毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝药材中核苷类成分
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质谱 条 件： 0. 3% 甲 酸-75% 甲 醇 水 溶 液 为 鞘 液，流速为 3 μL / min； ESI-MS 正电检测模式，扫描 范围 m / z 50 ～ 350。毛细管电压为 4 500 V。雾化
第4 期
杨丰庆等： 毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝ห้องสมุดไป่ตู้材中核苷类成分
339
气体压力 1. 034 × 105 Pa，干燥气体流速 6 L / min， 干燥温度 350 ℃ 。选择离子监控模式（ SIM） 用于 定量分析。目标化合物的结构较为简单，在分析过 程中主要以质子化分子离子（ ［M + H］+ ） 形式存 在。肌苷脱去一分子糖得到其碱基（ 次黄嘌呤） 碎 片较为稳定，因此，为了确保较好的质谱响应，除了
本研究将 CE-MS 法运用于灵芝中 8 个核苷类 成分（ 图 1） 的测定，为灵芝的质量控制及药理作用 研究提供分析方法的参考。
Figure 1 Chemical structures of nucleosides and related compounds
1材料
1. 1 药材与试剂 核苷类对照品胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、次
Abstract A capillary electrophoresis- mass spectrometry （ CE-MS） method was established for the analysis of nucleosides and related compounds in Ganoderma lucidum and G． sinense． The separation was performed in a fused silica capillary （ 120 cm × 50 μm） at 25 °C，with 10% methanol in water containing 100 mmol / L formic acid as CE electrolyte，and 25 kV as the applied voltage were used for the separation． The optimum MS parameters were as follows： 75% methanol containing 0. 3% formic acid with a flow rate of 3 μL / min was selected as the sheath liquid； the flow rate and temperature of drying gas were 6 L / min and 350 ° C，respectively． ESI-MS analysis was performed in the positive mode，and the full scanning range was from m / z 50 to 350． 5-Chlorocytosine arabinoside was used as the internal standard． The results showed that eight investigated compounds had good linearity （ R2 ＞ 0. 990，except guanosine ） over the tested ranges． The average recoveries were between 95. 3% and 104. 6% ． The limit of detection （ LOD） and limit of quantitation （ LOQ） were 0. 13-9. 85 μg / mL and 0. 42-20. 83 μg / mL，respectively． The quantification results showed that the G． lucidum contained higher total amount of nucleosides than G． sinensis． The developed CE-MS method can be applied for the analysis of nucleosides and related compounds in Ganoderma and other traditional Chinese medicines. Key words CE-MS； nucleosides； Ganoderma； determination of content
338
学 报 Journal of China Pharmaceutical University
第 42 卷
灵芝为多孔菌科真菌赤芝［（ Ganoderma lucidum （ Leyss. ex Fx. ） Karst） ］或 紫 芝 ［Ganoderma sinense Zhao． Xu et zhang］的干燥子实体。具有补 气安 神、止 咳 平 喘 的 作 用，用 于 眩 晕 不 眠、心 悸 气 短、虚劳 咳 喘［1］。 目 前，多 糖、三 萜 类 及 核 苷 类 成 分被认为是其主要活性成分［2－ 3］。核苷类成分可 以通过 激 活 人 体 中 的 嘌 呤 受 体 起 到 多 种 生 理 作 用［4－ 5］。目前，用于灵芝中核苷类成分的检测方法 主要 有 薄 层 色 谱 法 （ TLC ） ［6］、高 效 液 相 色 谱 法
Agilent 3D CE 系统与 Trap XCT 质谱联用仪配 备 CE-ESI-MS sprayer kit （ G1607A） 和 CE-ESI-MS adapter kit （ G1603A） （ 美国安捷伦科技公司） ； 熔 融石英毛细管柱（ 120 cm × 50 μm，美国 Polymicro Technologies 公司） 。
