卵黄抗体的提纯及应用

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Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃ葡萄球菌蛋白 Ｇ， 故使用 ＩｇＹ 可 以避免由抗哺乳动物 ＩｇＧ 抗体引起的干扰作用。用 ＩｇＹ 作 为 免 疫 学 检 测 工 具 ， 测 定 循 环 复 合 物 、类 风 湿因子和补体等， 可减少假阳性结果。 ２．１．２ 免疫治疗 因鸡抗体耐酸、耐热且性能稳 定， 可经口服用于预防或治疗年幼动物或人类的肠 道传染病， 如婴儿防病食品、龋齿预防、新生乳猪致 死 性 大 肠 杆 菌 感 染 的 预 防 以 及 鱼 病 治 疗 等 。特 别 是 抗生素或其它药物的使用 存 在 问 题 时 ， ＩｇＹ 成 为 首 选。在非典流行期间， 鸡卵黄抗体还被研制用于抑 制 ＳＡＲＳ 病毒。 ２．２ 取代哺乳动物抗体 禽类是潜在的抗体提供 者， 其免疫应答类似于哺乳动物。禽类可以作为任 何 抗 体 的 供 体 动 物 。如 ① 抗 人 肌 原 蛋 白 Ⅰ 的 抗 体 作 为试剂用于自动免疫诊断系统中； ②过氧化物酶标 记的抗马免疫球蛋白的 ＩｇＹ 已制成试剂盒， 用于马 性 病 的 诊 断 中 ； ③抗 新 城 疫 ＩｇＹ、抗 传 支 ＩｇＹ、抗 传 染性法氏囊病 ＩｇＹ 经荧光素异硫氰酸盐标记后， 用 荧光抗体技术诊断这些禽类病毒病。 ２．３ 在 兽 医 临 床 上 的 应 用 从 高 免 动 物 （ 如 兔 、 鸡 、牛 、羊 等 ） 的 血 清 或 初 乳 中 分 离 ＩｇＧ， 在 被 动 免 疫 治 疗 中 有 很 重 要 的 意 义 和 价 值 。但 这 些 来 源 提 供 的 ＩｇＧ 产 量 低 ， 成 本 高 ， 通 常 只 能 局 限 于 实 验 室 的 免疫学诊断和基础研究。近年来， 国内外学者就卵 黄抗体的研究和开发作了许多工作， 证明免疫鸡的 鸡蛋是提供特异性 ＩｇＧ 的最方便、最廉价的来源。 目前， 高免 ＩｇＹ 已广泛地应用于鸡传染性法氏囊病 （ ＩＢＤ） 、新城疫（ ＮＤ） 、鸭肝炎、小鹅瘟、犊牛腹泻、仔 猪 大 肠 杆 菌 病 、羔 羊 和 小 白 鼠 轮 状 病 毒 腹 泻 等 动 物 传染病的防治， 并取得了显著的效果。 ２．４ 在人类保健上的应用 大量研究结果显示， 鸡 ＩｇＹ 对病原体感染的防御无动物的种属差异， 故应 用鸡高免 ＩｇＹ 防治婴幼儿疾病是完全可行的。随着 ＳＰＦ 鸡群的使用， 用卵黄研制安全可靠的人用抗病 （ 尤其是肠道疾病） 生物制品必将获得广泛的应用。 ２．５ 用作饲料添加剂 用抗特定抗原并可直接饲 喂的鸡卵黄抗体作为替代抗生素的新型饲料添加 剂 正 在 引 起 人 们 的 关 注 。鸡 卵 黄 抗 体 是 产 蛋 母 鸡 被 免 疫 １５ｄ 左 右 产 生 的 ＩｇＹ， 且 较 快 达 到 高 峰 ， 可 产 生较长时间的免疫应答， 效价可维持数月至一年以 上， 其浓度活性及功能可通过对母鸡进行高免而加 以调节。鸡抗体可取代抗生素用作生长促进剂， 且
有利于规模化生产； 禽类与以人为代表的哺乳动物 高， 但适用于大量生产， 而且价值便宜， 特别适用于
收稿日期 ： ２００７－ ０２－ ２０
纯化流程的前期的最终的浓缩。
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作用随着锌添加水平的上升而增强。对饲料转化比 距； 反之， 体内某种微量元素过量时， 相对应的元素
蛋方便， 无须抽取动物血液， 无损伤， 符合现代动物 基团暴露， 蛋白质的可溶性随着盐浓度的增加呈对
