原生质体，并至合适密度（105个/ml）；将 PEG溶液加入，并孵育一段时间（24℃或37℃， 10－20分钟）；缓缓加入高钙高pH溶液15分钟； 洗涤，收集细胞计算融合率。 • 融合促进剂:伴刀豆球蛋白A，二甲基亚砜和 链胃蛋白酶等，提高细胞的融合频率。
一动物细胞融合和单克隆抗体制备一动物细胞融合研究简史二动物细胞融合技术主要应用三单克隆抗体制备二植物原生质体融合培育新品种一研究简史二融合程序三微生物原生质体融合构建新菌株一动物细胞融合和单克隆抗体制备一动物细胞融合研究简史生物界自发细胞融合
第四章 细胞融合及其应用
第一节 细胞融合概述 第二节 细胞融合技术应用
杂种细胞（体细胞杂种）：来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞 核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此 又叫做体细胞杂种。
2.基本原理 细胞质膜的特性 细胞膜融合的原理
质膜靠近， 质膜局部区域紧密粘连，磷 脂分子重排，形成细胞桥； 胞质融合， 细胞核融合。
3.细胞融合大致过程
刺突还有唾液酸苷酶的活性，水解寡糖链上的唾 液酸残基，攻击细胞表面。
紫外线 仙台病毒
丧失感染活性 （不感染细胞）
保留融合活性 （诱导细胞融合）
程序：
紫外线将病毒灭活，稀 释到一定浓度，加入到 细胞悬液中，离心，诱 导细胞融合。
优点： 融合效率高，适合于各种动物细胞； 仙台病毒在鸡胚中大量繁殖，容易培养。
1.相关概念：
合胞体(synkaryon)：在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞 的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的 细胞结构称为合胞体。
同核体（homokaryon，同核融合细胞）：基因型相同的细胞融合成 的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。
异核体（heterokaryon,异核融合细胞）：来自不同基因型的细胞融 合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。