产紫杉醇内生真菌的初步筛选

产紫杉醇内生真菌的初步筛选
严铸云，郭晓恒，罗静，曾庆秋
成都中医药大学药学院中药材标准化实验室，四川成都 (610075）
E-mail：yancdtcm@
摘要：目的：获得产紫杉醇的内生真菌。

方法：采用平板稀释法分离，经过发酵、萃取，产物经TLC及HPLC鉴别。

结果：发现3株含有紫杉醇或其结构类似物。

结论：从四川省采得的中国红豆杉（Taxus chinensis）内分离得到77株真菌，经过初步筛选发现三株内生菌。

经过初步鉴定分别为小月孢属(Selenosporella Arnaud)、曲霉属(Aspergillus Link)和木霉属(Trichoderma Pers)菌。

特别是曲霉属的米曲霉（Aspergillus oryzae）产量约为50μg/L，值得进一步研究。

关键词:紫杉醇；内生真菌；发酵；ＨＰＬC
紫杉醇（Pacitaxel 商品名Taxel）是继阿霉素、顺铂之后最有前途的抗癌药物，它是以A，B，C和D四个环为核心骨架组成的二萜类化合物，是一种高效的细胞毒素。

1979年，S. B.Horwitl等人报道了紫杉醇的作用机理，认为它是同细胞中的微管蛋白结合并将其稳定和冻结，以阻止微管蛋白解聚的方式使癌细胞停止分裂，直至死亡。

目前紫杉醇主要来源于红豆杉植物（Taxus）的皮，其含量仅为0.01～0.05%。

因过度的采伐，紫杉的来源日趋紧张，已被国家列为保护植物。

寻求紫杉醇或其替代品的新资源已成为迫切的任务。

根据报道资料蒙大拿州立大学植物病理学家 Strobel 和化学家 Stierle 等在1993年首次报道了从太平洋红豆杉树上分离出来一种可产生紫杉醇的内生真菌，这种真菌被命名为安得列亚菌（Taxomyces andreanae），其紫杉醇产量可达24~50ng/L[1]。

这一发现具有重大的科学意义和潜在的商业价值，为人们展示了一个可生产紫杉醇的新途径。

笔者从中国红豆杉获得的77株内生真菌中，通过对内生真菌的分离、筛选和发酵条件等方面的研究，对微生物发酵法生产紫杉醇进行了探索，筛选到产紫杉醇的真菌，现报道如下：
1.材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源：从采自四川省的中国红豆杉（Taxus chinensis）中内分离得到的77株内生真菌。

1.1.2 培养基：真菌活化培养基：马铃薯培养基（PDA培养基）；发酵培养基：PDA液体培养基
1.1.3 对照品：紫杉醇（Paclitaxel）中国药品生物制品检定所（批号：1534-200001）
1.1.4 薄层色谱分析：
萃取液：乙酸乙酯；
层析板：硅胶G板(薄层层析用硅胶青岛海洋化工厂生产)
展开剂：二氯甲烷:正己烷:甲醇:三乙胺（4.5:3.4:0.1:1.0）和三氯甲烷:乙腈:甲醇（9:1:05）显色剂：5%香草醛浓硫酸溶液。

1.1.5 HPLC分析：日本岛津SHIMADZU高效液相色谱仪，LC-10A泵，SPD-10A检测器，N2000色谱工作站，Diamonsil C18柱（5μ 4.6×255mm）。

流动相：乙腈:水=1:1，流速：1ml/min，检测波长：227nm。

1.2 方法
1.2.1 初筛方法
将各菌株分别接种于100ml P瓶的PDB中摇床培养（28℃，120r/min，5～7d），随后将培养液连同菌丝一起冰冻后再充分破碎，用萃取液等体积萃取两次后，将有机相于45℃条件下减压蒸发浓缩、蒸干，残渣用约0.5ml溶解后转入EP管中，4000r/min离心，取上清液，待用。

初筛结果如图1：
图1 部分菌株代谢液的紫杉醇类物质TLC检测结果
6、14 为紫杉醇对照品，其他均为样品
1.2.2 复筛方法
将经TLC分析后有与紫杉醇对照品相同迁移率斑点的菌号扩大至500ml PDB培养液中，以同样条件培养5～7d，发酵物也经冰冻、破碎、萃取、减压蒸发、浓缩等过程，所得产物称量计重后用于高效液相色谱（HPLC）分析，以进行定性和定量分析。

TLC鉴定如图2，HPLC 鉴定如图3：
图3复筛部分菌株的紫杉醇类物质HPLC检测结果图2 复筛部分菌株的紫杉醇类物质TLC检测结果
1.RS-1
2.RS-4
3.SPH-4
4.SPH-2
5.紫杉醇对
照品
2.菌种的鉴定
2.1 鉴定培养基：查氏培养基, 查氏酵母膏琼脂，麦芽汁琼脂[2]。

2.2 用插片法制片观察如下图4。

RS—4(1) RS—4(2)
RS—4(3) RS—4(4)
图4 复筛部分菌株的紫杉醇类物质TLC检测结果
经初步鉴定RS-4为木霉属真菌。

木霉属(Trichoderma Pers),分生孢子梗无色，许多分枝，不是轮枝状，小梗单生或成群；分生孢子（梗孢子）无色，单孢，卵圆形，着生成小的顶生的簇，通常由于它生长迅速和分生孢子的绿斑或垫而易识别。