保护规则； 产生有效的抗体反应所需抗原量小； 在 数下降， 蛋白质很容易沉淀析出。采用盐析技术提取
国内， 鸡是率先实现 ＳＰＦ 化和产业化的实验动物， 和浓缩 ＩｇＹ 是一个简单温和的方法。虽然分离率不
在差异。
业上具有明显的效果， 是一种具有广阔发展前景的
鸡体内某种微量元素的缺乏、适当和过量时， 营养性饲料添加剂。应该加强研制开发工作， 改进
对相应元素的利用效率不同。体内某种微量元素缺 生产工艺， 降低生产成本， 提供质优价廉产品， 探讨
乏时， 相对应的微量元素的利用率会升高， 从而缩 理想添加水平和影响因素， 加强推广应用工作， 促
１８０ｋＤａ， 含两个亚单位， 即 ６７～７０ｋＤａ 的重链和 ２２～ 备。值得一提的是， 要纯化卵黄抗体， 单采用一种方
３０ｋＤａ 的轻链［２］。卵黄中 ＩｇＧ 的含量等于甚至要高 法往往是不够的， 常需将多种方法综合应用。
于母鸡血清中的 ＩｇＧ。卵黄作为特异性抗体的来源 １．１ 方法
有许多优点， 如： 母鸡易于饲养， 费用不高， 收集鸡 １．１．１ 盐析法 盐析破坏蛋白质的水化层， 使疏水
母鸡易于饲养费用不高收集鸡蛋方便无须抽取动物血液无损伤符合现代动物保护规则产生有效的抗体反应所需抗原量小在国内鸡是率先实现ab化和产业化的实验动物有利于规模化生产禽类与以人为代表的哺乳动物亲缘关系较远有利于疾病控制用鸡生产人用的免疫球蛋白不会将导致人类疾病的病原微生物引入到病人的体内可以解决治疗上的后顾之忧提取与纯化近二十几年来已建立了许多较为高效而经济的方法如盐析乙醇和聚乙二醇沉淀法疏水层析法辛酸沉淀法cd法等产量约为每毫升卵黄提取ee1纯度ff此外其它应用于多克隆抗血清制备的方法也皆可用于的制备值得一提的是要纯化卵黄抗体单采用一种方法往往是不够的常需将多种方法综合应用方法盐析法盐析破坏蛋白质的水化层使疏水基团暴露蛋白质的可溶性随着盐浓度的增加呈对数下降蛋白质很容易沉淀析出采用盐析技术提取和浓缩是一个简单温和的方法虽然分离率不高但适用于大量生产而且价值便宜特别适用于纯化流程的前期的最终的浓缩ggg中图分类号
关键词： 卵黄抗体； 提纯； 应用
中图分类号： Ｓ８５２．３１
文献标识码： Ａ
文章编号： １６７３－ １０８５（ ２００７） ０３－ ００４１－ ０３
鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）是极具开发潜力的抗体资源。 亲 缘 关 系 较 远 ， 有 利 于 疾 病 控 制 ， 用 鸡 生 产 人 用 的
自从 １９８３ 年， Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ 首次报道鸡蛋中存在 抗 体 免疫球蛋白， 不会将导致人类疾病的病原微生物引
Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
综述
卵 黄 抗 体的提纯及应用
朱晓东 １， 陈大健 ２， 郭永刚 ３， 郝智慧 ２， 周颖斌 ２ （ １．江苏京海禽业集团有限公司， 江苏 南通 ２２６１０３； ２．青岛六和药业有限公司；
３．郑州牧业工程高等专科学校）
摘 要： 卵黄抗体因具有价格便宜、制备方便等其它抗体无可比拟的优点， 而成为 当 今 生 物 科 学 领域研究的一个热点。卵黄抗体已被越来越广泛地应用于许多疾病， 尤其是家禽传染病的防治， 并获 得了显著的效果。此外， 它还被应用于免疫学技术和疾病的监测等方面， 显示出多方面的应用价值。本 文对其提纯方法及应用作一综述。