肌苷之外其他成分均选择了其质子化离子进行定 量（ 见表 1） 。
在此条件下，胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、次黄 嘌呤、鸟苷、肌苷、尿嘧啶及 5-氯胞嘧啶阿拉伯糖 苷的选择离子电泳图见图 2。
Figure 2 Selected ion electropherograms of mix standards（ A） ，Ganoderma lucidum（ B） ，and Ganoderma sinense 1： Cytosine； 2： Guanine； 3： Cytidine； 4： Adenosine； 5： Hypoxanthine； 6： Guanosine； 7： Inosine； 8： Uridine. IS： 5-Chlorocytosine arabinoside
学报
Journal of China Pharmaceutical University 2011，42（ 4） ： 337 － 341
337
毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝药材中核苷类成分
杨丰庆1* ，张雪梅1，葛莉亚2，陈瑞银2
（ 1 重庆大学化学化工学院，重庆 400044； 2 新加坡南洋理工大学国立教育学院，新加坡 637616）
This study was supported by the Natural Science Foundation of Chongqing Sci-Tech Committee （ No． 2010BB5070） and the Innovative Talent Training Project，the Third Stage of“211 Project”of Chongqing University （ No． S-09103）
黄嘌呤、鸟苷、肌苷、尿嘧啶以及内标成分 5-氯胞 嘧啶阿拉伯糖苷（ 5-chlorocytosine arabinoside） 均购 自美国 Sigma 公司。甲酸（ 美国 Fisher 科技公司） ； 超纯水为 Milli-Q 水 （ 美国 Millipore 公司） 。灵芝 （ 赤芝和紫芝） 购于安徽、四川、山东及云南。 1. 2 仪 器
YANG Feng-qing1* ，ZHANG Xue-mei1 ，GE Li-ya2 ，TAN Swee Ngin2
1 College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China； 2 Natural Sciences and Science Education Academic Group，Nanyang Technological University，Singapore 637616，Singapore
关键词 毛细管电泳-质谱联用法； 核苷； 灵芝； 含量测定 中图分类号 R917 文献标识码 A 文章编号 1000 － 5048（ 2011） 04 － 0337 － 05
Determination of nucleosides and related compounds in Ganoderma by CEMS
摘 要 建立一种用于测定赤芝和紫芝中的核苷类成分的毛细管电泳-质谱联用法（ CE-MS） 。CE 条件为： 熔融石英毛 细管柱（ 120 cm × 50 μm） ，缓冲液体系 100 mmol / L 甲酸-10% 甲醇水溶液。运行电压 25 kV； 毛细管温度 25 ℃ 。MS 条件 为： 0. 3% 甲酸-75% 甲醇水溶液为鞘液，流速 3 μL / min； 干燥气体流速 6 L / min，干燥温度 350 ℃ ； 采用电喷雾离子化源 （ ESI） ，正离子模式检测，全扫描范围 m / z 50 ～ 350。以 5-氯胞嘧啶阿拉伯糖苷为内标物。结果表明，胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、 腺苷、次黄嘌呤、鸟苷、肌苷和尿嘧啶在线性范围内具有较好的线性关系（ 除鸟苷外，其他成分 R2 ＞ 0. 990） 。加样回收率在 95. 3% ～ 104. 6% 之间。各待测化合物的最低检测限（ LOD） 和最低定量限（ LOQ） 分别分布在 0. 13 ～ 9. 85 μg / mL 和 0. 42 ～ 20. 83 μg / mL 之间。测定结果显示赤芝的核苷类成分的含量上高于紫芝。CE-MS 适合用于中药中核苷类成分的分析 检测。
* 收稿日期 2011-03-07 * 通讯作者 Tel / Fax： 023 － 65106615 E-mail： ysfhqx@ hotmail． com 基金项目 重庆市科委自然科学基金资助项目（ No． 2010BB5070） ； 重庆大学 211 工程三期创新人才培养计划建设项目资助（ No． S09103）
电泳 条 件： 熔 融 石 英 毛 细 管 柱 （ 120 cm × 50 μm） ，运行缓冲液为 100 mmol / L 甲酸-10% 甲醇 水溶液。毛细管温度为 25 ℃ 。每次进样前用运行 缓冲液冲洗平衡 5 min，并且每 10 次分析之间，毛 细管用氢氧化钠溶液（ 0. 1 mol / L） 、水及运行缓冲 液分别冲洗 10 min。压力进样（ 5 kPa） ，6 s。
2方法
2. 1 对照品溶液的制备 准确称取对照品胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、
次黄嘌呤、鸟苷、肌苷和尿嘧啶适量，分别置 5 mL 量瓶中，用 水 溶 解 并 定 容，振 摇，制 得 对 照 品 储 备液。 2. 2 供试品溶液的制备
取干燥药材粉末（ 60 目筛） 1 g，精密称定，精 密加沸水 10 mL 后称重，75 ℃ 超声提取 30 min，用 水补足失重，上清液用 0. 25 μm 微孔滤膜滤过，取 续滤液，按照体积比 1 ∶ 1 加入内标溶液（ 5-氯胞嘧 啶阿拉伯糖苷，0. 14 mg / mL） ，即得供试品溶液。 2. 3 CE-MS 条件