SPH-4（1） SPH-4（2）
SPH—4（3）
经初步鉴定SPH-4为曲霉属真菌米
曲霉原变种(Aspergillus oryzae)，曲霉属
(Aspergillus Link),分生孢子梗直立，简单，
顶端球形或棍棒形膨大，顶部着生小梗或
自整个表面放射；分生孢子（梗孢子）单
孢，球形，成团时带有各种颜色，成干燥
向基的链。

3. 结论与讨论
1994年，邱德有等从云南红豆杉（T.yunnanensis ）树皮中分离出了一种内生真菌YEI ，但生物合成量低[3]；1996 年，Strobel 等从西藏红豆杉（T.wallachiana ）中分离到一株产生紫杉醇的 内生真菌小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora ），这种真菌可以产生紫杉醇的量为50μg/L [4] ；此后，又分离到尼泊尔盘端角菌（Seimatoantlerium nepalense ）,其真菌产紫杉醇的量为62~80ng/L [5]；2000年，Wang 等从南方红豆杉（T.mairei ）中分离到一种可以产生紫杉醇的内生真菌瘤座菌属（Tubercularia sp.），其产量为185.4μg/L [6]。

周东坡等人从东北红豆杉 (Taxus cuspidata) 中分离到的可产生紫杉醇的内生真菌树状多节孢（Nodulisporium sylviforme) [7]，且是我国的新记录属，新纪录种[8]，培养产生的紫杉醇量为51.06~125.7μg/L[7]。

后经几年来的菌种选育和发酵工艺条件研究，现紫杉醇产量达448.52 μg/L （摇瓶装量为150ml/500ml ）。

树状多节孢HQD33（Nodulisporium sylviforme) 内生真菌融合子TPF-1摇瓶发酵工艺条件的 条件下，2.8L 和10L 罐发酵液中紫杉醇的含量达到406.95和395.12μg/L （平均值）[9]。

和组织培养、基因工程等相比较，真菌培养条件简单、技术成熟，容易扩大化，一旦菌种的紫杉醇含量有所提高，就很快会成为一条切实可行的解决紫杉醇药源危机的途径。

本文所分得的菌株多集中于曲霉属，经过初步发酵后，经TLC 初步鉴定，根据紫杉醇对照品斑点颜色及Rf 位置确定再筛菌株，因野生菌株紫杉醇含量较低，很难看到有明显的斑点。

又因为初筛菌株较多，发酵量限制，做到不漏筛很困难。

分得的三株菌中曲霉属的米
曲霉原变种（Aspergillus oryzae）产量约有50μg/L，距离工业化生产还有相当大的距离，但容易培养，相信经过育种和发酵条件的优化后，应该成为较有潜力的菌株。

参考文献
[1] A.Stierle, G.A Strobel, D.Sterile．Taxol and taxae ProductionbyTaxomycesandreaa[J] ．anendophticfungus of Pacific yew.Science, 1993,260：214-216
[2] 齐祖同主编．中国真菌志(第五卷)曲霉属及其相关有性型[M] ，北京：科学出版社，1997，177
[3] 邱德有，黄美娟，方晓华，等．一种云南红豆杉内生菌的分离[J]．真菌学报，1994，13(4)：314-316
[4] Strobel G A ,Yang X S ,Sears J,et,al ．Taxol form Pestalotiopsis microspora .an endophytic fungus of Taxuuswallachiana[J] ．Microbiology，1996，142：435-440
[5] Bashyal B ,Li J Y ,Strobel G A ,et al．Seimatoantlerium enpalense ，an endophytic taxol producing coelomycete form Hima layan yew(Taxus wallachiana) [J]．Mycotaxon ，1999，LXXⅡ：33-42
[6] Wang J W,Li G L,Lu H Y,et al．Taxol from Tubercularia sp.Strain TF5.an endophytic funji of Taxus mairei[J]．FEMS Microbiology Letters， 2000，193：249-253
[7] 周东坡，平文祥，孙剑秋等．紫杉醇产生菌分离的研究[J]．微生物杂志， 2001，21(1)：18
[8] 周东坡，孙剑秋，于寒颖．中国-新纪录属-多节孢属[J]．菌物系统，2001， 20(2)：277
[9] 刘晓兰，周东坡，孙剑秋，平文祥，等．树状多节孢发酵生产紫杉醇工艺条件的初步研究[J]．菌物系统， 2002 ，21(2)：24
Preliminary screening of Endophytic in Taxus Producing
Taxel
Yan zhuyun，Guo xiaoheng，Luo Jing，Zeng qingqiu Chengdu Univercity of TCM Chinese Traditional Medicine Standerdization Lab Sichuan
Chengdu (610075)
Abstract
Object To get fungil which pruduce taxel. Methods Adopt the flat plate dilution separated method ,after ferment,extraction was detected by TLC and HPLC. Result Found3 fungi which produce paclitaxel or its imitation. Conclusion A totle of 77 endophytic fungi were isolated from stems and roots of Taxus chinensis in Dayi,Sichuan province.Paclitaxel or its imitation were found in its extracellular fluid idtificated by TLC and HPLC after ferment,extraction.The 3 fungal belong to Selenosporella Arnaud、 Aspergillus Link and Trichoderma Pers. The Pacitaxel production of Aspergillus oryzae, Aspergillus Link,is about 50μg/L.
Keywords : Taxol; Endophytic; Ferment; HPLC。