间的结合， 使用这类洗脱方法要特别注意防止蛋白 质变性， 尽快中和或除去变型剂。总之， 亲和层析可 获得生物活性特异的高纯 度 ＩｇＹ， 甚 至 可 从 复 杂 的 混合物中一步提纯目的 ＩｇＹ［１０］。 １．２ 各种综合提取方法的比较 卵黄抗体的纯化 实 际 是 各 种 方 法 的 综 合 应 用 。各 种 综 合 提 取 方 法 在 提 取 率 、脂 类 残 留 、纯 度 、安 全 性 、经 济 、是 否 适 用 于 工业化生产等方面都各具优缺点。ＰＥＧ 法、盐析法 产率低的原因是沉淀抗体和其它杂蛋白时， 抗体损 失较多， 而采用水溶法， 使抗体尽可能多留在水相 中， 去除沉淀后， 再用盐析等其它办法纯化浓缩， 最 终可得到高纯度的 ＩｇＹ。各种方法对 ＩｇＹ 生物活性 的 影 响 是 另 一 个 重 要 的 指 标 。但 研 究 者 所 采 用 的 测 定 ＩｇＹ 活性的方法不同， 数据间的差异较大。Ａｋｉｔａ 用 免 疫 扩 散 法 （ ＲＩＤ 法 ） 测 定 ＩｇＹ 活 性 ， 结 果 表 明 Ｘａｎ 法对 ＩｇＹ 的活性稍有影响外， 其它方法对其影 响不大 。 在 ＮａＣｌ 浓 度 大 于 １．５Ｍ 时 ， ＩｇＹ 会 发 生 聚 合， 从而影响抗体的活性， 故在提纯工艺中， 尽量避 免高浓度 ＮａＣｌ。海藻酸钠是一种药用缓释剂， 所以 在 制 备 注 射 用 卵 黄 抗 体 时 ， 若 用 ＳＤ 法 ， 则 会 诱 导 机体产生免疫反应， 影响应用效果。采用有机溶剂 抽提法的弊病是绝大多数有机溶剂存在残留， 从而 产生安全性的问题。对于 ＰＥＧ 是否具有毒性， 目前 不详。还有许多方法的获得率很高， 如硫酸葡萄聚 糖法， 但其成本较高， 不适合工业化生产。Ａｋｉｔａ 等 在 ＰＥＧ、ＤＳ、ＳＤ 或 乙 醇 沉 淀 等 方 法 基 础 上 建 立 了 水稀释法。即以 ９ 份水稀释 １ 份卵黄， 离心去除颗 粒， 再用硫酸盐沉淀法浓缩， 并经超滤或乙醇沉淀 或盐沉淀进一步纯化、浓缩， 再经凝胶过滤提纯， 产 量 达 ９．８ｍｇＩｇＹ／ｍｌ 卵 黄 ， 纯 度 ９４％ 。 此 法 中 若 以 ＰＥＧ 代替硫酸盐沉淀， 可进一步提高产量。 ２ 应用
以来， 人们对卵黄抗体（ ＩｇＹ） 的研究越来越多， 认识 入到病人的体内， 可以解决治疗上的后顾之忧。
越来越深入， 应用亦日益广泛。母鸡受免疫刺激后 １ 提取与纯化
产生免疫反应， 在输卵管内卵黄成熟期， 血液中
近二十几年来， 已建立了许多较为高效而经济
ＩｇＧ 可被选择性地转移至卵黄中， 并 且 成 为 卵 黄 中 的方法， 如盐析、乙醇和聚乙二醇沉淀法、疏水层析
而 言 ， 添 加 蛋 氨 酸 锌 ５０ｍｇ／ｋｇ 时 达 到 最 佳 ； 添 加 效 的利用率会下降， 可能更容易比较有机微量元素与
果 在 饲 养 前 、中 期 优 于 后 期 ， 这 可 能 是 由 于 肉 鸡 处 无机盐之间的差距。
在不同生长阶段， 机体对锌的需要量和调节能力存
综上所述， 微量元素氨基酸螯合物在肉鸡养殖
小了有机微量元素与相应无机微量元素之间的差 进养鸡业的健康迅速发展。
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综述
家禽科学 ２００７．３