（ HPLC） ［6－ 8］及毛细管区带电泳法 （ CZE） ［9－ 10］ / 胶 束电动毛细管色谱 （ MEKC） 。 ［11］ 另外，CE-MS 对 分离不佳甚至完全不能分开的成分进行定性定量 分析具有独特的优势，目前已被用于多种中药中活 性 成 分 的 分 析 检 测，包 括 生 物 碱、甾 体 激 素等［12－ 13］。
第4 期
杨丰庆等： 毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝ห้องสมุดไป่ตู้材中核苷类成分
339
气体压力 1. 034 × 105 Pa，干燥气体流速 6 L / min， 干燥温度 350 ℃ 。选择离子监控模式（ SIM） 用于 定量分析。目标化合物的结构较为简单，在分析过 程中主要以质子化分子离子（ ［M + H］+ ） 形式存 在。肌苷脱去一分子糖得到其碱基（ 次黄嘌呤） 碎 片较为稳定，因此，为了确保较好的质谱响应，除了
本研究将 CE-MS 法运用于灵芝中 8 个核苷类 成分（ 图 1） 的测定，为灵芝的质量控制及药理作用 研究提供分析方法的参考。
Figure 1 Chemical structures of nucleosides and related compounds
1材料
1. 1 药材与试剂 核苷类对照品胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、次
Abstract A capillary electrophoresis- mass spectrometry （ CE-MS） method was established for the analysis of nucleosides and related compounds in Ganoderma lucidum and G． sinense． The separation was performed in a fused silica capillary （ 120 cm × 50 μm） at 25 °C，with 10% methanol in water containing 100 mmol / L formic acid as CE electrolyte，and 25 kV as the applied voltage were used for the separation． The optimum MS parameters were as follows： 75% methanol containing 0. 3% formic acid with a flow rate of 3 μL / min was selected as the sheath liquid； the flow rate and temperature of drying gas were 6 L / min and 350 ° C，respectively． ESI-MS analysis was performed in the positive mode，and the full scanning range was from m / z 50 to 350． 5-Chlorocytosine arabinoside was used as the internal standard． The results showed that eight investigated compounds had good linearity （ R2 ＞ 0. 990，except guanosine ） over the tested ranges． The average recoveries were between 95. 3% and 104. 6% ． The limit of detection （ LOD） and limit of quantitation （ LOQ） were 0. 13-9. 85 μg / mL and 0. 42-20. 83 μg / mL，respectively． The quantification results showed that the G． lucidum contained higher total amount of nucleosides than G． sinensis． The developed CE-MS method can be applied for the analysis of nucleosides and related compounds in Ganoderma and other traditional Chinese medicines. Key words CE-MS； nucleosides； Ganoderma； determination of content
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学 报 Journal of China Pharmaceutical University
第 42 卷
灵芝为多孔菌科真菌赤芝［（ Ganoderma lucidum （ Leyss. ex Fx. ） Karst） ］或 紫 芝 ［Ganoderma sinense Zhao． Xu et zhang］的干燥子实体。具有补 气安 神、止 咳 平 喘 的 作 用，用 于 眩 晕 不 眠、心 悸 气 短、虚劳 咳 喘［1］。 目 前，多 糖、三 萜 类 及 核 苷 类 成 分被认为是其主要活性成分［2－ 3］。核苷类成分可 以通过 激 活 人 体 中 的 嘌 呤 受 体 起 到 多 种 生 理 作 用［4－ 5］。目前，用于灵芝中核苷类成分的检测方法 主要 有 薄 层 色 谱 法 （ TLC ） ［6］、高 效 液 相 色 谱 法
Agilent 3D CE 系统与 Trap XCT 质谱联用仪配 备 CE-ESI-MS sprayer kit （ G1607A） 和 CE-ESI-MS adapter kit （ G1603A） （ 美国安捷伦科技公司） ； 熔 融石英毛细管柱（ 120 cm × 50 μm，美国 Polymicro Technologies 公司） 。
肌苷之外其他成分均选择了其质子化离子进行定 量（ 见表 1） 。