１．１．２ 乙醇和聚乙二醇沉淀法 乙醇与水有很强 的结合力。在蛋白质溶液中加入乙醇， 可以破坏水 化层暴露疏水性氨基酸残基， 引起蛋白质沉淀， 特 别在等电点条件下， 沉淀更快速完全， 是实验室制 备 ＩｇＹ 的常用方法［３］ 。聚乙二醇（ ＰＥＧ） 是非离子型 水溶性聚合物， 有很强的亲水性， 即使浓度很高也 不会引起蛋白质变性， 沉淀蛋白质的时间比硫酸铵 或乙醇都短， 不影响离心处理， 并有促进蛋白质结 晶的作用， 用 ＰＥＧ６０００ 沉淀卵黄的抗体蛋白， １４％ 的 ＰＥＧ 可 使 ＩｇＹ 沉 淀［４］。 此 外 ， 还 有 硫 酸 葡 聚 糖 法 （ ＤＳ 法 ） ［５］、海 藻 酸 钠 法 （ ＳＤ 法 ） ［６］及 黄 胶 原 法 （ Ｘａｎ 法） ［５］ 等方法。因这些方法的原理与聚乙二醇相似 （ 都可以破坏水化层） ， 这里就不在赘述。 １．１．３ 疏水层析法 疏水层析法是新近发展的纯 化 卵 黄 抗 体 的 层 析 技 术 。将 疏 水 的 烃 基 连 接 到 亲 水 多孔的层析凝胶上， 在高盐浓度下， 蛋白质分子中 暴露的疏水基因和凝胶上的烃基相互作用， 吸附在 柱上。而当溶液中盐浓度降低， 或改变 ｐＨ 值使之 偏离等电点， 或采用加乙醇、甘油、聚乙二醇等降低 洗脱液极性， 降低温度， 加入去污剂等干扰结合的 办法， 可将蛋白质洗脱［７， ８］。所以疏水层析是在高盐 条件下使蛋白结合上柱， 非常适合于盐析后的卵黄 抗体进一步分离纯化。 １．１．４ 辛 酸 沉 淀 法 （ＣＡ 法）［９］ 与 前 三 种 方 法 都 利 用抗体蛋白的亲水和疏水性不同， 该法是利用抗体 蛋白的化学性质进行分离和纯化。在低离子强度、 ｐＨ４．２～４．５ 的 酸 性 条 件 下 ， 辛 酸 （ Ｃａｐｒｙｌｉｃ Ａｃｉｄ） 可 与绝大多数的卵黄蛋白反应， 形成不可逆的沉淀， 唯有 ＩｇＹ 类抗体蛋白不发生反应， 仍留在上清中， 离心除去沉淀， 将上清的 ｐＨ 调整到 ７．０ 左 右 ， 用 硫酸铵使 ＩｇＹ 析 出 ， 可 得 到 纯 度 ８０％以 上 的 ＩｇＹ， 该法经济、简便、快速， 不损害抗体活性， 回收率高。 １．１．５ 亲和层析法 亲和层析法是一种利用抗体 蛋 白 的 生 物 学 活 性 而 进 行 分 离 纯 化 的 方 法 。它 是 目 前纯化抗体蛋白质最有效的方法， 又称免疫吸附。 将抗原以稳定的共价键连接在层析填料上形成固 相化配体， 在有利于配体结合的条件下加入样品， 液相中相应的 ＩｇＹ 便与固相抗原结合， 吸附在柱子 上。用缓冲液洗去杂质后， 改用解析液洗脱。解析液 可使用较剧烈的非特异蛋白变型缓冲液， 如 ｐＨ２～３ 的 甘 氨 酸 缓 冲 液 、４ ～８Ｍ 尿 素 、６Ｍ 盐 酸 胍 、３Ｍ ＮａＳＣＮ、３．５Ｍ ＭｇＣｌ２ 等， 使蛋白构型改变破坏配体
唯 一 的 免 疫 球 蛋 白 类［１］， 这 种 由 血 液 转 移 入 卵 黄 液 法、辛酸沉淀法（ ＣＡ 法） 等。产量约为每毫升卵黄提
的 ＩｇＧ 类 抗 体 即 为 卵 黄 抗 体 （ Ｙｏｌｋ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕ－ 取 ＩｇＹ ５～７１５ｍｇ， 纯度 ８７％～８９％。此外， 其它应用
ｌｉｎ， ＩｇＹ） 。 它 是 一 种 ７Ｓ 免 疫 球 蛋 白 ， 分 子 量 约 为 于 多 克 隆 抗 血 清 制 备 的 方 法 也 皆 可 用 于 ＩｇＹ 的 制
ＩｇＹ 的应用与其生物学特性密切相关。 ２．１ 在医学方面的应用 ２．１．１ 免疫诊断 与哺乳 动 物 抗 体 相 比 ， ＩｇＹ 的 一 个 优 点 是 不 激 活 补 体 系 统 。补 体 系 统 激 活 后 会 减 少 抗原与抗体的结合， 从而导致假阴性结果的产生。 此外， 在免疫学试验中， 抗原－ 抗体复合物能激活 Ｆｃ 受体， 引起蛋白表面发生改变， 进而可能对试验 结果产生干扰作用。由于 ＩｇＹ 不与人血清中抗哺乳 动物抗体的抗体反应 ， 如类风湿 因 子 和 人 的 抗 ＩｇＧ 抗体； 同时 ＩｇＹ 也不能与人或细菌 Ｆｃ 受体结合， 如