在此条件下，胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、次黄 嘌呤、鸟苷、肌苷、尿嘧啶及 5-氯胞嘧啶阿拉伯糖 苷的选择离子电泳图见图 2。
Figure 2 Selected ion electropherograms of mix standards（ A） ，Ganoderma lucidum（ B） ，and Ganoderma sinense 1： Cytosine； 2： Guanine； 3： Cytidine； 4： Adenosine； 5： Hypoxanthine； 6： Guanosine； 7： Inosine； 8： Uridine. IS： 5-Chlorocytosine arabinoside
学报
Journal of China Pharmaceutical University 2011，42（ 4） ： 337 － 341
337
毛细管电泳-质谱联用法测定灵芝药材中核苷类成分
杨丰庆1* ，张雪梅1，葛莉亚2，陈瑞银2
（ 1 重庆大学化学化工学院，重庆 400044； 2 新加坡南洋理工大学国立教育学院，新加坡 637616）
This study was supported by the Natural Science Foundation of Chongqing Sci-Tech Committee （ No． 2010BB5070） and the Innovative Talent Training Project，the Third Stage of“211 Project”of Chongqing University （ No． S-09103）
黄嘌呤、鸟苷、肌苷、尿嘧啶以及内标成分 5-氯胞 嘧啶阿拉伯糖苷（ 5-chlorocytosine arabinoside） 均购 自美国 Sigma 公司。甲酸（ 美国 Fisher 科技公司） ； 超纯水为 Milli-Q 水 （ 美国 Millipore 公司） 。灵芝 （ 赤芝和紫芝） 购于安徽、四川、山东及云南。 1. 2 仪 器
YANG Feng-qing1* ，ZHANG Xue-mei1 ，GE Li-ya2 ，TAN Swee Ngin2
1 College of Chemistry and Chemical Engineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China； 2 Natural Sciences and Science Education Academic Group，Nanyang Technological University，Singapore 637616，Singapore
关键词 毛细管电泳-质谱联用法； 核苷； 灵芝； 含量测定 中图分类号 R917 文献标识码 A 文章编号 1000 － 5048（ 2011） 04 － 0337 － 05
Determination of nucleosides and related compounds in Ganoderma by CEMS
摘 要 建立一种用于测定赤芝和紫芝中的核苷类成分的毛细管电泳-质谱联用法（ CE-MS） 。CE 条件为： 熔融石英毛 细管柱（ 120 cm × 50 μm） ，缓冲液体系 100 mmol / L 甲酸-10% 甲醇水溶液。运行电压 25 kV； 毛细管温度 25 ℃ 。MS 条件 为： 0. 3% 甲酸-75% 甲醇水溶液为鞘液，流速 3 μL / min； 干燥气体流速 6 L / min，干燥温度 350 ℃ ； 采用电喷雾离子化源 （ ESI） ，正离子模式检测，全扫描范围 m / z 50 ～ 350。以 5-氯胞嘧啶阿拉伯糖苷为内标物。结果表明，胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、 腺苷、次黄嘌呤、鸟苷、肌苷和尿嘧啶在线性范围内具有较好的线性关系（ 除鸟苷外，其他成分 R2 ＞ 0. 990） 。加样回收率在 95. 3% ～ 104. 6% 之间。各待测化合物的最低检测限（ LOD） 和最低定量限（ LOQ） 分别分布在 0. 13 ～ 9. 85 μg / mL 和 0. 42 ～ 20. 83 μg / mL 之间。测定结果显示赤芝的核苷类成分的含量上高于紫芝。CE-MS 适合用于中药中核苷类成分的分析 检测。
* 收稿日期 2011-03-07 * 通讯作者 Tel / Fax： 023 － 65106615 E-mail： ysfhqx@ hotmail． com 基金项目 重庆市科委自然科学基金资助项目（ No． 2010BB5070） ； 重庆大学 211 工程三期创新人才培养计划建设项目资助（ No． S09103）
电泳 条 件： 熔 融 石 英 毛 细 管 柱 （ 120 cm × 50 μm） ，运行缓冲液为 100 mmol / L 甲酸-10% 甲醇 水溶液。毛细管温度为 25 ℃ 。每次进样前用运行 缓冲液冲洗平衡 5 min，并且每 10 次分析之间，毛 细管用氢氧化钠溶液（ 0. 1 mol / L） 、水及运行缓冲 液分别冲洗 10 min。压力进样（ 5 kPa） ，6 s。
2方法
2. 1 对照品溶液的制备 准确称取对照品胞嘧啶、鸟嘌呤、胞苷、腺苷、
次黄嘌呤、鸟苷、肌苷和尿嘧啶适量，分别置 5 mL 量瓶中，用 水 溶 解 并 定 容，振 摇，制 得 对 照 品 储 备液。 2. 2 供试品溶液的制备
取干燥药材粉末（ 60 目筛） 1 g，精密称定，精 密加沸水 10 mL 后称重，75 ℃ 超声提取 30 min，用 水补足失重，上清液用 0. 25 μm 微孔滤膜滤过，取 续滤液，按照体积比 1 ∶ 1 加入内标溶液（ 5-氯胞嘧 啶阿拉伯糖苷，0. 14 mg / mL） ，即得供试品溶液。 2. 3 CE-MS 条件
（ HPLC） ［6－ 8］及毛细管区带电泳法 （ CZE） ［9－ 10］ / 胶 束电动毛细管色谱 （ MEKC） 。 ［11］ 另外，CE-MS 对 分离不佳甚至完全不能分开的成分进行定性定量 分析具有独特的优势，目前已被用于多种中药中活 性 成 分 的 分 析 检 测，包 括 生 物 碱、甾 体 激 素等［12－ 13］。